李婷婷， 張亞龍， 高建梅， 賀軍棟1, ， 嚴(yán)新民△

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650504；2云南省第一人民醫(yī)院，云南省臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，云南省出生缺陷與遺傳病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032)

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云南省傣族、漢族人群乙型肝炎病毒感染與IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C的關(guān)聯(lián)性研究*

李婷婷1, 2▲， 張亞龍1, 2▲， 高建梅2， 賀軍棟1, 2， 嚴(yán)新民2△

(1昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650504；2云南省第一人民醫(yī)院，云南省臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，云南省出生缺陷與遺傳病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032)

目的： 探討云南省西雙版納地區(qū)傣族和漢族人群IL-6 -572C/G 和I型干擾素受體1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1) -168G/C位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與乙型肝炎病毒(HBV)感染后疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性。方法:采集西雙版納州傣族、漢族人群血液樣本共600份，其中每個(gè)民族包括健康對(duì)照組100名、HBV感染患者200名(含100名自限性恢復(fù)患者和100名慢性乙肝患者)，運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。結(jié)果:傣族人群中，-572C/G位點(diǎn)基因型多態(tài)性與HBV感染后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性并無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。C、G等位基因型在HBV感染組、正常對(duì)照組之間和慢性乙肝組、自限恢復(fù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。但是在G顯性模式(GG+CG/CC)下，GG+CG基因型為HBV感染者發(fā)展成為慢性乙型肝炎患者的保護(hù)因素(P<0.05)。漢族人群中，-572C/G位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率在各組比較中無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且在G顯性模式和G隱性模式比較中也無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在上述4種比較中，IFNAR1 -168G/C位點(diǎn)在漢族和傣族樣本中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 。結(jié)論:IL-6 -572C/G位點(diǎn)GG+CG基因型可能是傣族人群中HBV感染者發(fā)展成為慢性乙型肝炎的保護(hù)因素，而IFNAR1 -168G/C多態(tài)性與HBV感染后轉(zhuǎn)歸在傣、漢兩族中并無顯著性關(guān)聯(lián)。

IL-6； 干擾素α受體1；基因多態(tài)性； 乙型肝炎病毒

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種常見的流行性感染病毒，在中國(guó)人群中感染率約占10%，因此對(duì)HBV的研究是一個(gè)亟需深入探索的課題。人體內(nèi)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子位點(diǎn)上多態(tài)性的差異會(huì)影響其產(chǎn)量的高低，使宿主對(duì)HBV的免疫清除和殺傷效果差別較大，繼而導(dǎo)致個(gè)體轉(zhuǎn)歸的差異[1]。白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)位于染色體7p21處，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)顯子及1個(gè)接近啟動(dòng)子區(qū)域的序列組成[2]，是一種多功能性的免疫因子，在調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化過程中扮演重要的作用。此外IL-6作為診斷肝癌的分子標(biāo)記之一，而通常常見的肝癌發(fā)生是由于HBV感染的繼續(xù)惡化而轉(zhuǎn)歸所致[3]。IL-6基因多態(tài)性會(huì)影響IL-6 mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致宿主體內(nèi)IL-6產(chǎn)量的不同，繼而對(duì)HBV病毒的清除產(chǎn)生差別。干擾素α受體1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1)是定位于21號(hào)染色體上的干擾素α受體的亞單位，其產(chǎn)物能特異性地與干擾素α結(jié)合[4-5]，從而使體內(nèi)產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制乙肝病毒的復(fù)制。本文挑選的這2個(gè)細(xì)胞因子與機(jī)體免疫關(guān)聯(lián)很大，其產(chǎn)物能有助于對(duì)乙肝病毒的清除，影響患者疾病的轉(zhuǎn)歸。我們選取的是西雙版納地區(qū)傣族和漢族人群作為研究對(duì)象，運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)和測(cè)序驗(yàn)證對(duì)IL-6-572C/G、IFNAR1-168G/C位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并從流行遺傳病學(xué)的角度探討基因結(jié)構(gòu)與HBV感染轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

在知情同意的原則下，收集西雙版納州醫(yī)院漢族和傣族住院及門診乙肝感染患者和健康對(duì)照血樣各300份，其中漢族和傣族患者血樣各200份(自限性恢復(fù)組與慢性乙肝組各100人)，漢族和傣族健康對(duì)照組各100份。收集的血樣已確保3代以內(nèi)無族外通婚，并且診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)會(huì)及中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)修訂的《中國(guó)慢乙肝防治指南》分為正常對(duì)照組和乙肝病毒感染組，其中乙肝病毒感染組又可以根據(jù)病情的轉(zhuǎn)歸情況分為自限性恢復(fù)組和慢性乙型肝炎組，各組無其他疾病交叉感染記錄，研究對(duì)象的年齡、性別及肝功能指標(biāo)分布見表1。

表1 研究對(duì)象年齡、性別及肝功能指標(biāo)分布

TP other: TP<60 g/L and TP>80g/L; GLO other: GLO<20 g/L and GLO>35 g/L; ALT unit: U/L; AST unit：U/L.

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 用Gene Tool軟件設(shè)計(jì)引物并交與上海捷銳公司合成，引物序列見表2。

表2 SNP位點(diǎn)的PCR引物序列及反應(yīng)條件

2.2 IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168C/G位點(diǎn)多態(tài)性分析 采用Sangon柱式基因組抽提試劑盒提取基因組DNA作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為TaKaRa 2×Mix混合液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL， DNA 1 μL，補(bǔ)足ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)完成后分別用的BsrB I和DdeI 37 ℃水浴酶切2 h處理。酶切體系為：9 μL ddH2O， TaKaRa 10×Smart Buffer 1.5 μL，BsrB I (DdeI) 0.5 μL， PCR DNA 4 μL。隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳儀設(shè)定為120 V，25 min，膠濃度為1.5%，于凝膠成像儀觀察結(jié)果，隨機(jī)選取10%的樣本，采用ABI 3130測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證酶切結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 PCR-RFLP結(jié)果

IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C2個(gè)位點(diǎn)的3種基因型均有檢出，見圖1、2。

Figure 1.The cleavage map for the IL-6-572C/G site of the samples.M:marker.

圖1 樣本IL-6 -572C/G位點(diǎn)酶切圖

Figure 2.The cleavage map for the IFNAR1-168G/C site of the samples.M:marker.

圖2 樣本IFNAR1-168G/C位點(diǎn)酶切圖

2 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

IL-6 -572C/G位點(diǎn)多態(tài)性測(cè)序結(jié)果為GG/CG/CC(圖3)；IFNAR1-168G/C位點(diǎn)多態(tài)性測(cè)序結(jié)果為GG/GC/CC(圖4)。

Figure 3.The sequencing results for IL-6 -572C/G site. A: GG; B: CG; C: CC.

圖3 IL6-572C/G位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

Figure 4.The sequencing results for IFNAR1-168G/C site. A: GG; B: GC; C: CC

圖4 IFNAR1 -168G/C位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

3 基因多態(tài)性分析結(jié)果

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，樣本中這2個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，樣本具備代表性。本研究分為基因型頻率、等位基因分布頻率、隱性基因的顯性模式和隱性模式這4種分析方式在正常對(duì)照組、HBV感染組及慢性乙型肝炎組、自限性恢復(fù)組間進(jìn)行比較，探尋差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。由表3得知，傣族人群中，-572C/G位點(diǎn)基因型多態(tài)性與HBV感染后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)性并無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。C、G等位基因型在正常對(duì)照組、HBV感染組及慢性乙肝組、自限性恢復(fù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(表4)。在G顯性模式(GG+CG/CC)下，基因型GG+CG為傣族HBV感染者發(fā)展成為慢性乙肝的保護(hù)因素(P<0.05)，見表5。漢族人群中，-572C/G位點(diǎn)基因型、等位基因分布頻率在各組比較中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且在G顯性模式和G隱性模式比較中差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在上述4種比較中，IFNAR1-168G/C位點(diǎn)在漢族和傣族樣本中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。綜上得出， GG+CG基因型為保護(hù)性因素，會(huì)降低傣族人群HBV感染后發(fā)展成為慢性乙型肝炎的風(fēng)險(xiǎn)，GG+CG基因型可能是傣族HBV感染人群發(fā)展成為慢性乙肝的保護(hù)性因素。

表3 傣族和漢族人群中IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率

Group A: healthy control group; Group B: HBV infection group; Group C: spontaneous recovery group; Group D: chronic hepatitis B group.

表4 傣族和漢族人群中IL-6 -572C/G和IFNAR1 -168G/C位點(diǎn)等位基因分布頻率的比較

Group A: healthy control group; Group B: HBV infection group; Group C: spontaneous recovery group; Group D: chronic hepatitis B group.

表5 傣族和漢族人群中IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位點(diǎn)的非條件logistic回歸模型分析

討 論

目前，單核苷酸多態(tài)性與HBV感染后轉(zhuǎn)歸的研究受到重視，相關(guān)的細(xì)胞因子多態(tài)性與HBV感染轉(zhuǎn)歸的研究基本已經(jīng)涵蓋了已知的多數(shù)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-6[3]、IL-10[6]、IL-28B[7]、TNF-α[8]、TGF-β[9]等。HBV進(jìn)入機(jī)體受到T淋巴系統(tǒng)介導(dǎo)的對(duì)乙肝病毒的清除作用。在急性感染者中，T細(xì)胞比較活躍，能夠迅速清除機(jī)體內(nèi)的HBV病毒；而在慢性感染者中，T細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體反應(yīng)較弱，對(duì)病毒的清除作用有限，故而使病人持續(xù)感染而導(dǎo)致肝損害。此外，乙肝病毒還受到機(jī)體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的一系列免疫蛋白的殺傷效應(yīng)，而其產(chǎn)量的高低受到啟動(dòng)子區(qū)域特定位點(diǎn)的調(diào)控，因而對(duì)于該區(qū)域多態(tài)性的研究也是學(xué)者研究的重點(diǎn)。

HBV感染后轉(zhuǎn)歸的差異與人群有關(guān)，我們選取的研究對(duì)象是處于云南地區(qū)西雙版納傣族自治州醫(yī)院的樣本，由于地處邊疆、交通不便，傣族與其他民族語言、飲食和宗教信仰的差異，很少與其他民族通婚，形成了相對(duì)的種族隔離，因此可以作為一個(gè)很好的樣本來與漢族進(jìn)行基因多態(tài)性與HBV感染差異性的研究。IL-6-572C/G基因多態(tài)性與HBV感染后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)在不同民族和地域的人群中差別較大，Lu等[10]以自限性恢復(fù)人群和慢性乙肝人群為樣本，得出-572C/G中GG基因型和G等位基因有助于HBV病毒的清除；而Tang等[11]研究得出，-572C/G多態(tài)性位點(diǎn)與慢性乙肝疾病的感染并無顯著的聯(lián)系。本文研究得出，在西雙版納州的傣族人群中，在基因型和等位基因分布上，-572C/G位點(diǎn)的多態(tài)性與HBV感染后轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在G顯性模式(GG+CG/CC)下，自限性恢復(fù)組和慢性乙肝組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，GG+CG基因型人群中慢性乙型肝炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于CC基因型人群，研究結(jié)果與Lu等[10]相同。

IFNAR1 -168G/C多態(tài)性在4號(hào)外顯子區(qū)域會(huì)發(fā)生Val(GTT)→Leu(CTT)轉(zhuǎn)變，繼而影響雌二醇羧化酶的活性[12]，雌二醇能抑制慢性HBV患者向原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)歸，表現(xiàn)出雌二醇能抑制HBV的進(jìn)一步發(fā)展[13]。Song等[14]在正常對(duì)照組、HBV感染組中(無癥狀感染組、急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組和肝癌組)比較得出顯著性差異，正常組中會(huì)有較高頻率的GTT基因型和較低的ALT濃度。但是我們研究得出，IFNAR1-168G/C突變?cè)诟鲗?duì)照組中并無顯著性差異，這可能與我們選取的人種遺傳背景的差異相關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，IFNAR1-168G/C在傣族和漢族人群中，等位基因頻率分布、基因型頻率和C顯性模式和C隱性模式并無顯著性差異。

綜上所述，通過對(duì)IL-6-572C/G和IFNAR1-168G/C位點(diǎn)與傣、漢兩民族人群HBV感染后轉(zhuǎn)歸的研究發(fā)現(xiàn)，雖然在基因型和等位基因分布頻率上，IL-6-572C/G與傣族人群HBV感染后轉(zhuǎn)歸并無顯著性關(guān)聯(lián)，但是在G顯性模式分布中表明IL-6-572C/G突變中GG+CG基因型會(huì)減少傣族人群中HBV感染者發(fā)展成為慢性肝炎的風(fēng)險(xiǎn)，是一個(gè)保護(hù)因素；而IFNAR1-168G/C位點(diǎn)在傣族和漢族人群中在各組比較中分布頻率并無顯著性差異。臨床應(yīng)用方面，通過采集長(zhǎng)期注射恩替卡韋等核苷類藥物的HBV感染人群的血液，根據(jù)患者病情發(fā)展來驗(yàn)證攜帶IL-6-C/G位點(diǎn)GG+CG基因型的患者是否有助于其康復(fù)，進(jìn)而預(yù)測(cè)所使用藥物的治療情況，并希望能夠?yàn)榛颊咛峁┘皶r(shí)的防治措施[15]，這也是我們工作的下一步目標(biāo)。

[1] He XX, Chang Y, Jiang HJ, et al. Persistent effect of IFNAR-1 genetic polymorphism on the long-term pathogenesis of chronic HBV infection[J]. Viral Immunol,2010,23(3):251-257.

[2] Georges JL, Loukaci V, Poirier O, et al. Interleukin-6 gene polymorphisms and susceptibility to myocardial infarction: the ECTIM study[J]. J Mol Med (Berl), 2001, 79(5-6):300-305.

[3] Tang S, Yuan Y, He Y, et al. Genetic polymorphism of interleukin-6 influences susceptibility to HBV-related hepatocellular carcinoma in a male Chinese Han population[J]. Hum Immunol,2014,75(4):297-301.

[4] Kim SH, Cohen B, Novick D, et al. Mammalian type I interferon Receptors consists of two subunits: IFNaR1 and IFNaR2[J]. Gene, 1997, 196(1-2): 279-286.

[5] Orchansky P, Novick D, Fischer DG, et al. Type I and type II interferon receptors[J]. J Interferon Res, 1984, 4(2):275-282.

[6] Shu C, Wang JC, He YZ, et al. Effects of interleukin 10 polymorphisms on the development of hepatitis B virus infection: a systemic review and meta-analysis[J]. Int J Clin Exp Med, 2015，8(8): 12028-12040.

[7] Li W， Jiang Y， Jin Q, et al.Expression and gene polymorphisms of interleukin 28B and hepatitis B virus infection in a Chinese Han population[J].Liver Int, 2011, 31(8):1118-1126.

[8] Jin YJ, Lee D, Chung YH, et al. Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism associated with development of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Gastroenterol, 2015,49(8):e76-e81.

[9] Mohy A, Fouad A. Role of transforming growth factor-β1 in serum and -509 C>T promoter gene polymorphism in development of liver cirrhosis in Egyptian patients[J]. Meta Gene, 2014, 2: 631-637.

[10]Lu Y, Peng J, Wang C, et al. IL-6 promoter functional polymorphism-572C/G affects spontaneous clearance of hepatitis B virus infection[J]. Clin Lab, 2014, 60(11): 1903-1907.

[11]Tang S, Liu Z, Zhang Y, et al. Rather than Rs1800796 polymorphism, expression of interleukin-6 is associated with disease progression of chronic HBV infection in a Chinese Han population[J]. Dis Markers, 2013, 35(6):799-805.

[12]Tang YM, Green BL, Chen GF, et al. Human CYP1B1 Leu432Val gene polymorphism: ethnic distribution in African-Americans, Caucasians and Chinese; oestradiol hydroxylase activity and distribution in prostate cancer cases and controls[J]. Pharmacogenetics, 2000, 10(9):761-766.

[13]Yu MW, Yang YC, Yang SY, et al. Hormonal markers and hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma risk: a nested case-control study among men[J]. J Natl Cancer Inst, 2001, 93(21):1644-1651.

[14]Song le H, Xuan NT, Toan NL, et al. Association of two variants of the interferon-alpha receptor-1 gene with the presentation of hepatitis B virus infection[J]. Eur Cytokine Netw, 2008, 19(4):204-210.

[15]張亞龍， 高建梅， 嚴(yán)新民. 多種免疫相關(guān)的細(xì)胞因子基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)性的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2015, 9(27):1174-1180.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Association between IL-6 -572C/G as well as IFNAR1 -168G/C and hepatitis B virus infection in populations of Dai and Han ethnicities in Yunnan Province

LI Ting-ting1, 2, ZHANG Ya-long1, 2, GAO Jian-mei2, HE Jun-dong1, 2, YAN Xin-min2

(1CollegeofMedicine,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650504,China;2YunnanInstituteofBasicMedicalSciences,ProvincialKeyLaboratoryforBirthDefectsandGeneticDiseases,TheFirstPeople’sHospitalofYunnanProvince,Kunming650032,China.E-mail:yxmin08@163.com)

AIM: To explore the association between IL-6 -572C/G (rs1800796) as well as interferon alpha receptor 1 (IFNAR1) -168G/C (rs2257167) and prognosis after hepatitis B virus (HBV) infection in populations of Dai and Han ethnicities in Yunnan Province. METHODS: The blood samples were collected from Dai people and Han people, each nation including 100 healthy controls and 200 infected individuals (100 spontaneous recovery individuals and 100 chronic patients). Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and DNA sequencing were used to identify the gene type. RESULTS: In Dai people, no significant difference was found between genetic polymorphism of -572C/G and prognosis after HBV infection. The differences of C and G alleles between spontaneous recovery group and chronic hepatitis B group, and healthy controls and HBV infection group were not statistically significant. Meanwhile, GG and CG genotypes were a vital protective factor for the person who developed into a chronic heptatitis B patient under the G allele dominance mode (GG+CG/CC) (P<0.05). In Han people, no statistically significance for IL-6 -572C/G genotype and allele distribution in each group comparisons had been found, as well as the C allele recessive mode and C allele dominance mode. For the above 4 indicators, no statistically significant difference of IFNAR1 -168C/G in Dai and Han people had been found. CONCLUSION: The GG+CG genotype of IL-6 -572C/G may be a protective factor for the HBV-infected Dai people to develop into chronic hepatitis B patients. However, there is no significant association between the IFNAR1 -168G/C polymorphism and prognosis after HBV infection in the 2 ethnicities.

IL-6; Interferon alpha receptor 1; Genetic polymorphism; Hepatitis B virus

1000- 4718(2016)11- 2056- 06

2016- 06- 15

2016- 09- 01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81360398)；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃(No. 2014N269)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(No. 2015J021);云南省科技計(jì)劃(No. 2013FB200)

R363

A

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