陳軍 夏武杰 薛楊靜 胡建堅

●論 著

黃芪甲苷對3，4苯并芘介導內皮祖細胞損傷的保護作用及機制

陳軍 夏武杰 薛楊靜 胡建堅

目的 觀察黃芪甲苷對3，4苯并芘（BaP）介導內皮祖細胞（EPCs）損傷的保護作用并探討其機制。方法 采用密度梯度離心法收集人臍血單個核細胞，貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)EPCs，消化收集第4代細胞，隨機分為5組，正常對照組：不作任何處理；Bap組：予BaP，濃度為20μmol/L；3種濃度黃芪甲苷各組（先加入濃度分別為2、10、50μg/ml的黃芪甲苷，2h后再加入濃度為20μmol/L的Bap）。分別采用細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測細胞增殖能力，黏附能力測定實驗檢測細胞黏附能力，transwell小室檢測細胞遷移能力。取各組細胞培養(yǎng)上清液檢測其超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量，免疫熒光染色檢測各組細胞活性氧（ROS）的表達。結果 與正常對照組相比，BaP組細胞的增殖、黏附以及遷移能力均明顯降低（均P＜0.01），黃芪甲苷預保護可呈濃度依賴性地提高EPCs增殖、黏附及遷移能力（均P＜0.05）；BaP組培養(yǎng)上清液中MDA含量與正常對照組相比明顯升高（P＜0.01），SOD含量明顯下降（P＜0.01），ROS表達明顯上升（P＜0.01），不同濃度的黃芪甲苷可降低培養(yǎng)上清液中MDA含量（P＜0.05），提高SOD含量（P＜0.05），并且呈濃度依賴性地降低細胞ROS表達（P＜0.01）。結論 黃芪甲苷對BaP介導的EPCs損傷具有保護作用，其機制可能與抑制氧化應激有關。

3，4苯并芘 內皮祖細胞 黃芪甲苷 氧化應激

動脈粥樣硬化是一種慢性病變，它的主要特點是脂質和纖維成分在大血管長期堆積，最終導致冠心病的發(fā)生[1]。而冠心病已經(jīng)成為全球發(fā)病率、病死率最高的疾病[2]。目前，人們廣泛認為血管內皮細胞在動脈粥樣化的啟動和進程中起著至關重要的作用[3]。動脈血管內皮損傷可以導致血管屏障功能的喪失，進而促進炎癥細胞浸潤以及脂質推積。1997年，Asahara第1次分離培養(yǎng)到內皮祖細胞（EPCs），它是一群能分化成內皮細胞的干/祖細胞[4]。大量研究表明，它參與內皮損傷后的修復過程，其數(shù)量和功能與動脈粥樣硬化的危險性呈負相關。吸煙是動脈粥樣硬化的重要危險因素，與腦卒中和冠狀動脈疾病發(fā)病率的增加相關。香煙煙霧中含有大量的有害物質，3，4苯并芘（BaP）就是其中的一種[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，BaP對EPCs的多項生物學功能有損傷作用[6]。因此，尋找一種能降低煙草對心血管損傷，并且改善BaP對EPCs損傷的藥物，已引起醫(yī)學科研人員的高度重視。黃芪甲苷作為黃芪的一種活性成分，已被發(fā)現(xiàn)有很強的心血管保護作用[7-8]，但其對BaP介導的EPCs是否有保護作用以及潛在機制尚未清楚，對此筆者進行了研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 BaP（美國Sigma-Aldrichg公司），黃芪甲苷(上海融禾公司)，EGM-2培養(yǎng)基（瑞士Lonza公司），人淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），胰酶、Hank's液（美國Gibco公司），F(xiàn)BS、FITC-UEA-I（美國Sigma-Aldrichg公司），Dil-ac-LDL（美國 Molecular Probe公司），Ⅷ因子相關抗原細胞化學試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8，日本同仁化學研究所），超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、細胞活性氧（ROS）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的培養(yǎng)及鑒定 采用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)EPCs。臍帶血來自溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院健康的順產(chǎn)產(chǎn)婦，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，每次采血50ml，采用密度梯度離心法從臍血中分離獲取單個核細胞，以5×106個/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶中加入4ml含有10%的FBS、血管內皮生長因子（VEGF）（10ng/ml）的EGM-2培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48h更換培養(yǎng)基，待細胞集落長成80%匯集度即可用0.05%含EDTA的胰酶消化貼壁細胞，用培養(yǎng)基重懸細胞，并放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。采用Ⅷ因子相關抗原檢測、Dil-ac-LDL/FITC-UEA-I lectin雙熒光染色鑒定培養(yǎng)細胞；采用免疫組化法檢測培養(yǎng)細胞的Ⅷ因子相關抗原，步驟參照說明書進行。空白對照不加一抗，陰性對照采用胃癌細胞株GSC7901。為鑒定培養(yǎng)細胞攝取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-I lectin，將細胞制成5×106個/ml細胞懸液，加入終濃度2.4μg/ml的Dil-ac-LDL，在培養(yǎng)箱中避光孵育2h。吸棄上清液，4%多聚甲醛固定15min，加入FITC-UEA-I lectin（10mg/ml），繼續(xù)孵化1h，取出蓋玻片，用PBS輕輕沖洗2次，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.2 實驗分組 EPCs生長至70%～90%匯合度時，吸棄培養(yǎng)基，以低FBS（含2%FBS）的EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞同步化，然后以0.05%含EDTA的胰酶消化、收集細胞，并以含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基重懸細胞，制成5×106個/ml密度的單個細胞懸液。制成細胞懸液，以同等數(shù)量細胞接種，隨機分為5組，正常對照組：不作任何處理；BaP組：加入濃度為20μmol/L的BaP；3種濃度黃芪甲苷各組（先加入濃度分別為2、10、50μg/ml的黃芪甲苷，2h后再加入濃度為20μmol/L的BaP），各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行細胞功能檢測。

1.3 細胞功能檢測

1.3.1 增殖能力測定 消化收集第4代EPCs并以含2%FBS的培養(yǎng)基重懸，制成單個細胞懸液，各組均以每孔5 000個細胞的密度接種至預先包被hFN的96孔板中，每組設6個復孔，另設調零孔，同樣設6個復孔，每孔只添加含2%FBS的EGM-2培養(yǎng)液；然后將96孔板置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，吸棄培養(yǎng)基，重新添加含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，置酶標儀450nm處測OD值。

1.3.2 黏附能力測定 各組細胞均按5 000個/孔的密度接種至預先包被hFN的96孔板中，每組設10個復孔；置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，洗去未貼壁細胞，隨機選取10個視野（×200），倒置顯微鏡下計數(shù)黏附細胞數(shù)。

1.3.3 遷移能力測定 按上述方法收集并重懸細胞，在24孔板中放入transwell小室，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基，上室加入用含2%FBS培養(yǎng)基重懸的細胞懸液，培養(yǎng)24h后，取出transwell小室，用多聚甲醛固定微孔膜下層的細胞，并用結晶紫染色，顯微鏡計數(shù)遷移至小室底部的細胞。

1.4 測定細胞培養(yǎng)上清液中SOD及MDA含量 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，SOD測試盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中SOD含量；MDA測試盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中MDA含量。上述操作嚴格依據(jù)說明書進行，然后置于可見光分光光度儀測各組吸光度，最后按說明書中換算公式得出測量數(shù)據(jù)。

1.5 測定各組EPCs細胞內ROS含量 按實驗分組干預處理后，吸棄細胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗細胞2次，然后在6孔板中加入用EGM-2稀釋的濃度為10μmol/ ml的DCFH-DA，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。最后吸棄上清液，用PBS輕洗細胞，取出蓋玻片置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波波長為484nm，發(fā)射波波長為525nm。用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析各組細胞熒光強度，用平均灰度值表示。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定 細胞培養(yǎng)7～8d后，置于顯微鏡下觀察，可見細胞呈梭行，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣的集落（圖1a）。Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1 lectin結合雙熒光染色試驗陽性，細胞膜攝取FITC-UEA-1 lectin發(fā)綠色熒光，細胞質吞噬Dil-ac-LDL發(fā)紅色熒光（圖1b，此圖為雙染圖片融合后的復合圖像）。Ⅷ因子細胞化學試驗陽性，細胞呈現(xiàn)棕色（圖1c），作為對照的胃癌細胞不顯色。

圖1 EPCs的形態(tài)與鑒定

2.2 黃芪甲苷對EPCs增殖能力的影響 與正常對照組比較，BaP明顯抑制了EPCs的增殖能力（P＜0.01）；經(jīng)過24h干預后，黃芪甲苷能恢復EPCs受損的增殖能力，且隨著濃度的增高而增高（均P＜0.01），詳見圖2。

圖2 黃芪甲苷對EPCs增殖能力的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 黃芪甲苷對EPCs黏附能力的影響 與正常對照組比較，BaP對EPCs的黏附能力有損害作用（P＜0.01），經(jīng)過不同濃度黃芪甲苷干預后，黃芪甲苷能恢復EPCs受損的黏附能力，且隨著濃度的增高而增高（均P＜0.05），詳見圖3。

圖3 黃芪甲苷對EPCs黏附能力的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 黃芪甲苷對EPCs遷移能力的影響 與正常對照組比較，BaP明顯損害EPCs的遷移能力（P＜0.01），經(jīng)過24h干預后，黃芪甲苷能恢復EPCs受損的遷移能力，且隨著濃度的增高而增高（均P＜0.01），詳見圖4（見插頁）。

2.5 黃芪甲苷對EPCs中SOD及MDA含量的影響與正常對照組比較，BaP組的SOD含量明顯降低（P＜0.01），MDA含量明顯上升（P＜0.01）；與BaP組相比，不同濃度黃芪甲苷組的SOD含量明顯上升（P＜0.05），MDA含量下降（P＜0.05），并且在一定濃度范圍內，隨著黃芪甲苷濃度的增加，效果越明顯，詳見圖5。

2.6 黃芪甲苷對EPCs中ROS的影響 與正常對照組比較，BaP組的ROS表達顯著上升（P＜0.01）；與BaP組相比，不同濃度黃芪甲苷組的ROS表達明顯下降（P＜0.01），且呈濃度依賴性，詳見圖6（見插頁）。

3 討論

EPCs是出生后機體中存在的、能特異性歸巢于血管損傷、血管新生部位并分化成內皮細胞的一群干/祖細胞[4]。近年來，EPCs在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展乃至治療中的作用越來越受關注[9]。研究證實，其數(shù)量及功能受損可導致血管內皮細胞修復功能減弱，從而促使動脈粥樣硬化的發(fā)生[10]。吸煙是動脈粥樣硬化的危險因素，而BaP是香煙煙霧的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，BaP顯著損害EPCs的增殖、黏附、遷移能力，并且明顯減低細胞上清液中SOD含量，提高MDA含量及ROS的表達，筆者推測BaP對EPCs生物學功能的損害可能與氧化應激相關。

圖5 黃芪甲苷對EPCs中SOD及MDA的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

有研究顯示，適當水平的ROS，例如超氧離子、二氧化二氫，可以作為細胞活動中的一種信號因子，對于細胞的正常生長、遷移、分化、凋亡和衰老有著重要的作用[11]。但是，過量的ROS對于各種細胞，如EPCs或其它干細胞、祖細胞則是有害的[12]。SOD是一種生物酶，他通過岐化方式清除體內的氧自由基，保護細胞和基質免受氧自由基的損害[13]。研究表明，人EPCs之所以可以耐受適當?shù)难趸瘧?，是因為其細胞內含有較多可以清除超氧負離子的酶-錳SOD(MnSOD）[14]，而過強的氧化應激會使得EPCs的功能活性受損[15]。MDA作為氧自由基，與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化物的程度，間接反應細胞受自由基的損傷程度相關[16]。

黃芪，作為一種中藥，曾長期被廣泛用于治療多種心血管疾病[7]。從黃芪中可以分離純化得到許多具有藥用價值的化合物，包括黃芪皂苷、多糖和黃酮，而黃芪甲苷是其中重要活性部分之一。目前體內和體外研究表明黃芪甲苷可能通過抗氧化效應對心肌起保護作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能改善BaP介導的EPCs多種生物學功能，包括增殖能力、黏附能力、遷移能力，并且伴隨著EPCs多種生物學功能的改善，黃芪甲苷能夠顯著升高上清液中SOD含量，降低MDA含量及ROS的表達。這提示著黃芪甲苷可能通過減少氧化應激從而對BaP介導的EPCs起到保護作用。

本研究為黃芪甲苷治療心血管疾病提供了新的證據(jù)，也間接說明其在心血管疾病治療領域上有著廣闊的前景。

[1] Libby P.Inflammation in atherosclerosis[J].Nature,2002,420 (6917):868-874.

[2] Isaacs A,Willems S M,Bos D,et al.Risk scores of common genetic variants for lipid levels influence atherosclerosis and incident coronary heart disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013, 33(9):2233-2239.

[3] Liu Z,Ren X,Yang Z,et al.Effects and mechanisms of indol-2, 3-dione on atherosclerosis[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(8): 2087-2091.

[4] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1977,275 (5302):964-967.

[5] Rodgman A,Smith C J,Perfetti T A.The composition of cigarette smoke:a retrospective,with emphasis on polycyclic components [J].Hum Exp Toxicol,2000,19(10):573-595.

[6] Ji K,Xing C,Jiang F,et al.Benzo[a]pyrene induces oxidative stress and endothelial progenitor cell dysfunction via the activation of the NF-kappaB pathway[J].Int J Mol Med,2013,31(4): 922-930.

[7] Lei Z Y.Effect of Astragalus membranaceus on cardiovascular system[J].Zhongguo Zhong XiYiJie He Za Zhi,1993,13(7):443-446.

[8] Han L,Chen K.Progress of experimentalpharmacologic study on the effect ofAstragaus on the cardiac vascular system[J].Zhongguo Zhong XiYiJie He Za Zhi,2000,20(3):234-237.

[9] Sen S,McDonald S P,Coates P T,et al.Endothelial progenitor cells:novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease[J].Clin Sci(Lond),2011,120(7):263-283.

[10] GiannottiG,Doerries C,Mocharla P S,et al.Impaired endothelial repair capacity of early endothelialprogenitor cells in prehypertension:relation to endothelial dysfunction[J].Hypertension, 2010,55(6):1389-1397.

[11] Griendling K K,Sorescu D,Ushio-Fukai M.Nad(p)h oxidase: Role in cardiovascular biology and disease[J].Circ Res,2000, 86(5):494-501.

[12] Yao E H,Yu Y,Fukuda N.Oxidative stress on progenitor and stem cells in cardiovascular diseases[J].Curr Pharm Biotechnol, 2006,7(2):101-108.

[13] Afonso V,Champy R,Mitrovic D,et al.Reactive oxygen species and superoxide dismutases:role in joint diseases[J].Joint Bone Spine,2007,74(4):324-329.

[14] Dernbach E,Urbich C,Brandes R P,et al.Antioxidative stressassociated genes in circulating progenitor cells:Evidence forenhanced resistance against oxidative stress[J].Blood,2004, 104(12):3591-3597.

[15] Thum T,Fraccarollo D,Thum S,et al.Differential effects of organic nitrates on endothelial progenitor cells are determined by oxidative stress[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(4): 748-754.

[16] Fattman C L,Schaefer L M,Oury T D.Extracellular superoxide dismutase in biology and medicine[J].Free Radic Biol Med, 2003,35(3):236-256.

[17] Lai P K,Chan J Y,Cheng L,et al.Isolation of anti-inflammatory fractions and compounds from the root of Astragalus membranaceus[J].Phytother Res,2013,27(4):581-587.

[18] Zhao M,Zhao J,He G,et al.Effects of astragaloside IVon action potentials and ionic currents in guinea-pig ventricular myocytes [J].BiolPharm Bull,2013,36(4):515-521.

Protective effect of astragaloside IV on benzo[a]pyrene-mediated endothelial progenitor cell dysfunction and its mechanism

CHEN Jun,XIA Wujie,XUE Yangjing,et al.Department of Intensive Care Unit,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the protective effect ofAstragaloside IV(As IV)on benzo[a]pyrene(BaP)-mediated endothelial progenitor cell(EPC)dysfunction and to explore the underlying mechanism. Methods Human umbilical cord blood mononuclear cells were seeded in adherent culture to obtain EPCs.The EPCs were divided into 3 groups:control group,BaP group,and As IV group.BaP and Ac IV groups were treated with 20μmol/L BaP for 24h,and before exposure to BaP the As IV groups were pre-treated with different concentrations of Astragaloside IV(2,10 and 50μg/ml)for 24h.The proliferation,adhesion and migration of EPCs were evaluated by CCK-8 method,adhesion assay and Transwell assay,respectively.The superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)levels in culture supernatants were measured,and the expression of ROS was detected by immunofluorescence staining. Results Compared to the control group,BaP-treated EPCs showed a decline in proliferation,adhesion and migration (P＜0.01);while As IV treatment significantly attenuated BaP-induced decline of cell proliferation,adhesion and migration(P＜0.05)in EPCs.Furthermore,BaP-treated EPCs presented an increasing expression of ROS and MDA,but a decline ofSOD secretion(P＜0.01);while various concentrations of Astragaloside IVreduced the production of MDA(P＜0.05)and ROS(P＜0.01),and increased the SOD activity(P＜0.05)of EPCs in a concentration-dependent manner. Conclusion Astragaloside IVis able to prevent BaP-mediated EPCs dysfunction,probably by inhibiting oxidative stress.

Benzo[a]pyrene(Bap)Endothelialprogenitor cells(EPCs)Astragaloside IV Oxidative stress

2015-08-18）

（本文編輯：嚴瑋雯）

325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心臟監(jiān)護室（陳軍）；溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院ICU（胡建堅），心血管內科（夏武杰、薛楊靜）

陳軍，E-mail：531818260@qq.com