王麗，孫朝霞，劉榮華，侯思宇,2*，李紅英,2，韓淵懷,2,3，黃可勝,4

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)科院 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031； 4.浙江農(nóng)林大學(xué),浙江 杭州 311300)

?

基于SRAP-PCR技術(shù)開發(fā)蕎麥種間特異標(biāo)記及相關(guān)序列分析

王麗1，孫朝霞1，劉榮華1，侯思宇1,2*，李紅英1,2，韓淵懷1,2,3，黃可勝1,4

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801；3.山西省農(nóng)科院 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031； 4.浙江農(nóng)林大學(xué),浙江 杭州 311300)

[目的]蕎麥種質(zhì)資源繁多，天然的自交不親和特性使甜蕎繁殖的種子存在一定程度的雜合。而苦蕎的自交親和特性又使其繁殖種子世代生殖隔離。為開發(fā)鑒別不同蕎麥品種以及種子純度特異分子標(biāo)記。[方法]基于SRAP-PCR技術(shù)，根據(jù)40個蕎麥品種間DNA多態(tài)性位點，將種間差異PCR擴增位點的DNA帶回收測序，生物信息學(xué)分析其序列特征。[結(jié)果]克隆了8個種間多態(tài)性位點；經(jīng)核酸序列分析，僅有2個差異PCR擴增位點序列包含SRAP-PCR擴增的上下游引物序列，分別暫時命名為8802-1和M化5；其他位點分析表明均為單引物擴增序列。其中，8802-1位點核酸序列長度為705 bp，包含3個常用酶切位點；預(yù)測到1個ORF區(qū)，所編碼的氨基酸序列經(jīng)BLASTP比對分析，未找到任何與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中同源的氨基酸序列。M化5位點核酸序列長度為687 bp，包含3個酶切位點和2個ORF，經(jīng)BLASTP比對分析，預(yù)測第2個ORF編碼的氨基酸序列與擬南芥的反轉(zhuǎn)座子蛋白同源性為71%，推斷該序列為包含一個反轉(zhuǎn)座子元件的基因。[結(jié)論]本研究獲得了2個品種特異位點序列，其中一個位點序列包含編碼的反轉(zhuǎn)座子元件，另一個為冗余的基因組序列，可進(jìn)一步將這兩個序列開發(fā)為STS標(biāo)記，應(yīng)用于蕎麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、種子純度鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助育種。

甜蕎；DNA多態(tài)性位點；SRAP-PCR技術(shù)；分子標(biāo)記

蕎麥(Buckwheat)屬于雙子葉植物綱，系蓼目蓼科蕎麥屬，主要栽培種有甜蕎(F.esculentumMoench)和同屬的苦蕎(F.tartaricumGaertn)均可作為藥食兼用的糧食作物。栽培蕎麥屬小雜糧的一種，雖屬小宗作物，但卻是很好的救災(zāi)填閑作物和重要的蜜源作物[1]。蕎麥的生長周期短，抗逆性強，耐貧瘠，可作為綠肥、飼料或者防止水土流失的覆蓋植物，主要集中分布在陜西、山西、寧夏、甘肅等地區(qū)[2]。山西省特殊的地理環(huán)境和氣候條件，適宜小雜糧的種植和生產(chǎn)，具有發(fā)展小雜糧的優(yōu)勢。因此從分子的角度研究山西省適宜種植的蕎麥品種或引入其他地區(qū)和國家的品種，以便為選育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的蕎麥品種奠定理論基礎(chǔ)。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)分子標(biāo)記最早由Li和Quiros于2001年提出[3]，SRAP是一種DNA分子標(biāo)記的方法，這種方法具有簡便、穩(wěn)定、容易得到選擇條帶的特點。它利用獨特的引物設(shè)計，對開放式閱讀框(ORFs)進(jìn)行擴增，具有簡單、高效、共顯性、易測序、可檢測基因的ORFs區(qū)域等特點。ORFs可稱為蛋白質(zhì)編碼基因，已有研究表明，SRAP比AFLP、RAPD等其他方法更能反映表型的多樣性及進(jìn)化歷史[4]。Budak等研究了ISSR，SSR，RAPD和SRAP標(biāo)記對野生草資源的遺傳分類的影響，結(jié)果表明：SRAP標(biāo)記多態(tài)性豐富，能夠區(qū)分遺傳關(guān)系很近的品種[5]。目前，SRAP標(biāo)記已成功應(yīng)用于煙草、芝麻、寒蘭和鴨茅[6～9]等的鑒定和遺傳分析。因此，利用SRAP標(biāo)記分析蕎麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性能更好地揭示遺傳表型差異，更有效地反映材料間的親緣關(guān)系。在基因組層面深入研究蕎麥遺傳多樣性就顯得尤為重要。而序列標(biāo)簽位點(Sequence Tag Site，STS)標(biāo)記是根據(jù)單拷貝的DNA片段兩端的序列，設(shè)計一對特異引物，擴增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列。STS標(biāo)記采用常規(guī)PCR所用的引物長度，因此PCR分析結(jié)果與SSR標(biāo)記一樣穩(wěn)定可靠。因此，本研究利用SRAP-PCR技術(shù)分析40個甜蕎品種間的差異位點，獲得2個特異標(biāo)記位點，并將其回收測序，進(jìn)行序列特征分析。以期為進(jìn)一步將甜蕎品種特異SRAP標(biāo)記位點轉(zhuǎn)化為STS標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

所有實驗材料于2015年5月種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站，選取頂端幼葉，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。蕎麥品種詳見表1。

1.2 蕎麥DNA的提取及特異品種擴增條帶的獲得

采用改良后的CTAB法提取蕎麥DNA[10]。14對上游和17對下游SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成。使用優(yōu)化后的SRAP反應(yīng)體系：10 μL 2×PCRMix，1 μL 上下游引物，1 μL DNA模板，加水至總體積20 μL。對40個甜蕎基因組進(jìn)行SRAP擴增分析，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀掃描圖像，找出品種特異的擴增條帶回收測序。回收試劑盒為康由世紀(jì)公司生產(chǎn)，回收步驟參考試劑盒說明書操作。

1.3 目的DNA片段克隆

應(yīng)用T載體克隆試劑盒(pMD18-T，TaKaRa)中連接緩沖液將目的DNA和T載體混合后，在16 ℃條件下連接30 min。將含有目的片段的載體轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30 min。42 ℃水浴熱激42 s，冰上放置2 min。加入400 μL空白LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h。在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上加入25 g·L-1的X-gal 40 μL，25 g·L-1的IPTG 20 μL。取培養(yǎng)物100 μL涂于該平板上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。在過夜培養(yǎng)的LB固體培養(yǎng)基上挑取陽性克隆的單菌落，將單菌落置于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基2 mL離心管中，震蕩培養(yǎng)3～5 h。

1.4 菌落PCR鑒定與序列分析

以單菌落菌液為擴增模板，建立菌落PCR擴增體系，10 μL 2×PCRMix，1 μL 上下游引物M13F或M13R，1 μL菌液為模板，加水至總體積20 μL。菌落PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測。凝膠成像儀掃描后，觀察擴增目的片段的大小。獲得的陽性克隆菌株，送于上海生工生物工程有限公司，進(jìn)行DNA測序工作。采用VectorNsuite7.0和DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接和初步分析。進(jìn)一步在生物信息學(xué)網(wǎng)站分析其序列特征(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

表1 蕎麥品種產(chǎn)地及分類

2 結(jié)果分析

2.1 甜蕎品種間差異DNA條帶分析

20個SRAP引物組合共擴增出182個條帶，獲得品種特異的條帶共14個，其中品種8802-1，引物組合Em9Me3擴增出一條1 000 bp的特異條帶；品種M化5，引物組合Em10Me11擴增出一條800 bp的特異條帶。圖1中，兩個引物組合Em9Me3和Em10Me11擴增的特異條帶用黑色箭頭標(biāo)示。相比較其他品種，這兩條特異條帶位置存在明顯差異，可作為鑒定這兩種品種的特異標(biāo)記位點。將其克隆回收以便進(jìn)一步序列分析，可進(jìn)一步開發(fā)為STS標(biāo)記。

2.2 目的DNA片段克隆分析

應(yīng)用TA克隆技術(shù)將回收、純化的8802-1與M化5兩個品種的差異特征片段與載體連接并轉(zhuǎn)化于大腸桿菌菌株中，分別挑取四個單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，并取1uL培養(yǎng)的重組克隆菌液進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增分別得到1 200 bp和1 000 bp的條帶(圖2)。

因擴增引物M13設(shè)計在載體的兩側(cè)，擴增產(chǎn)物的片段含有載體兩側(cè)的序列大約為200 bp，所以在電泳檢測結(jié)果中所得片段應(yīng)比目的片段長度大200 bp左右。凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符，表明上述驗證的克隆為陽性克隆。

圖1 40個甜蕎品種DNA多態(tài)性位點分析Fig.1 DNA polymophism loci of 40 buckwheat varieties analyzed by SRAP-PCR technology 注：A表示8802-1品種在引物EM9ME3擴增下的差異特征帶；B表示M化5品種在引物EM10ME11擴增下的差異特征帶Note:A represented different special band of cultivar 8802-1 by amplicon of primer EM9ME3,B represented different special band of cultivar Mhua5 by amplicon of primer EM10ME11

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測包含目的片段的陽性克隆Fig.2 The positive clone were detected by agarose gel electrophoresis 注：A為8802-1差異特征片段載體插入陽性克隆鑒定，B為M化5差異特征片段載體插入陽性克隆鑒定; 1表示對照目的片段，2～4表示陽性克隆的目的片段Note： A indicated different character fragment of 8802-1 positive clone，B indicated different character fragment of M-5 positive clone

圖3 蕎麥品種8802-1 和M化5特異序列開放閱讀框預(yù)測、酶切位點及編碼氨基酸分析Fig.3 Predicted ORF，analyzed Enzyme restriction map and encoded amino acid in 8802-1 and Mhua5 buckwheat cultivars A：Sequence analysis of 8802-1 buckwheat cultivar. B: Sequence analysis of Mhua5 buckwheat cultivar

2.3 序列分析

包含8802-1品種差異特征條帶的陽性克隆測序拼接后，獲得目的片段核酸序列為705 bp。該序列包含3個常見的酶切位點，在第181～186個堿基處為XbaI酶切位點，第209～214個堿基處為XhoI酶切位點，在第305～310個堿基處為EcoRV酶切位點。開放閱讀框分析表明：在第1～252個堿基處包含一個開放閱讀框，編碼81個氨基酸殘基。氨基酸序列比對Nr(Non-redundant)數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明：該序列與其他物種的假想蛋白相匹配，且同源性最高為30%，覆蓋度為87%。以上分析說明該序列所包含的開放閱讀框并不是一個有效的基因序列(圖3A)。

包含M化5品種差異特征條帶的陽性克隆測序拼接后，獲得的目的片段序列為687 bp。該序列包含3個酶切位點，在第147～152個堿基處為KpnI酶切位點；第530～535個堿基處為XhoI酶切位點；第575～580個堿基處為NcoI酶切位點。開放閱讀框分析表明：在2～352個堿基處包含一個開放閱讀框，編碼107個氨基酸殘基(圖3B)。氨基酸序列比對Nr(Non-redundant)數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明：該序列與地球上最古老的有花植物無油樟的假想蛋白相匹配，同源性為33%，覆蓋度為93%。在326～574個堿基處包含一個開放閱讀框，編碼82個氨基酸殘基。氨基酸序列比對Nr(Non-redundant)數(shù)據(jù)庫結(jié)果表明：該序列與擬南芥的反轉(zhuǎn)座子多聚蛋白(Retroelement pol polyprotein)相匹配，同源性為71%，覆蓋度為91%。而且序列比對發(fā)現(xiàn)該開放閱讀框編碼的氨基酸序列具有一個保守結(jié)構(gòu)域(RT-like Superfamily)，并在其C端具有一個NTP結(jié)合位點和一個激活位點，可以推斷該序列包含反轉(zhuǎn)座子基因的一個外顯子區(qū)。

3 討論

分子標(biāo)記的種類很多，如RFLP、SSR、ISSR、AFLP和SRAP等，這些標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記開發(fā)及遺傳作圖中[11,12]，在蕎麥分子標(biāo)記開發(fā)以及遺傳作圖中用到了ISSR和RAPD標(biāo)記[13～15]。隨著基因組時代的到來，NCBI ( National Center for Biotechnology Information) 等數(shù)據(jù)庫中存在大量的序列信息(如STS序列)，為開發(fā)STS新型標(biāo)記提供了有利條件。但是對于蕎麥等小雜糧作物，由于其關(guān)注度較小，因此其基因組的序列尚屬未知或開發(fā)程度較低。

這些年來，開發(fā)利用與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的STS分子標(biāo)記及遺傳圖譜構(gòu)建越來越廣泛。我們利用SRAP標(biāo)記技術(shù)，在不同蕎麥品種中進(jìn)行遺傳聚類分析及差異特征遺傳分子印記分析，從而獲得2個品種特異條帶，我們對其進(jìn)行回收測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一條特異片段與反轉(zhuǎn)座子蛋白為同源序列。反轉(zhuǎn)座子是真核生物中種類最多、分布最廣的轉(zhuǎn)座因子，是植物基因組的重要組成部分，通常占植物基因組DNA的50%以上。水稻、擬南芥、玉米和大麥中都發(fā)現(xiàn)了大量分布在基因組上的反轉(zhuǎn)座子，而且分布于一些基因富集區(qū)[16]。逆轉(zhuǎn)座子以RNA 為中介轉(zhuǎn)錄到染色體外DNA, 通過編碼反轉(zhuǎn)錄RNA酶和整合酶插入基因組，這種轉(zhuǎn)錄復(fù)制模式使逆轉(zhuǎn)座子通過產(chǎn)生插入突變基因或改變宿主基因組的大小以及結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生遺傳多樣性[17]。本研究中一條特異片段序列與甜瓜的ty3-gypsy retrotransposon的序列同源性較高，由于序列中包含的基因序列信息較少，無法預(yù)測到該序列是否具有反轉(zhuǎn)座子的典型結(jié)構(gòu)域(兩個同Gag和Pol多肽相連的閱讀框架)，針對本研究獲得的反轉(zhuǎn)座子基因序列是否具有轉(zhuǎn)錄活性，需進(jìn)一步分離其側(cè)翼序列，以期獲得更多的序列信息來進(jìn)一步鑒定其特征。這是我們首次發(fā)現(xiàn)在蕎麥基因組上存在著反轉(zhuǎn)座子特征序列，這些未被發(fā)掘的“睡美人”是否跟蕎麥的遺傳多樣性和進(jìn)化相關(guān)，是否引起了蕎麥在長期歷史進(jìn)化的過程中賦予新的生物學(xué)特性，尚需我們進(jìn)一步研究探索。這些序列為我們進(jìn)一步開發(fā)STS標(biāo)記位點，并應(yīng)用于8802-1和M化5的品種鑒別提供序列基礎(chǔ)。這些序列標(biāo)簽位點將為我們在今后的蕎麥分子輔助育種工作中提供快速、簡單的鑒別手段。盡管本文所做工作還遠(yuǎn)沒有達(dá)到我們預(yù)期的目標(biāo)。所以期望能夠在后續(xù)的工作中將這些序列完善并開發(fā)為STS標(biāo)記，以期作為特征標(biāo)記鑒定這兩個蕎麥品種，并將SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)換STS標(biāo)記這一方法體系完善，為大規(guī)模開發(fā)分子標(biāo)記應(yīng)用于蕎麥品種鑒別和雜交種親緣關(guān)系分析奠定基礎(chǔ)。

[1]尹萬利,雷緒勞,王敬昌,等.甜蕎的食用價值與高產(chǎn)栽培措施[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,55(3):207-209.

[2]林汝法,李永青.蕎麥栽培[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1984:23-56.

[3]Li G, Quiros CF. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based mapping and gene tagging inBrassica[J].Theoretical and Applied Genetics, 2001, 103:455-461.

[4]Ferriol M, Pico B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(2): 271-282.

[5]Budak H, Shearman R C, Parmaksiz I, et al. Comparative analysis of seeded and vegetative biotype buffalograsses based on phylogenetic relationship using ISSRs, SSRs, RAPDs, and SRAPs[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 109(2): 280-288.

[6]馬紅勃,祁建民,李延坤,等.煙草SRAP和ISSR分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[J].作物學(xué)報,2008,34(11):1958-1963.

[7]孫建,張艷欣,車卓,等.我國江淮產(chǎn)區(qū)主要芝麻品種的SRAP指紋圖譜分析[J].中國油料作物學(xué)報,2009,31(1):9-13.

[8]蹇黎,朱利泉.寒蘭品種類型的SRAP分子鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(15):3184-3190.

[9]謝文剛,張寶藝,張新全,等.鴨茅雜交種SRAP分子標(biāo)記鑒定及遺傳分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(16):3288-3295.

[10]彭建營,束懷瑞，孫仲序，等.中國棗種質(zhì)資源的RAPD分析[J].園藝學(xué)報,2000,27(3):171-176.

[11]趙新亮,郭靄光.利用SRAP分子標(biāo)記劃分玉米自交系類群初探[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2007,16(3):77-81.

[12]宋健,高妍,韓明玉,等.桃果肉顏色,離粘核性狀的SSR標(biāo)記[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,17(4):234-237.

[13]張春平,何平,何俊星,等.ISSR分子標(biāo)記對金蕎麥8個野生居群的遺傳多樣性分析[J].中草藥,2010(9):1519-1522.

[14]王莉花,殷富有,劉繼梅,等.利用RAPD分析云南野生蕎麥資源的多樣性和親緣關(guān)系[J].分子植物育種,2004,2(6):807-815.

[15]許瑾,周小梅,范玲娟,等.蕎麥RAPD指紋圖譜的建立及在品種鑒定中的應(yīng)用[J].山西大學(xué)學(xué)報:(自然科學(xué)版),2006,29(2):194-197.

[16]Tikhonov A P, SanMiguel P J, Nakajima Y, et al. Colinearity and its exceptions in orthologous adh regions of maize and sorghum[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(13): 7409-7414.

[17]Agrawal G K,Yamazaki M,Kobayashi M,et al. Screening of the rice viviparous mutants generated by endogenous retrotransposon tos17 insertion. Tagging of a zeaxanthin epoxidase gene and a novel OsTATCGene[J]. Plant Physiology,2001,125(3): 1248-1257.

(編輯：武英耀)

Developed specific-markers and sequence analysis related with specific loci among 40 cultivars of Buckwheat by SRAP-PCR molecular marker system

Wang Li1, Sun Zhaoxia1, Liu Ronghua1, Hou Siyu1,2*, Li Hongying1,2,Han Yuanhuai1,2,3, Huang Kesheng1,4

(1.SchoolofAgronomy,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.InstituteofAgriculturalBiotechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 3.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China; 4.ZhejiangA&FUniversity,Hangzhou311300，China)

[Objective]Most of these Buckwheat cultivars, its seeds were heterozygosity because of their selfing incompatibility. Hence, it has important product value and reality significance that developed molecular marker to identify different varieties of Buckwheat cultivars and seeds purity.[Methods]According to these DNA polymorphism loci among 40 Buckwheat cultivars through SRAP-PCR system, we recycled and resequenced these different DNA loci, and analyzed their sequence character by bioinformation method.[Results]8 DNA polymorphism loci were cloned. Only 2 loci could find forward and reverse primer sequences and single primer in any other loci. So the 2 loci sequence were named 8801-1 and Mhua 5. The sequence length of 8801-1 was 705bp, and included 3 restriction Enzyme cutting site. 1 ORF domain was predicted in this sequence. Through BLASTP analysis, it had not find any homologous protein with this sequence. The sequence length of Mhua5 was 687bp, and included 3 restriction Enzyme cutting site. 2 ORF domain was predicted in this sequence. Through BLASTP analysis, there was 71% homology between the ORF2 in buckwheat and retrotransposon pol protein inArabidopsisthaliana.[Conclusion]The results suggested that this sequence could be included a retrotransposon element of gene. In summary, we have got 2 special DNA loci related with 2 Buckwheat cultivars. One locus included retrotransposon element, anther locus was redundancy genome sequence. We hope to develop the 2 loci for STS markers, and apply them to analyze genetic diversity, and identify seeds purity, and construct genetic mapping and marker-assisted selection (MAS) of Buckwheat cultivars.

Buckwheat, Molecular marker assisted selection, SRAP-PCR, Sequence analysis

2016-09-19

2016-11-11

王麗(1992-)，女(漢)，山西忻州人，碩士，研究方向：分子遺傳育種

*通訊作者：侯思宇，副教授，碩士生導(dǎo)師。Tel:18635068055 ；E-mail:bragren123@126.com

國家自然科學(xué)基金(NSFC:31301385)；山西省科技攻關(guān)項目(20150311007-1)

S515;Q94

A

1671-8151(2016)12-0879-06