黃文舟， 王麗麗， 殷嫦嫦， 李 健， 敖 鵬， 程細(xì)高△

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌330006； 2九江學(xué)院/九江市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332000)

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晚期糖基化終末產(chǎn)物通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞損傷*

黃文舟1， 王麗麗2， 殷嫦嫦2， 李 健1， 敖 鵬1， 程細(xì)高1△

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌330006；2九江學(xué)院/九江市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332000)

目的：探討晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)能否通過氧化應(yīng)激引起大鼠軟骨細(xì)胞損傷。方法:原代培養(yǎng)SD大鼠軟骨細(xì)胞，對細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定；應(yīng)用CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞生存率；DCFH-DA染色熒光顯微鏡下檢測胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平；Hoechst 33342 核染色法及Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞法測定軟骨細(xì)胞的凋亡率；RT-PCR法檢測軟骨細(xì)胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP3、MMP13和COL2的mRNA水平；Western blotting法檢測軟骨細(xì)胞中cleaved caspase-3、MMP3、MMP13和COL2的蛋白水平。結(jié)果:與對照組相比，AGEs可顯著上調(diào)胞內(nèi)ROS水平(P<0.05)，但經(jīng)抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制后ROS的生成明顯減少(P<0.05)；另外，NAC可抑制AGEs引起的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Bax/Bcl-2和caspase-3水平的上調(diào)，并減少M(fèi)MP3和MMP13表達(dá)及COL2的丟失(P<0.05)。結(jié)論:AGEs可通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞損傷。

晚期糖基化終末產(chǎn)物； 骨性關(guān)節(jié)炎； 氧化應(yīng)激； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 細(xì)胞凋亡

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯耐诵行约膊?。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞(chondrocyte)和軟骨基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成，其中軟骨細(xì)胞對維持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性具有重要作用[1]。正常情況下，軟骨細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解一直處于動態(tài)平衡。OA中，軟骨細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致OA的直接原因。此外，軟骨細(xì)胞分泌蛋白水解酶增加，通過對Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，打破了這種動態(tài)平衡，引起關(guān)節(jié)軟骨完整性的破壞，最終促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎的形成[2]。 OA是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，其主要與衰老、肥胖程度、機(jī)械因素及基因表達(dá)遺傳因素等有關(guān)，其中衰老是導(dǎo)致OA的主要原因[3]。 氧化應(yīng)激與衰老所致的骨性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)[4]。然而，衰老引起氧化應(yīng)激所導(dǎo)致OA發(fā)病的原因尚不明確。近來，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)被認(rèn)為是衰老致OA患病的分子學(xué)基礎(chǔ)[5]。AGEs主要通過引起軟骨基質(zhì)降解與軟骨細(xì)胞凋亡[6-7]、促進(jìn)軟骨組織的炎癥反應(yīng)等[8]方式在OA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究通過研究AGEs 促進(jìn)氧化應(yīng)激對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷的作用，探討AGEs在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的作用，對早期預(yù)防及治療OA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物及材料

SPF級雄性SD大鼠，4周齡，體重約40 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號為SCXK(湘)2014-0004。AGE-BSA(Calbiochem)；胰蛋白酶、胎牛血清及DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)；Ⅱ型膠原酶、蘇木素染液、甲苯胺藍(lán)染液和Alcian Blue 8GX(Solarbio)；Hoechst 33342染色液、活性氧檢測試劑盒和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購自Beyotime；小鼠IgG免疫組化試劑盒和DAB顯色液(Boster)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(MultiSciences Biotech)；蛋白提取試劑盒(Applygen)；CCK-8試劑盒和GREENspin細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒(Zomanbio)；HiFiScript 快速去基因組cDNA 第1鏈合成試劑盒、DNA Ladder2000及高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Cwbio)；2× Taq Master Mix(Sinobio)；抗cleaved caspase-3抗體(CST)；抗MMP3和抗MMP13抗體(Novus)；抗Ⅱ型膠原和抗GAPDH抗體(Abcam)；山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(Proteintech)；所用引物由上海生工合成，見表1。

2 方法

2.1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定 取4周齡SPF級大鼠，頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡30 min，消毒后無菌操作分離股骨頸、股骨踝和脛骨平臺，取關(guān)節(jié)軟骨并剪碎收集于離心管中，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴消化30 min，離心去除液體，加入0.2% II型膠原酶37 ℃水浴振蕩消化3 h，離心收集細(xì)胞，含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打重懸混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每3～4 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿瓶底80% 以上，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1∶2培養(yǎng)傳代。取第3代細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁以后進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色、甲苯胺藍(lán)染色和阿爾新藍(lán)染色。

表1 引物序列

2.2 AGEs對大鼠軟骨細(xì)胞生存率的影響 取第3代軟骨細(xì)胞，以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；吸除培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度AGEs的DMEM培養(yǎng)基(不含胎牛血清)100 μL，藥物濃度分別為0、10、25、50、100、200 mg/L。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h及48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。計(jì)算每組藥物濃度組吸光值的平均值，分別與空白對照組比較。

2.3 細(xì)胞分組及處理 取第3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組如下：空白對照(control)組：只加DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)軟骨細(xì)胞24 h；AGEs組：含AGEs的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h；AGEs+NAC組：先用含5 mmol/L NAC的DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理軟骨細(xì)胞2 h，再換用含5 mmol/L NAC的AGEs的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h；NAC組：用含5 mmol/L NAC的DMEM培養(yǎng)基處理軟骨細(xì)胞24 h。

2.4 DCFH-DA染色測定細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平 將軟骨細(xì)胞接種于24孔板，按不同濃度(0、25、50、100、200 mg/L)AGEs、AGEs+NAC和NAC分組，去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，再用10 μmol /L DCFH-DA染液于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片。

2.5 Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞凋亡 將軟骨細(xì)胞接種于24孔板，按上述分組進(jìn)行處理后，去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，加入Hoechst 33342試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，后用PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞,鑒別正常與凋亡的軟骨細(xì)胞并攝片，隨機(jī)取不同視野計(jì)算細(xì)胞凋亡率，重復(fù)5次。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞凋亡率 將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，按上述分組進(jìn)行處理后，常規(guī)消化離心收集各組細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)細(xì)胞，PBS漂洗后將細(xì)胞重懸于500 μL 1×binding buffer中; 加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)；輕柔混勻后，室溫避光孵育5 min；應(yīng)用BD 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.7 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3， MMP3)、MMP13和COL2的mRNA表達(dá)量 將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，按上述分組進(jìn)行處理后，使用GREENspin細(xì)胞RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。按2×Taq Master Mix說明進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，模板cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 90 s; 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min,32個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳15 min左右，SIM凝膠成像系統(tǒng)拍照并用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以GAPDH作內(nèi)參照。

2.8 Western blotting法檢測cleaved caspase-3、MMP3、MMP13及COL2的蛋白水平 將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，按上述分組進(jìn)行處理后，按總蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度。加入4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液95 ℃水浴5 min 變性。每組蛋白上樣量為30 μg，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳；然后用濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上；將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST 中室溫封閉2 h；分別加入GAPDH(1∶5 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、MMP3(1∶1 000)、MMP13(1∶4 000)和COL2(1∶1 000)的I抗工作液室溫孵育2 h，1×TBST漂洗 5 min 3次；用辣根過氧化物酶標(biāo)記的II 抗(1∶5 000) 室溫孵育2 h；漂洗后ECL發(fā)光液顯色。試劑盒進(jìn)行曝光、顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 軟骨細(xì)胞的鑒定

分離培養(yǎng)的SD大鼠軟骨細(xì)胞貼壁生長，外觀呈三角形或多角形。甲苯胺藍(lán)染色使正常軟骨細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色。軟骨細(xì)胞經(jīng)阿爾新藍(lán)染色后，可見細(xì)胞質(zhì)染成淡藍(lán)色。Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見細(xì)胞質(zhì)呈黃色，細(xì)胞核周圍散在棕黃色的顆粒，見圖1。

Figure 1. The morphological presentation of rat chondrocytes (×100). A: under phase-contrast microscope; B: toluidine blue staining; C: Alcian blue staining; D: immunocytochemical staining for type II collagen.

圖1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2 CCK-8法測定軟骨細(xì)胞的存活率

AGEs(0、10、25 mg/L)處理軟骨細(xì)胞24 h及48 h后均不影響細(xì)胞存活率，但AGEs(50、100、200 mg/L)處理軟骨細(xì)胞24 h或48 h后均能顯著降低軟骨細(xì)胞存活率(P<0.05)。根據(jù)上述結(jié)果，后續(xù)采用100 mg/L AGEs處理軟骨細(xì)胞24 h進(jìn)行研究，見圖2。

Figure 2. Dose- and time-dependent effects of AGEs on the cell viability of rat chondrocytes detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖2 AGEs引起軟骨細(xì)胞毒性

3 AGEs引起的軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激

不同濃度AGEs處理軟骨細(xì)胞24 h，可見25、50、100、200 mg/L濃度的AGEs均能使細(xì)胞內(nèi)DCF的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)明顯增強(qiáng)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。此外，NAC與100 mg/L AGEs 共培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞與100 mg/L AGEs組相比，MFI明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. AGEs induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the chondrocytes (×200). MFI: mean fluorescence intensity．Mean±SD．n=5．*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNAC group;△P<0.05vsAGEs 100 mg/L group.

圖3 AGEs引起軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)

4 AGEs通過氧化應(yīng)激引起軟骨細(xì)胞凋亡

熒光顯微鏡下可見Hoechst染色空白對照組、NAC組中軟骨細(xì)胞核染色分布均勻，呈彌散均勻的低密度熒光。AGEs組中細(xì)胞核呈致密濃染的凋亡特征的軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，與control、NAC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。而AGEs+NAC組中，抗氧化劑NAC與AGEs共培養(yǎng)24 h的軟骨細(xì)胞凋亡較AGEs組明顯減少(P<0.05)，見圖4A。

此外，通過Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，AGEs處理軟骨細(xì)胞24 h后凋亡率增至(18.90±2.82)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。而NAC與AGEs共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞24 h時(shí)，軟骨細(xì)胞凋亡率下降至(8.23±1.66)%，與單獨(dú)AGEs處理軟骨細(xì)胞組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4B。

AGEs處理軟骨細(xì)胞24 h 可顯著增加Bax/Bcl-2 及caspase-3的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，而NAC與AGEs共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞24 h 能抑制AGEs引起的Bax/Bcl-2及caspase-3的mRNA表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)，見圖4C。

Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)量， AGEs可促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3的增加(P<0.05)，而NAC可抑制AGEs引起的cleaved caspase-3的蛋白水平上調(diào)(P<0.05)，見圖4D。

5 AGEs通過氧化應(yīng)激對軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及Ⅱ型膠原的影響

AGEs作用下，與對照組相比，MMP3及MMP13的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)，而COL2的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)。NAC預(yù)處理后與AGEs共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，能顯著抑制MMP3和MMP13的mRNA表達(dá)量并提高COL2的mRNA表達(dá)量(P<0.05)，見圖5A。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，AGEs可促進(jìn)軟骨細(xì)胞表達(dá)MMP3及MMP13，并降低COL2的蛋白水平(P<0.05)，而NAC可抑制MMP3、MMP13的蛋白水平并提高COL2的蛋白水平(P<0.05)，見圖5B。

Figure 4.NAC reduced AGEs-induced apoptosis of chondrocytes. A: the changes of apoptotic cells detected by Hoechst 33342 nuclear staining (×400); B: flow cytometry analysis of the apoptosis in chondrocytes; C: the mRNA levels of Bax, Bcl-2 and caspase-3 measured by RT-PCR; D: the protein level of cleaved caspase-3 measured by Western blotting. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNAC group;△P<0.05vsAGEs group.

圖4 AGEs通過氧化應(yīng)激引起軟骨細(xì)胞凋亡

Figure 5.The effects of NAC on the expression of MMP3, MMP13 and COL2 in the chondrocytes induced by AGEs. A: the mRNA levels of MMP3, MMP13 and COL2 measured by RT-PCR; B: the protein levels of MMP3, MMP13 and COL2 measured by Western blotting. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNAC group;△P<0.05vsAGEs group.

圖5 AGEs通過氧化應(yīng)激上調(diào)軟骨細(xì)胞中MMP3和MMP13表達(dá)，下調(diào)COL-2表達(dá)

討 論

AGEs是還原糖(葡萄糖)與蛋白、脂質(zhì)經(jīng)過一系列非酶糖基化反應(yīng)(即Maillard 反應(yīng))形成的不可逆性終末期產(chǎn)物[5]，常沉積于關(guān)節(jié)軟骨、皮膚膠原組織及心包液中[9]。正常情況下，體內(nèi)AGEs的水平維持在一個(gè)較為平衡的狀態(tài)，糖尿病、衰老或飲食攝入高溫處理的食物都將引起體內(nèi)AGEs水平明顯升高，后產(chǎn)生一系列病理生理改變。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅱ型膠原及蛋白聚糖組成，其生物半衰期較長，更易發(fā)生非酶糖基化。AGEs形成使得膠原分子間相互交聯(lián)增多，導(dǎo)致膠原彈性下降，引起軟骨結(jié)構(gòu)及功能的改變[10]。研究表明，關(guān)節(jié)軟骨退變病人的正常軟骨中AGEs含量明顯升高[11]。動物實(shí)驗(yàn)研究同樣發(fā)現(xiàn)，15個(gè)月小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中的AGEs含量明顯高于2個(gè)月的小鼠[12]。

軟骨細(xì)胞在維持軟骨形態(tài)和功能方面發(fā)揮重要作用，軟骨基質(zhì)的合成與更新主要依靠軟骨細(xì)胞[13]。軟骨細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行性減少，使細(xì)胞外基質(zhì)合成減少、破壞增加是導(dǎo)致OA的重要原因。因此，軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量與OA的程度密切相關(guān)。衰老引起的線粒體功能損害導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡在OA發(fā)病中起關(guān)鍵作用[14]。 而線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS及活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)大量產(chǎn)生[15]。線粒體功能損害時(shí)，線粒體Ca2+內(nèi)流增加一方面可促進(jìn)ROS的形成，另一方面可降低線粒體膜電位引起 ATP合成的功能障礙，這樣又導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流及ROS的進(jìn)一步增加。線粒體途徑引起的細(xì)胞凋亡可引起線粒體膜上多種凋亡相關(guān)蛋白因子表達(dá)。Bcl-2 是抗細(xì)胞凋亡因子，Bax 是促細(xì)胞凋亡因子，Bax/Bcl-2這對作用相反的細(xì)胞凋亡因子共同激活其下游的一系列凋亡因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡[16]。此外，caspase-3是引起細(xì)胞凋亡過程的核心效應(yīng)器，無活性前體的procaspase-3被激活生成活性片段cleaved caspase-3被看作是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志之一[17]。在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)AGEs可通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，這與Yang等[7]研究結(jié)果一致。

正常軟骨基質(zhì)合成及降解處于動態(tài)平衡，當(dāng)軟骨受損后，基質(zhì)金屬蛋白酶的增多對Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，打破了這種平衡，細(xì)胞外基質(zhì)大量降解可引起關(guān)節(jié)軟骨完整性的破壞。研究顯示，髖關(guān)節(jié)退變患者血清MMP3的濃度比正常人升高[18]。此外， MMP13被認(rèn)為是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)展中最重要的膠原蛋白酶。因?yàn)椋琈MP13對Ⅱ型膠原蛋白的水解能力是其他MMPs的5～10倍，并且在OA發(fā)病時(shí)，MMP13可表達(dá)于更深層的軟骨中[19]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能損害時(shí)可通過ROS上調(diào)引起MMPs增加[20]，尤其可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞MMP3和MMP13的表達(dá)上調(diào)[21]。 此前，已有學(xué)者對AGEs引起軟骨細(xì)胞MMPs表達(dá)上調(diào)作出研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可顯著提高軟骨細(xì)胞中MMP-1、-3、-13的表達(dá)量[22]。本次研究通過RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)AGEs可引起MMP3和MMP13表達(dá)上調(diào)，繼而影響Ⅱ型膠原的表達(dá)下降。而將抗氧化劑NAC作用于AGEs誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞時(shí)可逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象，證明AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞MMP3和MMP13上調(diào)與氧化應(yīng)激有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Advanced glycation end products induce rat chondrocyte injury by modulating oxidative stress

HUANG Wen-zhou1, WANG Li-li2, YIN Chang-chang2, LI Jian1, AO Peng1, CHENG Xi-gao1

(1DepartmentofOrthopedics,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China;2JiujiangUniversity,KeyLaboratoryofMedicalTransformationofJiujiang,Jiujiang332000,China.E-mail: 228206846@qq.com)

AIM: To explore the possibility that advanced glycation end products (AGEs) induces rat chondrocyte injury by modulating oxidative stress. METHODS: Primarily cultured rat chondrocytes were identified. The viability of the chondrocytes was measured by CCK-8 assay. The intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) were detected by DCFH-DA staining. The number of apoptotic cells was determined by Hoechst 33342 nuclear staining and flow cytometry. RT-PCR was performed to measure the mRNA levels of Bax, Bcl-2, caspase-3, MMP3, MMP13 and COL2 in the chondrocytes. Western blotting was used to evaluate the protein levels of cleaved caspase-3, MMP3, MMP13 and COL2. RESULTS: Compared with control group, the intracellular levels of ROS in the chondrocytes treated with AGEs were significantly increased (P<0.05), and pretreatment withN-acetyl-L-cysteine (NAC) suppressed the formation of ROS (P<0.05). Besides, NAC inhibited AGEs-induced apoptosis of the chondrocytes, as indicated by reduceing the levels of Bax/Bcl-2 and caspase-3, decreased the expression of MMP3 and MMP13, and reduced the loss of COL2. CONCLUSION: AGEs induce chondrocyte injury by activating oxidative stress.

Advanced glycation end products; Osteoarthritis; Oxidative stress; Matrix metalloproteinases; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 2036- 07

2016- 05- 26

2016- 09- 13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81060147)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.020

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