趙曉亞，付曉芳，李 晶，王 鵬，葉 誠(chéng)，尚吟竹，鄭茜玥

(湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，湖北 武漢 430050)

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高效液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜測(cè)定楊樹膠的指標(biāo)性成分水楊苷

趙曉亞*，付曉芳，李 晶，王 鵬，葉 誠(chéng)，尚吟竹，鄭茜玥

(湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，湖北 武漢 430050)

建立了液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(LC-LTQ-Orbitrap)快速測(cè)定蜂膠中楊樹膠指標(biāo)性成分水楊苷含量的方法，并根據(jù)精確的母離子和子離子質(zhì)荷比進(jìn)行定性和確證，以判斷蜂膠中是否摻雜楊樹膠。樣品經(jīng)無(wú)水乙醇提取，Waters xselect HSS T3色譜柱(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)分離，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相，正離子掃描模式進(jìn)行高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，該方法的線性范圍為0.5～25.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.99。在25.0，150.0，300.0 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為81.6%～91.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.0%～11.6%。

高效液相色譜;線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱;高分辨質(zhì)譜;蜂膠;楊樹膠;水楊苷

GB/T 24283-2009[1]定義蜂膠為“工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠粘性物質(zhì)”。蜂膠具有廣泛的藥理活性和功效，有抗菌、降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老等作用[2-4],因此蜂膠產(chǎn)品越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞，原料需求顯著增加，出現(xiàn)了以楊樹膠混入蜂膠中的造假問(wèn)題。由于蜂膠來(lái)源于植物樹脂，尤其是楊屬性蜂膠主要來(lái)源于楊屬植物，因此為鑒別蜂膠和楊樹膠帶來(lái)了難度。

目前對(duì)蜂膠真假鑒別的方法主要有液相色譜法[5-12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]等。GH/T1081-2012中明確指出水楊苷廣泛存在于楊屬和柳屬植物的芽、葉子和樹皮中，西方蜜蜂在采集楊屬植物樹脂以及蜂巢內(nèi)傳遞這些樹脂加工成蜂膠的過(guò)程中加入了其腺體分泌的β-葡萄糖苷酶等，將樹脂中所含有的水楊苷水解。但在楊樹膠加工過(guò)程中水楊苷能穩(wěn)定存在。因而水楊苷是區(qū)分蜂膠與楊樹膠的有效指標(biāo)。本文借鑒此標(biāo)準(zhǔn)，采用定性更準(zhǔn)確的高分辨質(zhì)譜，對(duì)鑒別蜂膠與楊樹膠的特征化合物水楊苷進(jìn)行測(cè)定，建立了對(duì)蜂膠中水楊苷定性、定量分析的液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(LC-LTQ-Orbitrap)法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Scientific 線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀LTQ-Orbitrap XL(賽默飛世爾科技公司)，液相系統(tǒng)為Finnigan Surveyor液相色譜帶自動(dòng)進(jìn)樣器;Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司);KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);MS2型旋渦振蕩器(德國(guó)IKA公司);AB204-S型電子天平(美國(guó)Mettler Toledo公司)。

水楊苷(Salicin，CAS 138-52-3，分子式C13H18O7) 購(gòu)自Fluka公司,純度≥98.5%。甲醇、乙腈和無(wú)水乙醇(色譜純，德國(guó)Merck公司);乙酸(分析純);實(shí)驗(yàn)用水為Millipore系統(tǒng)制備的超純水。蜂膠、楊樹膠購(gòu)于湖北蜂農(nóng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg 于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別移取適量的上述儲(chǔ)備液于一系列10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

樣品在冰箱-10 ℃左右過(guò)夜，從冰箱中取出后立即攪碎混勻，在室溫下，準(zhǔn)確稱取蜂膠或楊樹膠樣品0.500 g于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入20 mL無(wú)水乙醇，超聲使樣品完全溶解后，用無(wú)水乙醇定容。取1.0 mL提取液過(guò)0.22 μm濾膜，供測(cè)定。

1.4 儀器條件

色譜柱：Waters xselect HSS T3(3.0 mm×100 mm，3.5 μm);流動(dòng)相：0.1%乙酸溶液(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序?yàn)椋?～3 min，95% A，3～8 min，95%～40% A，8～15 min，40%～1% A，15～20 min，1% A，20～21 min，1%～95% A，21～30 min，95% A;流速 0.2 mL/min;進(jìn)樣量5 μL，柱溫20 ℃。

質(zhì)譜條件：質(zhì)量分析器為FT Orbitrap，ESI(+)正離子模式掃描，質(zhì)量范圍(m/z)為100～500，分辨率為60 000，噴霧電壓為4.5 kV，管狀透鏡電壓為80 V，鞘氣壓力為35 arb，輔助氣壓力為5 arb。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

根據(jù)資料，蜂膠的提取通常采用甲醇、一定比例的乙醇溶液或無(wú)水乙醇，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙醇作為提取溶劑的提取效率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為提取溶劑時(shí)，溶解樣品比乙醇作為提取溶劑時(shí)難，而且無(wú)水乙醇對(duì)樣品中水楊苷的提取效率更高(對(duì)同一楊樹膠分別采用乙醇和甲醇提取，測(cè)得進(jìn)樣液中水楊苷的峰面積分別為882 091和204 184)，故采用無(wú)水乙醇為提取溶劑。

2.2 流動(dòng)相的選擇

對(duì)比了流動(dòng)相體系分別為10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈、10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇、0.1%乙酸-乙腈和0.1%乙酸-甲醇時(shí)對(duì)被測(cè)化合物分離及峰形的影響。結(jié)果表明，水楊苷在乙酸銨流動(dòng)相體系的響應(yīng)低于乙酸流動(dòng)相體系;用0.1%乙酸-乙腈流動(dòng)相時(shí)，水楊苷會(huì)出現(xiàn)雙峰，而以0.1%乙酸-甲醇為流動(dòng)相時(shí)出峰情況得到改善，峰變?yōu)閱我环澹逍魏懿?，展寬?yán)重。分別優(yōu)化了0.1%乙酸-乙腈和0.1%乙酸-甲醇兩種流動(dòng)相體系的洗脫梯度，發(fā)現(xiàn)0.1%乙酸-乙腈溶液的洗脫效果隨著梯度的調(diào)整，出現(xiàn)雙峰的情況得到改善，在“1.4”所示的優(yōu)化流動(dòng)相條件下，得到了單一的色譜峰(圖1)。

Fig.1 Chromatograms of salicin standard solution in optimal mobile phase

A.full scan spectrum;B.extracted ion chromatogram

圖2 水楊苷的質(zhì)譜圖Fig.2 Full scan mass spectrum of salicin

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化以及二級(jí)裂解

水楊苷的精確分子量為286.105 255，[M+H]+的精確質(zhì)量為287.113 080，[M+Na]+的精確質(zhì)量為309.095 022，[M+K]+的精確質(zhì)量為325.068 962。在全掃描模式下，對(duì)水楊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在m/z280～335范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示水楊苷的[M+H]+響應(yīng)非常低，而[M+Na]+響應(yīng)很好，進(jìn)一步優(yōu)化鞘氣電壓和輔助氣電壓，可使被測(cè)物[M+Na]+的響應(yīng)提高。質(zhì)譜圖見圖2。圖3給出了[M+Na]+離子在碰撞誘導(dǎo)解離(CID)

圖3 水楊苷的二級(jí)裂解譜圖

Fig.3 CID mass spectra of salicin in different energy

和高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)裂解模式及不同能量下的二級(jí)質(zhì)譜圖。在HCD模式下，碰撞能量20 eV和40 eV時(shí)水楊苷特征碎片離子少，提高碰撞能量達(dá)50 eV時(shí)，無(wú)特征碎片離子；CID模式下，水楊苷的二級(jí)特征離子穩(wěn)定，碎片離子的特征峰在40 eV和60 eV碰撞能量下無(wú)明顯區(qū)別，碎片離子(m/z)主要為279.083 7，185.041 8和147.041 4。本方法采用自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜采集，并用ToxID篩選軟件建立化合物的分子式數(shù)據(jù)庫(kù)信息表，化合物篩選的離子提取窗口寬度為5 ppm。指定離子加合物類型為[M+Na]+，通過(guò)二級(jí)碎片離子(m/z) 279.083 7，185.041 8和147.041 4的設(shè)定，增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.4 線性范圍、檢出限、回收率及精確度

分別配制濃度為0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0 μg/mL的系列水楊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所建立的分析方法進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)組分的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的進(jìn)樣濃度(x，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到水楊苷在0.5～25.0 μg/mL范圍內(nèi)的線性方程為y=4.438 65×106x+9.072 03×106，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995。采用空白樣品中添加水楊苷的方法，以3倍信噪比(S/N)計(jì)算得方法檢出限為25.0 mg/kg。

稱取蜂膠試樣0.500 g，分別加入25.0，150.0，300.0 mg/kg 3種濃度水楊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定6份，結(jié)果表明，3種添加濃度的平均回收率分別為81.6%,91.0%和89.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為11.6%,9.8%和9.0%。由于蜂膠會(huì)用楊樹膠摻假，而水楊苷是楊樹膠的特征成分，若蜂膠中摻有楊樹膠，會(huì)有水楊苷的檢出。稱取蜂膠試樣0.500 g，添加2.5%,5%,10%楊樹膠，每個(gè)濃度平行10份，均檢出水楊苷。樣品蜂膠、楊樹膠、蜂膠添加水楊苷標(biāo)準(zhǔn)溶液以及蜂膠添加楊樹膠的譜圖見圖4。

圖4 蜂膠(A)、楊樹膠(B)、蜂膠添加25.0 mg/kg水楊苷(C)以及蜂膠添加5%楊樹膠(D)的提取離子色譜圖

Fig.4 Extracted ion chromatograms of propolis(A)，poplar tree gum(B),25.0 mg/kg salicin spiked in propolis(C) and 5% poplar tree gum spiked in propolis(D)

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

蜂膠樣品按本方法進(jìn)行前處理，采用優(yōu)化后的LC-LTQ-Orbitrap條件進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果在部分蜂膠樣品中檢出水楊苷，有些樣品超過(guò)GH/T1081-2012(若蜂膠樣品中水楊苷含量大于0.15 mg/g或蜂膠乙醇提取物樣品中水楊苷含量大于0.25 mg/g，該樣品判定為檢出楊樹膠的樣品)規(guī)定的0.15 mg/g的限量，說(shuō)明在日常的蜂膠生產(chǎn)中存在摻雜楊樹膠的現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

本文將線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap)技術(shù)引入蜂膠摻假鑒別檢測(cè)，采用高分辨質(zhì)譜，在進(jìn)行母離子準(zhǔn)確定性定量的同時(shí)，增加高分辨的二級(jí)質(zhì)譜，提高了定性準(zhǔn)確性，更有利于排除干擾，可在不具備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下進(jìn)行確證。該方法具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，可用于日常蜂膠中楊樹膠的鑒別檢測(cè)。

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Determination of Salicin,a Characteristic Component of Poplar Tree Gumby HPLC-LTQ-Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

ZHAO Xiao-ya*，F(xiàn)U Xiao-fang，LI Jing，WANG Peng，YE Cheng，SHANG Yin-zhu，ZHENG Xi-yue

(Hubei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Wuhan 430050，China)

A method of high performance liquid chromatography(HPLC) combined with LTQ-Orbitrap XL mass spectrometry was developed for the analysis of salicin,a characteristic component of poplar tree gum in propolis.With the exact parent ion and fragment ion， whether the propolis contains poplar tree gum could be confirmed.The samples were extracted with ethyl alcohol.The LC separation was performed on a Waters xselect HSS T3(3.0 mm×100 mm，3.5 μm) column with acetonitrile-0.1% acetic acid solution as mobile phase.The analyte was detected under positive mode.The calibration curve showed a good linearity within the concentration range of 0.5-25.0 μg/mL.The average recoveries of salicin ranged from 81.6% to 91.0% at the spiked levels of 25.0，150.0，300.0 mg/kg with relative standard deviations(RSDs) less than 11.6%.The developed method was simple，sensitive and repeatable，and could be used as a screen and confirmatory approach for the analysis of salicin in propolis.

high performance liquid chromatography(HPLC);linear ion trap-orbitrap mass spectrometer(LTQ-orbitrap MS);high-resolution mass spectrometry(HRMS);propolis;poplar tree gum;salicin

2015-09-06;

2015-10-08

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研項(xiàng)目計(jì)劃(2013IK156)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.015

O657.72

A

1004-4957(2016)03-0342-05

*通訊作者：趙曉亞,博士,高級(jí)工程師,研究方向:食品安全檢測(cè)，Tel：027-58906069，E-mail：zhaoxy@hbciq.gov.cn