霍艷敏，王 駿，段文增，薛 霞，王艷麗，于文江

(1.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252000；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 食品檢驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3.泰山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山東 泰安 271021)

?

HPLC-APCI(+)-MS/MS測(cè)定乳制品中的維生素D2及D3

霍艷敏1*，王 駿2，段文增1,3*，薛 霞2，王艷麗2，于文江2

(1.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252000；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 食品檢驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；3.泰山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山東 泰安 271021)

建立了一種高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，正離子監(jiān)測(cè)模式下(HPLC-APCI(+)-MS/MS)測(cè)定乳制品中維生素D2和D3的方法。樣品經(jīng)皂化后，用石油醚提取，提取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL以下，氮?dú)獯蹈?，?0 mL甲醇溶解后，經(jīng)ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm,2.1 mm ×100 mm)分離，甲醇-水(95∶5)洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。維生素D2和D3在0.01～0.2 mg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.998 7和0.999 1，方法回收率為83.0%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～8.3%。

高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)；大氣壓電離源；維生素D2；維生素D3；乳制品

圖1 維生素D2及D3的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of vitamin D2 and vitamin D3

維生素D是生物體內(nèi)必不可少的一項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)元素，其主要作用是通過促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收而調(diào)節(jié)多種生理功能。維生素D的缺乏和過剩均會(huì)引起各種疾病，如缺乏維生素D會(huì)引起佝僂病、手足抽搐和軟骨病，其含量過高則會(huì)引起高血鈣和高尿鈣等[1]。維生素D家族中與健康關(guān)系密切的成員是維生素D2和D3，維生素D2主要存在于植物、真菌、霉菌和無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，維生素D3可由維生素D原經(jīng)皮膚紫外線照射后生產(chǎn)，但生物體自身合成量不足，必須由食物供給[2]。雖然維生素D的缺乏會(huì)引起諸多疾病，但人日均需求量較低，一般在5～10 μg[3-4]。在我國(guó)，維生素D2和D3被作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到食品中，尤其是在嬰幼兒食品中添加。GB 14880-2012食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了維生素D在不同種類食品中的用量，其在食品中的添加量一般約為幾十μg/kg[5]。為保護(hù)消費(fèi)者健康，有必要對(duì)食品中維生素D的含量進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)。目前維生素D的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[6-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-13]等。由于食品中的維生素D含量較低，基質(zhì)復(fù)雜，用高效液相色譜法檢測(cè)通常背景較高，導(dǎo)致食品中的維生素D不能檢出或定量不準(zhǔn)。作為一種脂溶性維生素，維生素D(結(jié)構(gòu)式如圖1)的極性較小，不易電離，但對(duì)熱穩(wěn)定，因此大氣壓化學(xué)電離是一種合適的電離方式。該電離方式相對(duì)于ESI受基質(zhì)影響較小，適合于嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒配方米粉、牛奶和鈣奶餅干等食品中維生素D的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國(guó)Waters液質(zhì)聯(lián)用儀：超高效液相色譜(ACQUITY UPLCTM)系統(tǒng),Quattro Premier質(zhì)譜儀，Masslynx 4.1工作站，ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm i.d.)。AL204電子天平(感量為0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，培養(yǎng)箱，數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(常州普天儀器制造有限公司)，萃取凈化振蕩器(西化儀(北京)科技有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)IKA公司)，氮吹儀，Milli-Q 超純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore 公司)。

甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Chemical)，維生素D2、維生素D3(Dr.Ehrenstorfer 公司)，α-淀粉酶(活力≥1.5 U/mg，美國(guó)Sigma公司)，石油醚(沸程 30～60 ℃)、氫氧化鉀、氯化鈉、抗壞血酸和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.000 1 g)標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋為10 mg/L的混合中間溶液，再將中間溶液依次稀釋成0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mg/L系列濃度標(biāo)準(zhǔn)使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理[14]

1.3.1 試樣處理 不含淀粉試樣：稱取混勻的固體試樣10 g、液體試樣50 g(精確至0.1 mg)于250 mL三角瓶中，固體試樣需用50 mL 45～50 ℃水溶解，混合均勻，待皂化。含淀粉試樣：稱樣2 g試樣(精確至0.1 mg)，加入0.5 gα-淀粉酶，用50 mL 45～50 ℃水溶解，混合均勻，放入(60±2) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，取出待皂化。

1.3.2 皂 化 于上述處理的試樣溶液中加入1.5 g抗壞血酸和100 mL 95%乙醇，充分混勻后加25 mL 1 000 g/L氫氧化鉀水溶液混勻，充氮排出空氣，蓋上膠塞。放入(53±2) ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩皂化45 min后，取出冷卻至室溫。

1.3.3 提 取 用少量的水將皂化液全部轉(zhuǎn)入500 mL分液漏斗中，加入100 mL 0.01%BHT-石油醚溶液，萃取10 min 后，靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入原錐形瓶中，上層有機(jī)相轉(zhuǎn)入另一500 mL 分液漏斗，水相按上述方法進(jìn)行第二次萃取。合并醚液，用100 mL 10%氯化鈉水溶液洗醚液兩次，使醚液洗至近中性。放出水相，加入約2 g無水硫酸鈉脫水，醚液轉(zhuǎn)入500 mL旋蒸瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上于(40±2) ℃充氮保護(hù)條件下蒸至近干(剩余約5～6 mL)。殘?jiān)檬兔艳D(zhuǎn)移至10 mL 刻度管中，氮?dú)獯蹈?，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，過0.22 μm有機(jī)濾膜后待測(cè)定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm i.d.)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水；流速0.5 mL/min；梯度洗脫程序：0～3.0 min，95%～100%A，3.0～5.0 min，100%A，5.0～5.1 min，100%～95%A,5.1 min，95%A，保持2 min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：大氣壓化學(xué)電離模式(APCI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)采集；高壓放電針電流1.10 μA；錐孔電壓24 V；離子源溫度135 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；碰撞氣流量0.18 mL/min；其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 維生素D2和維生素D3的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

Table 1 MRM parameters of vitamin D2and vitamin D3

CompoundPrecursorion(m/z)Productions(m/z)Conevoltage/VCollisionenergy/VVitaminD239763796?，2715240，240160，170VitaminD338542595?，3675240，240200，200

﹡quantification ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖2 維生素D2和D3的MRM離子監(jiān)測(cè)譜圖與總離子流色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms and TIC chromatogram of vitamin D2 and vitamin D3

由于乳制品成分復(fù)雜，且其中維生素D的含量一般在幾至幾百μg/kg，含量較低，若采用GB 5413.9-2010中的高效液相色譜法，目標(biāo)物易被雜質(zhì)包夾，且操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、損失較大，難以準(zhǔn)確定量。維生素D2和D3的極性較弱，本方法采用大氣壓化學(xué)電離(APCI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，對(duì)其定性和定量離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，目標(biāo)物在3 min內(nèi)可完成分析檢測(cè)。方法比較了維生素D2和D3在APCI+源與ESI+源上的靈敏度，發(fā)現(xiàn)靈敏度相差不多，而APCI+源受樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響較小，因此選用APCI+源。在APCI+源下，分別對(duì)高壓放電針電流、錐孔電壓、選擇離子、源溫和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選定維生素D2的母離子m/z為397.6，豐度較高的子離子m/z為379.6和271.5，維生素D3的母離子m/z為385.4，豐度較高的子離子m/z為367.5和259.5，其他最佳參數(shù)見“1.4.2”。在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，其子離子及總離子流圖如圖2所示。

方法比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-10 mmol/L醋酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，以甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的靈敏度比用乙腈-水作流動(dòng)相高5倍；與甲醇-醋酸銨相比，甲醇-水作流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的靈敏度高1.5倍左右，且無需配制醋酸銨溶液，因此選用甲醇-水作流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

前處理方法參照GB 5413.9-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測(cè)定》，并做進(jìn)一步優(yōu)化。皂化設(shè)備改用水浴恒溫振蕩器，并采用萃取凈化振蕩器進(jìn)行萃取，使前處理便于批量進(jìn)行；在石油醚萃取液中加入0.01%的抗氧化劑BHT，使得目標(biāo)物在前處理過程中更穩(wěn)定；而采用100 mL 10%氯化鈉水溶液對(duì)石油醚相清洗兩次，即可洗至中性，氯化鈉的加入大大縮短了水油兩相的分離時(shí)間。

2.3 線性范圍與檢出限

用甲醇配制質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mg/L的維生素D2和D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，按最佳色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，以維生素D2和D3的定量離子峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x，mg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，維生素D2和D3在0.01～0.2 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為：y=9 494.1x-14.577和y=16 784x-31.053，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.998 7和0.999 1。采用未經(jīng)強(qiáng)化的原料奶粉和牛奶進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限和定量下限，測(cè)得乳粉中維生素D2和D3的檢出限分別為5.0 μg/kg和2.0 μg/kg，定量下限分別為15.0 μg/kg和6.0 μg/kg;牛奶中維生素D2和D3的檢出限分別為1.0 μg/kg和0.4 μg/kg，定量下限分別為3.0 μg/kg和1.2 μg/kg。

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別在維生素D含量(即維生素D2和D3總量)為63.5 μg/kg和67.3 μg/kg的嬰幼兒配方乳粉和嬰幼兒配方米粉中添加50，100，200 μg/kg的維生素D2和D3，在維生素D含量(維生素D2和D3總量)為18.6 μg/kg的調(diào)制乳中添加15，50，100 μg/kg的維生素D2和D3，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6次，其回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表2所示。嬰幼兒配方乳粉和米粉中維生素D的回收率在83.0%～98.2%范圍內(nèi)，RSD為2.3%～8.3%；調(diào)制乳中維生素D的回收率在88.0%～99.4%范圍內(nèi)，RSD為2.0%～6.3%，該方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 嬰幼兒配方乳粉、米粉及調(diào)制乳中維生素D2和D3的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

Table 2 Recoveries and RSDs of vitamin D2and vitamin D3in infant formula,infant formula rice noodles and modified milk

SampleComponentMeasured(μg·kg-1)Spiked(μg·kg-1)Totalvalue(μg·kg-1)RecoveryR/%RSDsr/%InfantVitaminD2-?50，100，200426，890，1868852，890，93483，65，32formulaVitaminD363550，100，2001062，1574，2600854，938，98276，53，26ToddlerVitaminD2-50，100，200433，912，1912866，912，95678，46，23cerealVitaminD367350，100，2001088，1614，2638830，941，98274，41，25ModulationVitaminD2-15，50，100135，472，963900，944，96363，35，20milkVitaminD318615，50，100318，676，1180880，980，99456，32，20

*no detected

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

按本方法對(duì)市售幾種品牌的嬰幼兒配方乳粉、米粉及調(diào)制乳進(jìn)行檢測(cè)，從檢測(cè)結(jié)果看，所檢測(cè)的嬰幼兒配方乳粉和米粉中維生素D的含量一般在60～100 μg/kg范圍內(nèi)，調(diào)制乳中維生素D的含量在10～40 μg/kg范圍內(nèi),樣品中維生素D的檢出值均符合標(biāo)示值及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定值[5,15-16]。圖3為其中1個(gè)乳粉樣品的檢測(cè)譜圖，維生素D2未檢出，維生素D3的檢測(cè)無雜質(zhì)干擾，其測(cè)定值為78.2 μg/kg。將該方法的檢出值與國(guó)標(biāo)方法檢出值進(jìn)行對(duì)照(表3)，偏差小于10%，符合國(guó)標(biāo)要求。

圖3 某一嬰幼兒配方乳粉中維生素D2和D3的MRM檢測(cè)譜圖

Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of vitamin D2and vitamin D3in infant formula

表3 樣品中維生素D2和D3的測(cè)定結(jié)果

Table 3 Determination results of vitamin D2and vitamin D3in samples

(μg/kg)

SampleVitaminD2inthismethodVitaminD3inthismethodVitaminDinnationalstandardmethodLabelledvalueofvitaminDInfantformula-1-?78273671Infantformula-2-635661563Infantformula-3-726763552～1523Toddlercereal-1-673634688Toddlercereal-2-816775821Toddlercereal-3-928956515～1516Modulationmilk-1-15214613Modulationmilk-2-18619515

* no detected

3 結(jié) 論

本文通過優(yōu)化樣品前處理方法、液相色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，建立了一種高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測(cè)定乳制品中維生素D2和D3的檢測(cè)方法。該方法可實(shí)現(xiàn)樣品批量前處理和上機(jī)測(cè)定，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并提高了目標(biāo)物定性、定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

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Determination of Vitamin D2and Vitamin D3in Dairy Products by HPLC-APCI(+)-MS/ MS

HUO Yan-min1*,WANG Jun2,DUAN Wen-zeng1,3*,XUE Xia2,WANG Yan-li2,YU Wen-jiang2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng University,Liaocheng 252000,China; 2.Food Laboratory,Shandong Institute for Food and Drug Control,Jinan 250101,China；3.College of Chemistry and Chemical Engineering,Taishan University,Tai'an 271021,China)

An HPLC-APCI(+)-MS-MS method was developed for the determination of vitamin D2(VD2) and vitamin D3(VD3) in dairy products.The sample was saponified,and then extracted with petroleum ether.Next,the extract was dried with anhydrous sodium sulfate and concentrated below 10 mL via rotary evaporation under the protection of nitrogen.Then it was dried with nitrogen and dissolved with 10 mL methanol.The extract was analyzed by HPLC-APCI(+)-MS-MS using an ACQUITY UPLC BEH C18column(1.7 μm,2.1 mm×100 mm) as chromatographic column with a mobile phase of methanol and water under gradient elution.The responses of VD2and VD3showed good linearities in the range of 0.01-0.2 mg/L,with correlation coefficients more than 0.998. The average recoveries were in the range of 83.0%- 99.4%,with RSDs of 2.0%- 8.3%.

high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry(HPLC-MS/MS);atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry;vitamin D2;vitamin D3;dairy products

2015-07-06；

2015-08-30

山東省自然科學(xué)基金(ZR2012BL08)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.012

O657.63

A

1004-4957(2016)03-0327-05

*通訊作者：霍艷敏，碩士，工程師，研究方向：色譜分析，Tel：0635-8239341，E-mail:huoyanmin0628@163.com 段文增，博士，講師，研究方向：有機(jī)材料分析，Tel：0635-8239341，E-mail:duanwenzeng@163.com