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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

金黃色葡萄球菌腸毒素B激活TACE誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白

劉珺，廖劍絢*，唐洪波，周芝芳

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的觀察金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞活性氧(ROS)和腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(TACE)活性的影響，并探討其在介導(dǎo)黏蛋白MUC5AC分泌中的作用。方法體外培養(yǎng)人鼻黏膜上皮細(xì)胞，用不同濃度的SEB孵育細(xì)胞0～24 h，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法檢測(cè)TACE的酶活性，熒光探針H2DCFDA檢測(cè)鼻黏膜上皮細(xì)胞中活性氧(ROS)的含量，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中MUC5AC的分泌水平。同時(shí)采用TACE siRNA干擾或ROS抑制劑NAC處理細(xì)胞，觀察其在介導(dǎo)MUC5AC分泌中的作用。結(jié)果100 ng/mL SEB作用鼻黏膜上皮細(xì)胞15 min后即可上調(diào)TACE的酶活性，30～60 min后達(dá)到峰值，并持續(xù)至2 h；SEB也能增加鼻黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)ROS的含量；采用NAPDH氧化酶抑制劑DPI處理后，ROS水平明顯減少；ROS抑制劑NAC處理鼻黏膜上皮細(xì)胞后，可明顯降低TACE的酶活性；30～100 ng/mL SEB能顯著誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC，采用TACE siRNA干擾其表達(dá)或抑制劑處理后，可抑制MUC5AC分泌。結(jié)論SEB激活TACE誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC。

金黃色葡萄球菌腸毒素B；腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶；活性氧；黏蛋白

慢性鼻—鼻竇炎(chronic rhinosinusitis,CRS)是一種多因素所致的鼻黏膜纖毛功能障礙，是耳鼻喉科最常見(jiàn)的多發(fā)病之一。其病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病原微生物感染、鼻內(nèi)解剖結(jié)構(gòu)異常，遺傳因素、以及環(huán)境因素均是CRS的重要誘因[1,2]。CRS作為一種炎癥相關(guān)疾病，病原體感染在其發(fā)病中的作用并不完全明確。CRS顯著的病理生理特征是鼻黏膜黏液分泌增加，纖毛清除功能減弱，后者可引起黏液淤積并繼發(fā)性引起細(xì)菌感染，由此引起的炎癥反應(yīng)又可加重黏液—纖毛清除系統(tǒng)的損傷，形成惡性循環(huán)[3]。人體呼吸道黏液的主要成分是黏蛋白，它主要由鼻黏膜上皮杯狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分泌，目前已知的黏蛋白基因近20余種，其中以MUC5AC最重要。生理?xiàng)l件下，MUC5AC在維持氣道濕化、協(xié)助上皮細(xì)胞功能等方面發(fā)揮重要作用，因此是呼吸系統(tǒng)抵御外界刺激的非特異性屏障。但在某些病理?xiàng)l件下，黏蛋白的過(guò)度分泌可使CRS黏膜局部防御功能減弱和纖毛清除功能降低，導(dǎo)致局部反復(fù)感染[4-5]。研究表明，CRS患者鼻腔內(nèi)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的檢出率較高[6-7]，其中金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcus aureus enterotoxin B，SEB)可能是CRS發(fā)病的重要病原相關(guān)分子模式[8]。但SEB究竟通過(guò)何種機(jī)制參與黏蛋白分泌目前尚未明了，本研究旨在初步探討SEB誘導(dǎo)MUC5AC分泌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑SEB購(gòu)自Toxin Technology (Sarasota,FL)，純度>95%。胎牛血清、DMEM/Ham F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone。二亞苯基碘(Diphenyleneiodonium，DPI)、N-乙酰-半胱氨酸(N-acetyl-cysteine，NAC)胰蛋白酶、2′,7′-二氯二氫熒光黃二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)以及TAPI購(gòu)自Sigma-Adrich。MUC5AC ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor converting enzyme，TACE)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Anaspec。TACE siRNA由廣州ribobio公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)本研究所用的鼻黏膜上皮細(xì)胞來(lái)自下鼻甲黏膜組織，為南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科行鼻中隔手術(shù)患者的標(biāo)本。開(kāi)展研究前獲得了患者的知情同意且研究方法符合本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。所有患者無(wú)變應(yīng)性鼻炎、哮喘病史，且近期無(wú)糖皮質(zhì)激素、抗組胺類藥物及阿司匹林耐受不良史。即手術(shù)中獲取的下鼻甲標(biāo)本于含有100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中，無(wú)菌條件下反復(fù)沖洗。隨后置于5倍體積的胰蛋白酶中(0.25%)，4 ℃消化16～18 h。用吸管吹打2～3 min，收集脫落的上皮細(xì)胞，加入終濃度為2.5%的胎牛血清終止消化。1 000 rpm離心5min收集并采用完全培養(yǎng)基(DMEM/Ham F12培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)漂洗細(xì)胞2次。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法去除鼻黏膜上皮細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞和紅細(xì)胞[9]。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞80%以上融合后，加入1，10，100 ng/mL SEB處理不同時(shí)間后用于下一步研究。

1.3 ROS測(cè)定鼻黏膜上皮細(xì)胞處理完畢后，終濃度5 μmol/L的H2DCFDA染液，37 ℃避光孵育30 min，每3～5 min輕微振蕩1次，使探針和細(xì)胞充分作用。孵育結(jié)束后用無(wú)菌PBS漂洗滌細(xì)胞3次以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。設(shè)置熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.4 TACE活性檢測(cè)采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理間接測(cè)定TACE的酶活性，按照AnaSpec公司提供的試劑盒的操作步驟進(jìn)行。該試劑盒含有底物QXLTM520/ 5-FAM，該底物能被TACE特異性降解，從而使QXLTM520無(wú)法淬滅熒光分子5-FAM。因此當(dāng)樣品中若含有TACE后，它通過(guò)降解該底物而產(chǎn)生5-FAM，其熒光強(qiáng)度與TACE的活性成正比。在熒光酶標(biāo)儀(Synergy HT,Bio-Tec)上設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm，測(cè)定各組熒光強(qiáng)度，結(jié)果以相對(duì)活性表示，計(jì)算公式：處理組活性/對(duì)照組活性。

1.5轉(zhuǎn)染與RNA干擾將生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛的鼻黏膜上皮細(xì)胞接種于6孔板中(含1.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h。按Lipofectamine 2000提供的操作步驟配制好A液和B液。其中A液將10 μL siRNA用無(wú)血清培養(yǎng)基溶解(本文所用的TACE siRNA序列分別為：正義鏈5′-GGUUUUAAAGGCUAUGGAAtt-3′；反義鏈5′-UUCCAUAGCCUUUAAAACCtg-3′)，終體積為250 μL。B液將5 μL Lipofectamine 2000用250 μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。充分混勻后室溫靜置20 min；隨后將上述A、B混合液加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，使TACE siRNA終濃度約為100 nmol/L。4 h后棄上清，更換為完全培養(yǎng)液，隨后用于下一步研究。

1.6 ELISA檢測(cè)MUC5AC分泌當(dāng)生長(zhǎng)于6孔板中的鼻黏膜上皮細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%視野時(shí)，棄培養(yǎng)基，并加入不同濃度的SEB作用相應(yīng)時(shí)間。處理結(jié)束后，采用連續(xù)凍融細(xì)胞方式裂解細(xì)胞，獲取裂解產(chǎn)物，1 000 rpm離心5 min后，將上清用于MUC5AC檢測(cè)。根據(jù)試劑盒提供的操作步驟，在包被有MUC5AC抗體的微孔板中加入100 μL待測(cè)液，37 ℃孵育2 h。經(jīng)洗滌后，按照試劑盒的步驟分別加入鼠抗人MUC5AC抗體以HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育。顯色后，測(cè)定450 nm處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MUC5AC的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 SEB增強(qiáng)鼻黏膜上皮細(xì)胞TACE的酶活性如圖1A所示，采用不同濃度SEB處理鼻黏膜上皮細(xì)胞30 min后，隨著濃度的遞增，TACE的酶活性逐漸增高，當(dāng)SEB濃度為100 ng/mL時(shí)，TACE的酶活性增加了2.8倍。此外，SEB對(duì)TACE酶活性的影響也呈一定的時(shí)間依賴性，即100 ng/mL SEB作用15 min后即可明顯增強(qiáng)TACE的酶活性，30～60 min后達(dá)到峰值，并持續(xù)至2 h(圖1B)

圖1 SEB對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞TACE酶活性的影響 A：不同濃度SEB對(duì)TACE活性的影響.與0ng/mL SEB組相比，*：P<0.05，**：P<0.01；B：100ng/mL SEB作用不同時(shí)間對(duì)TACE活性的影響

2.2 SEB經(jīng)ROS增強(qiáng)TACE酶活性SEB處理鼻黏膜上皮細(xì)胞30 min后，即可明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS。而給予NADPH氧化酶抑制劑DPI(10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞后，ROS含量明顯減少(圖2A)。此外，采用不同濃度ROS抑制劑NAC預(yù)處后，TACE酶活性隨之降低(圖2A)。

2.3 SEB促進(jìn)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC ELISA結(jié)果顯示，采用不同濃度SEB處理24 h后，隨著濃度的遞增，MUC5AC分泌水平逐漸增多，當(dāng)SEB濃度為100 ng/mL時(shí)，MUC5AC高達(dá)(312±31)ng/mL(圖3A)。此外，MUC5AC的分泌也呈一定的時(shí)間依賴性，即100 ng/mL SEB作用8 h后，MUC5AC顯著增多，16～24 h后達(dá)到峰值，并持續(xù)至48 h(圖3B)

2.4 TACE參與SEB誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC 鼻黏膜上皮細(xì)胞經(jīng)而給予1.0、5.0和10.0 μmol/L TACE抑制劑預(yù)TAPI處理細(xì)胞后，隨著濃度的增加，MUC5AC分泌逐漸減少(圖3A)。采用siRNA干擾TACE表達(dá)后， MUC5AC分泌明顯降低(圖3B、C)。

3 討 論

黏液高分泌是慢性鼻及鼻竇炎的主要病理學(xué)特征之一，黏蛋白在維持氣道濕化、協(xié)助上皮細(xì)胞功能等方面發(fā)揮重要作用，因此是呼吸系統(tǒng)抵御外界刺激的非特異性屏障。黏液的異常分泌是導(dǎo)致鼻腔黏液纖毛清除系統(tǒng)功能損害的重要因素，繼而極易引發(fā)細(xì)菌感染。細(xì)菌感染是CRS黏液高分泌的常見(jiàn)原因，其機(jī)制涉及多重信號(hào)通路的調(diào)控，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1等。不同的刺激因素所激活的信號(hào)通路有所不同。目前認(rèn)為，MUC5AC分泌主要受TACE和EGFR調(diào)控[10,11]。TACE是金屬水解蛋白(adamalysin)家族的膜結(jié)合型整合素樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metallpprotase,ADAM)，其功能主要是催化膜結(jié)合型TNF-α前體水解為具有生物活性TNF-α。除此之外，它也能促進(jìn)TGF-α等前體分子，從而釋放出可溶性TGF-α，后者隨后結(jié)合至EGFR上，通過(guò)配體-受體反應(yīng)激活EGFR而誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)。本研究也證實(shí)，鼻黏膜上皮細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，TACE酶活性較低，而給予100 ng/mL SEB作用15 min后即可誘導(dǎo)其激活，并持續(xù)至2 h以上，而通過(guò)RNA干擾或其抑制劑處理后，SEB誘導(dǎo)MUC5AC的水平顯著減少，這表明TACE參與了SEB作用后MUC5AC的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討SEB誘導(dǎo)MUC5AC的調(diào)控機(jī)制，我們對(duì)TACE的上游通路進(jìn)行了探討。TACE是ADAM家族成員，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)抑制性前結(jié)構(gòu)域，1個(gè)催化活性區(qū)，1個(gè)解聚素結(jié)構(gòu)域，1個(gè)富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)以及一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞漿結(jié)構(gòu)域。一般認(rèn)為，TACE主要有兩種激活機(jī)制，一是以ROS為代表，通過(guò)氧化前結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸后，可暴露出TACE的催化位點(diǎn)。第二中機(jī)制以佛波脂為代表，它通過(guò)激活蛋白激酶C，引起TACE胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，從而暴露出催化結(jié)構(gòu)域[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，SEB處理后30 min后，即可明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，采用ROS抑制劑處理后，TACE活性明顯降低。而ROS的產(chǎn)生又受NADPH氧化酶的調(diào)控，我們采用其抑制劑DPI處理后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ROS的含量也明顯減少。以上結(jié)果表明TACE的激活依賴于上游的NADPH氧化酶和ROS的產(chǎn)生。

圖2 SEB誘導(dǎo)經(jīng)ROS增強(qiáng)鼻黏膜上皮細(xì)胞中TACE酶活性 A：SEB對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響.與0ng/mL SEB相比，*:P<0.05；與100ng/mL SEB相比，#:P<0.05；B：ROS抑制劑對(duì)TACE酶活性的影響.與100 ng/mL SEB單獨(dú)處理組相比，*:P<0.05

圖3 SEB誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC 與0 ng/mL SEB組相比，*:P<0.05，**:P<0.01

圖4 TACE誘導(dǎo)SEB誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5ACA：與100 ng/mL+0 μmol/L TAPI相比，*:P<0.05；B：TACE siRNA干擾效果；C：與對(duì)照siRNA組(Con)相比，*:P<0.05

總之，本研究證實(shí)SEB可鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC。這表明金黃色葡萄球菌感染后，可能通過(guò)誘導(dǎo)MUC5AC過(guò)度分泌而加重COPD病情。若內(nèi)炎癥狀態(tài)持續(xù)存在，黏液合成和分泌增多造成氣流受限，同時(shí)過(guò)多積聚的黏液又可破壞氣道的非特異性防御功能，有利于病原菌定植，從而加重感染。此外，本研究也證實(shí)SEB通過(guò)ROS/TACE途徑誘導(dǎo)MUC5AC分泌，這是一條新的途徑，但不是唯一途徑。因?yàn)镸UC5AC上也存在NF-κB、Sp1等核轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，這些分析可能最終也參與了MUC5AC的分泌。在隨后的研究當(dāng)中，我們將對(duì)EGFR的其他分子開(kāi)展更深入探討，從而進(jìn)一步明確CRS的發(fā)病機(jī)制。

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StaphylococcusAureusEnterotoxinBInducesHumanNasalEpithelialCellsSecretionofMUC5ACviaActivationofTACE

LIU Jun,LIAO Jianxuan,TANG Hongbo,et al
(Depart.Otorhinolaryngology,TheFirstaffiliatedhospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

ObjectiveTo observe the effect of staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) on reactive oxygen species (ROS) production and tumor necrosis factor converting enzyme (TACE) activity in human nasal epithelial cells,and explore its role in MUC5AC secretion.MethodsHuman nasal epithelial cells were cultured in vitro,and then were stimulated with different concentrations of SEB for 0～24 h.The activity of TACE was measured by fluorescence resonance energy transfer method,SEB-induced production of ROS was detected by using the fluorescent probe H2DCFDA.To investivate the role of TACE and ROS in MUC5AC secretion,nasal epithelial cells was transfected by TACE siRNA or the ROS inhibitor NAC,and Secretion of MUC5AC in the culture supernatant was detected by ELISA.ResultThe enzymic activity of TACE was up-regulated followed by treatment of 100ng/mL of SEB for 15min,peaked at 30～60min and lasted for 2 h.In addition,SEB could induce ROS accumulation in human nasal epithelial cells,and this ability could be abrogated by DPI,an inhibitor of NADPH oxidase.Moreover,treatment of the ROS inhibitor NAC significantly decreased the enzymic activity of TACE.Furthermore,secretion of MUC5AC were abrogated when the cells were transfected the TACE siRNA or treated by its inhibitor TAPI.ConclusionsSEB induces MUC5AC secretion via ROS and TACE in human nasal epithelial cells.

staphylococcal aureus enterotoxin B; tumor necrosis factor-α converting enzyme; reactive oxygen species; MUC5AC

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.011

2016-03-06；

2016-05-19

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013SK3114).

*通訊作者，E-mail：278691897@qq.com.

R378.1

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秦旭平)