羅雅莉，黃 春，李 沛，孔慶科

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所,成都 611130 )

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鴨疫里默氏桿菌TbdR1表位抗原免疫原性研究

羅雅莉，黃 春，李 沛，孔慶科

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)研究所,成都 611130 )

TbdR1(TonB-dependent receptor 1)是鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer,RA)血清1、2 和10型中的一個很好的交叉免疫原性抗原。通過生物信息學(xué)分析，分段表達TbdR1的表位抗原，并對其免疫原性進行初步探究。結(jié)果表明，分段后的表位抗原對雛鴨均具有一定的保護力，這為深入研究鴨疫里默氏桿菌亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

鴨疫里默氏桿菌;TonB依賴性受體;免疫原性

鴨疫里默氏桿菌是危害禽類的一類重要的致病菌，呈世界性流行趨勢，該菌主要危害雛鴨、鵝和火雞，它可導(dǎo)致感染的動物大量死亡，耐過動物飼料轉(zhuǎn)化率低，并且生長遲緩，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。TonB依賴性受體主要存在于革蘭氏陰性菌外膜，是一群活躍在外膜的轉(zhuǎn)運蛋白家族[4]，其主要生物功能是協(xié)助細菌吸收鐵離子和幫助錳、鎳、VB12、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的運輸[5]。晶體結(jié)構(gòu)分析顯示TonB依賴性受體是一類保守性蛋白，主要由兩種亞基即塞子結(jié)構(gòu)域和β 桶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[6]。外膜上的TonB依賴性受體與鐵或者是鐵載體結(jié)合后,再與配體TonB 相結(jié)合,通過構(gòu)型的改變來通過細胞的通道進入到細胞內(nèi)，此過程的能量由TonB 復(fù)合體供給[7-9]。在對病原菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)，TbdR1除具有轉(zhuǎn)運功能外，其還參與Fe的獲取和宿主感染，是一個潛在的毒力因子，并且在鴨疫里默氏桿菌血清型1、2和10型中具有交叉免疫原性[10-13]，因此推測其有可能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生交叉免疫保護，而這正是滅活苗的不足之處。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TbdR1表位抗原主要集中于兩個區(qū)域，因此將其分別進行克隆表達和純化，并以純化蛋白作為抗原免疫雛鴨，研究其所能引起的免疫保護率。本研究最終發(fā)現(xiàn)表位抗原作為亞單位疫苗能起到一定的免疫保護，這為深入研究鴨疫里默氏桿菌亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株和質(zhì)粒

鴨疫里默氏桿菌 CH-1株，大腸桿菌 DH5α、Rosetta，質(zhì)粒 pET-32a等均由本實驗室保存。

1.1.2 試驗動物

雛鴨購自雅安某鴨場。

1.1.3 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自TIANGEN公司；PrimeStar DNA聚合酶、Solution I購自Takara公司；NdeI、BamH I限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自Solarbio公司；親和層析柱(HisTrap)購自GE公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；HRP標記的山羊抗鴨IgG購自KPL公司；商品化滅活疫苗漿利佳(主要成分為血清I型鴨疫里默氏桿菌)購自成都天邦生物制品有限公司。

1.1.4 生物信息學(xué)分析軟件

用NCBI 的BLAST 和 Expert Protein Analysis System 分析其理化性質(zhì)和氨基酸組成，蛋白的結(jié)構(gòu)域用 NCBI 的 conserved domain search program 分析，蛋白質(zhì)大小及等電點預(yù)測利用 DNASTAR 中的 EditSeq 分析，Protparam軟件分析蛋白質(zhì)的疏水性/親水性，BepiPred1.0bServer進行蛋白質(zhì)抗原表位解析，亞細胞定位通過 PSORTb v.3.0 分析。

1.2 方法

1.2.1 序列分析

通過BLAST分析，查找到RA CH-1株與DSM15868株的tbdR1相似的序列(gi: 403312028)，將此序列進行生物信息分析，根據(jù)抗原表位解析結(jié)果將此序列分成兩部分：J1(AA24-394)和J2(AA433-887)。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)序列分析結(jié)果，選擇優(yōu)勢抗原表位集中區(qū)域設(shè)計特異性引物，如表1所示。引物合成由華大基因完成。

表1 實驗所用引物

1.2.3 表達載體的構(gòu)建

以RA CH-1株基因組為模板，利用設(shè)計的特異性引物，分別擴增j1-tbdR1和j2-tbdR1基因片段。反應(yīng)體系參照Premier star酶說明書，PCR擴增條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72℃延伸10 s，共30個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，符合預(yù)期大小的產(chǎn)物利用DNA純化回收試劑盒回收。回收產(chǎn)物和載體質(zhì)粒經(jīng)相同酶切(NdeI 和BamH I)后?；厥掌魏唾|(zhì)粒經(jīng)16 ℃連接后轉(zhuǎn)入DH5α。經(jīng)氨芐青霉素初篩和PCR鑒定后，獲得陽性克隆，并送成都擎科技術(shù)有限公司測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白的表達和純化

提取鑒定正確的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入Rosetta進行表達，經(jīng)終濃度為1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)3 h后收集菌液。利用SDS-PAGE檢測分析。大量蛋白純化利用GE公司的鎳柱進行層析純化，操作步驟按照GE公司產(chǎn)品說明書進行。洗脫下來的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測分析，并用BCA試劑盒定量(參照說明書進行)。

1.2.5 RA CH-1全菌血清的制備

以109CFU的RA CH-1通過腹腔免疫7日齡雛鴨，共免疫3次，每次免疫間隔2周，最后一次免疫10 d后收集血清并測定抗體滴度，-20℃保存并用于隨后Western blot分析。

1.2.6 Western blot分析

Western blot分析按如下方法進行：以純化蛋白為檢測對象經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗為制備的全菌血清(1：500稀釋)，二抗為 HRP標記的山羊抗鴨IgG(1：5000稀釋),最后加入顯色底物，顯色2 min后加入終止液停止顯色。

1.2.7 免疫保護試驗

動物實驗共分為6組，包括3個實驗組(J1-TbdR1免疫組、J2-TbdR1免疫組和J1-TbdR1、J2-TbdR1共免疫組)，一個商品苗免疫組作免疫程序?qū)φ?，一個未免疫組作攻毒模型對照，一個空白組作空白對照。純化蛋白經(jīng)弗氏完全佐劑乳化后以皮下免疫方式免疫2日齡雛鴨，免疫劑量為0.2 mg/只，每組10只，血清一型是西南地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)爆發(fā)傳染性漿膜炎的主要流行性血清型之一[14]，因此免疫18 d后用RA CH-1 以10倍LD50劑量(1×109CFU/100 μL)，以大腿肌肉注射方式攻毒。未免疫組注射相同劑量的生理鹽水。觀察記錄攻毒后10 d內(nèi)雛鴨死亡情況，利用GraphPad Prism 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

分析結(jié)果表明TbdR1含有913個氨基酸，預(yù)測蛋白大小約為100.5 ku，等電點9.18，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，預(yù)測該蛋白有OM channels superfamily 和TonB-hemlactrns兩個保守區(qū)，亞細胞定位預(yù)測分析顯示該蛋白位于細菌的外膜。

2.2 截斷表位抗原的擴增及表達載體構(gòu)建

片段1、2分別為1137 bp和1389 bp，PCR產(chǎn)物在1200 bp左右有明顯的條帶，符合預(yù)期，如圖1-A所示。將構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定(圖1-B、C)，與預(yù)期相符；測序鑒定與GenBank公布一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 tbdR1-J1的擴增產(chǎn)物和重組質(zhì)粒PCR鑒定電泳

A：The PCR production of j1-tbdR1 and j2-tbdR1(1: j1-tbdR1；2:j2-tbdR1)。B：Identification of recombinant plasmid pET-J1-TbdR1 by PCR(1 and 3: pET-J1-TbdR1)。 C：Identification of recombinant plasmid pET-J2-TbdR1 by PCR(1 and 2: pET-J2-TbdR1.M：Marker DL2000)

圖2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(A/B)和純化(C)以及特異性檢測(D)

A: 1:The total proteins of induced Rosetta pET-J1-TbdR1; 2: The precipitate of induced Rosetta pET-J1-TbdR1; 3: The total proteins of uninduced Rosetta pET-J1-TbdR1; 4: The total proteins of induced Rosetta pET32a。B：1: The supernatant of induced Rosetta pET-J2-TbdR1; 2: The precipitate of induced Rosetta pET-J2-TbdR1; 3: The total proteins of uninduced Rosetta pET-J2-TbdR1; 4: The total proteins of induced Rosetta pET32a。C: 1:The purifed fusion protein J1; 2:The purifed fusion protein J2。 D：1:The purifed fusion protein J1; 2:The purifed fusion protein J2; 3: Negative control;M:Protein maker

2.3 截斷抗原的表達及純化

重組質(zhì)粒在Rosetta中經(jīng)1mmol/L IPTG大量誘導(dǎo)表達后，利用鎳柱層析純化，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明純化蛋白在35～45 ku和45～66.2 ku之間，分別與J1(41.5 ku)J2(51.3 ku)對應(yīng)如圖2所示。

2.4 Western blot分析

Western blot分析表明，在35～55 ku處分別有蛋白特異帶，證明純化的融合蛋白能與抗RA CH-1全菌血清特異性結(jié)合且特異性強。

2.5 免疫保護

動物實驗結(jié)果如表3及圖3所示。實驗組中，共免疫組致死率最低，其次是第4組和第3組，致死率較高。

表3 動物攻毒實驗結(jié)果

圖3 RA CH-1 感染雛鴨后的死亡率統(tǒng)計

Fig 3 Lethality rate of ducks after chanllenge of RA CH-1

3 討論

鴨疫里默氏桿菌至少存在21種血清型，每種血清型之間沒有明顯的交叉保護力[12,15-16]，免疫滅活苗有時無法產(chǎn)生免疫保護，而亞單位疫苗成分明確，無核酸，生物安全性高，部分亞單位疫苗可引起交叉免疫保護，因此研究RA亞單位疫苗很有必要[17]。TonB依賴性受體除了具有轉(zhuǎn)運功能和與病原菌致病能力相關(guān)外，它作為革蘭氏陰性菌外膜蛋白的一種，在對熒光假單胞菌[10]和杜克雷嗜血桿菌[18]以及鴨疫里默氏桿菌[12]的研究中也被證實了具有免疫原性，這些研究為TonB依賴性受體作為亞單位疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

在致病菌感染宿主機體的過程中，致病菌會加強相關(guān)毒力因子的表達，而部分毒力因子具有一定的免疫原性[19-20]。目前已經(jīng)被證明的毒力因子有OmpA[21]VapD[22]、CAMP cohemolysin[23]和TbdR1[13]以及Siderophore-interacting protein(Sip)[24]，其中OmpA[25]、TbdR1[12]和CAMP cohemolysin[26]被證實具有免疫原性，Chu等人[17]研究表明ompA和CpG寡脫氧核苷酸融合后構(gòu)建的新型重組基因工程疫苗具有很好的保護效果，這為亞單位疫苗的佐劑選擇提供了參考。

胡青海等[12]發(fā)現(xiàn)TbdR1在RA血清型1、2和10型中具有交叉免疫原性。本試驗中，J1-TbdR1免疫組和J2-TbdR1免疫組的死亡率均低于未免疫對照組，共免疫組明顯低于陽性對照組，說明兩段抗原表位能引起較好的免疫保護。商品苗免疫組致死率最低，說明此亞單位疫苗還有待從佐劑的選擇、免疫的劑量、免疫的方式等方面完善。

4 結(jié)論

本研究成功克隆了TbdR1表位抗原片段，攻毒保護實驗結(jié)果表明兩段表位抗原均具有一定的免疫保護原性且共免疫時免疫保護效果最好。本試驗為進一步研究TbdR1亞單位疫苗和交叉免疫保護奠定了基礎(chǔ)。

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Research on immunogenicity of the epitope peptide of TonB-dependent receptor 1 ofRiemerellaanatipestifer

LUO Ya-li，HUANG Chun，LI Pei，KONG Qing-ke

(Institute of Preventive Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

TonB-dependent receptor 1(TbdR1) was recently discovered to be an immunogenic antigen,which showed cross-reaction amongR.anatipestiferserotypes 1,2,and 10.Through bioinformatics analysis.Some of the epitope peptide of TonB-dependent receptor 1 ofRiemerellaanatipestiferwere chosen and researched about their immunogenicity.The results showed that ducks can be protected to some extent by epitope peptide establishing a foundation of the research of the development of the subunit vaccine.

Riemerellaanatipestifer; TonB-dependent receptor; immunogenicity

2016-01-13；

2016-02-02

收稿日期：四川省青年基金(2014JQ0006)

羅雅莉，碩士研究生，研究方向為動物微生物與免疫，E-mail:hyacinth216@outlook.com

孔慶科，研究員，研究方向為微生物學(xué)和疫苗學(xué)，E-mail：kongqiki@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2016.06.029

S852.61

A

2095-1736(2016)06-0029-04