武彩娟，蘇彥冰，程璐，王釔杰，元旭朝，高煒，李紅英,2,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031； 3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太谷030801)

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谷子硒結(jié)合蛋白基因及其與抗旱性的關(guān)系

武彩娟1，蘇彥冰1，程璐1，王釔杰1，元旭朝1，高煒1，李紅英1,2,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031； 3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太谷030801)

[目的]土壤與肥料中的硒元素進入植物體后，與植物中的蛋白質(zhì)和活性有機成分結(jié)合成為植物有機硒，即植物硒結(jié)合蛋白。本研究以硒結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)，探索其與谷子抗旱的關(guān)系。[方法]以谷子耐旱品種勾勾母雞咀(GG)和干旱敏感品種晉汾16(JF16)為試材，以轉(zhuǎn)錄組中硒結(jié)合蛋白基因家族中10個基因為對象，利用生物信息學(xué)分析其基因組基本信息、基因間親緣關(guān)系及啟動子順式元件，并對Seita.4G100300基因進行表達水平分析。[結(jié)果]發(fā)現(xiàn)谷子硒結(jié)合蛋白基因家族中基因啟動子上游1 500 bp的調(diào)控元件具有響應(yīng)脅迫的多種功能(ABA、Ethylene、GA、MeJA、Light、MYB、SA、熱和低溫等)；經(jīng)過干旱處理，Seita.4G100300基因在GG和JF16中表達水平均增加，且其在耐干旱品種GG中表達水平的增幅顯著大于干旱敏感品種JF16。[結(jié)論]谷子硒結(jié)合蛋白基因家族在氨基酸序列和表達模式方面具有較為豐富的多樣性。本研究有助于我們理解硒結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為進一步研究硒結(jié)合蛋白與植物抗逆性關(guān)系提供理論依據(jù)。

谷子；硒結(jié)合蛋白；抗旱性

谷子(Setariaitalica)，為禾本科狗尾草屬植物，也稱小米、粟，是重要的小雜糧作物，富含氨基酸、脂肪酸和礦物質(zhì)等，在人們的生活中起重要作用[1，2]。據(jù)統(tǒng)計，我國約有三分之一的土地處于干旱區(qū)[3]，范圍廣、持續(xù)時間長的干旱對我國北方農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。雖然谷子是抗旱作物，但是干旱也會嚴(yán)重影響谷子的產(chǎn)量，例如谷子灌漿期處于干旱天氣時，會出現(xiàn)大量秕谷，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[4]。目前關(guān)于干旱與谷子關(guān)系的研究主要集中在性狀、產(chǎn)量、基因鑒定及其在干旱脅迫下的表達分析等方面[5，6]。

硒(Selenium)是人體必需的重要微量元素之一，是保持機體平衡的抗氧化劑；硒結(jié)合蛋白(Selenium-binding protein)是硒元素在體內(nèi)的存在形式，其在腫瘤治療方面起重要作用[7]。在15 % PEG-6000脅迫下，亞硒酸鹽能夠促進小麥種子萌發(fā)與硒提高萌發(fā)種子的干旱脅迫抗性有關(guān)[8]。但目前還沒有谷子硒結(jié)合蛋白基因與其抗旱性關(guān)系的相關(guān)報道，本研究對谷子硒結(jié)合蛋白基因進行生物信息學(xué)分析，了解其基本信息，以便進行后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 研究材料

耐旱品種GG(勾勾母雞咀)和干旱敏感品種JF16(晉汾16)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

GG和JF16置于14 h光照28 ℃/10 h黑暗23 ℃的人工氣候室中培養(yǎng)，出苗21 d后，進行20 % PEG-6000干旱脅迫0.5 h，用蒸餾水處理0.5 h做對照，兩者均隨機取3株幼苗并提取RNA，進行表達譜分析。

1.2 研究方法

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在NCBI中查找玉米硒結(jié)合蛋白基因編號gi|413957085|gb|AFW89734.1|，得到硒結(jié)合蛋白氨基酸序列，利用Blast search尋找谷子中硒結(jié)合蛋白基因的基本信息，利用http://web.expasy.org/compute_pi/ 預(yù)測硒結(jié)合蛋白的理化性質(zhì)，利用MEGA 7.0進行氨基酸序列的多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/進行啟動子元件分析；利用SPSS 軟件對啟動子順式元件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子硒結(jié)合蛋白基因基本信息及理化性質(zhì)分析

由表1可見，本文研究的10個硒結(jié)合蛋白基因中，最多只有1個內(nèi)含子，大部分基因均沒有內(nèi)含子；10個基因分布在7條染色體上，其中1、2、5號染色體分別分布2個基因，其余均分布1個基因；氨基酸數(shù)目為548～695 aa，平均602.1 aa；CDS序列長度為1 647～2 088 bp，平均1 809.3 bp，且基因Seita.7G139500 的CDS序列長度與氨基酸序列長度均最長，基因Seita.1G301800的CDS序列長度與氨基酸序列長度均最短；硒結(jié)合蛋白基因等電點為5.99～8.59，平均7.763；蛋白質(zhì)分子量為58 903.80～68 350.96 kDa，平均為66 257.109 kDa。

表1 谷子硒結(jié)合蛋白基因的基本信息及蛋白的理化性質(zhì)

2.2 谷子硒結(jié)合蛋白基因家族系統(tǒng)進化樹

從圖1看出，硒結(jié)合蛋白基因家族大致分為兩類，其中Seita.2G405600、Seita.1G301800、Seita.2G031700、Seita.7G139500、Seita. 4G100300、Seita. 5G295500為一類，其余為另一類。其中，Seita.2G405600與Seita.1G301800處于同一分支，其親緣關(guān)系較近；Seita.2G031700與Seita.7G139500處于另一分支，其親緣關(guān)系較近。

圖1 谷子硒結(jié)合蛋白基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of selenium-binding family in foxtail millet

2.3 谷子硒結(jié)合蛋白基因家族啟動子元件及功能

利用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/對硒結(jié)合蛋白基因啟動子上游1 500 bp進行啟動子元件分析,結(jié)果見表2。由表2可知，硒結(jié)合蛋白基因的順式作用元件具備多種脅迫響應(yīng)的功能(ABA、MeJA、Ethy、GA、MYB、SA)。

根據(jù)谷子硒結(jié)合蛋白基因家族啟動子順式元件預(yù)測(表3)，得出所有基因均含具有Light(光響應(yīng))功能的調(diào)控元件，其中基因Seita.5G295500具有Light功能的調(diào)控元件最少，數(shù)量為5，而基因Seita.5G124400具有Light功能的調(diào)控元件最多，數(shù)量高達26；除Seita.4G100300，其他基因均具有與干旱相關(guān)MYB結(jié)合位點功能的調(diào)控元件，其中40%的基因均含3個具有MYB功能的作用元件；除Seita.5G295500 和Seita.1G191400，其他基因均含2～8個具有MeJA(茉莉酸甲酯)功能的調(diào)控元件；60%的基因含具有ABA(脫落酸)功能的響應(yīng)元件；50%的基因含具有SA(水楊酸)功能的調(diào)控元件，且此調(diào)控元件數(shù)量為1或2；僅有40%的基因含具有熱響應(yīng)功能的調(diào)控元件，其中此作用元件的數(shù)量僅為1或2；只有Seita.4G100300基因含具有Ethy(乙烯)功能的調(diào)控元件，其他均無。

表2 谷子硒結(jié)合蛋白基因啟動子順式作用元件

Table 2 Cis-acting elements in promoters of selenium-binding protein genes in foxtail millet

功能Function調(diào)控序列名稱Nameofregulatorysequence核心序列CoresequenceABAABREGCCGCGTGGCMeJACGTCA-motifCGTCATGACG-motifTGACGEthyEREATTTCAAAGAGARE-motifAAACAGATATC-boxTATCCCAP-boxCCTTTTGMYBMBSCAACTGMREAACCTAASACCAAT-boxCAACGGTCA-elementGAGAAGAATA熱響應(yīng)HSEAGAAAATTCG脅迫響應(yīng)TC-richrepeatsATTCTCTAAC厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)ARETGGTTTGC-motifCCCCCG低溫響應(yīng)LTRCCGAAA熱響應(yīng)HSEAAAAAATTTC

2.4 谷子硒結(jié)合蛋白基因在干旱脅迫下的表達模式

用20 % PEG-6000模擬干旱脅迫，處理GG和JF16，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達譜結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GG和JF16基因組中均含1個硒結(jié)合蛋白基因(Seita.4G100300)，此硒結(jié)合蛋白基因在GG和JF16的表達模式見圖2。由圖2可知，在澆水與干旱條件下，Seita.4G100300基因在GG和JF16中均表達。在正常澆水狀況下，Seita.4G100300基因在JF16中表達水平高于GG;而在干旱脅迫下，Seita.4G100300基因在JF16中相對表達水平低于GG。經(jīng)過干旱處理，此基因在GG和JF16中表達水平均相應(yīng)增加，但其在耐干旱品種GG的表達水平增幅顯著大于干旱敏感品種JF16。

表3 谷子硒結(jié)合蛋白基因家族具有抗逆相關(guān)功能的啟動子順式元件數(shù)目預(yù)測

Table 3 The prediction of number of cis-acting elements with functions related to stresses in selenium-binding protein genes in foxtail millet

基因名稱Gene與脅迫有關(guān)調(diào)控元件的功能FunctionsofregulatoryelementsrelatedtostressABAEthyGAMeJALightMYBSA熱響應(yīng)Heatstressresponsiveness低溫響應(yīng)Low-temperatureresponsiveness脅迫響應(yīng)DefenseandstressresponsivenessSeita.4G10030021222100102Seita.8G25050000041320000Seita.2G40560010041730002Seita.5G12440070322630000Seita.5G2955001010530010Seita.1G19140000001122011Seita.2G03170000141121210Seita.7G13950030041832100Seita.6G05960010221412002Seita.1G30180000181841100

注：以上數(shù)據(jù)不包括基本啟動子元件TATA-box和CAAT-box。

Note: The data does not include the basic promoter elements such as TATA-box and CAAT-box.

圖2 GG和JF16硒結(jié)合蛋白基因的表達模式Fig.2 Expression profiles of selenium-binding genes in GG and JF16

圖3 谷子硒結(jié)合蛋白基因家族啟動子順式元件聚類分析Fig.3 Clustering analysis for cis-acting elements of the promoterin selenium-binding protein genes in foxtail millet

3 結(jié)論與討論

利用SPSS 軟件對預(yù)測的谷子硒結(jié)合蛋白基因家族啟動子順式元件進行聚類分析(圖3)，使具有相似時空表達活性特征的基因聚到一起，進而揭示基因生物學(xué)功能的相似性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Seita.2G405600和Seita.8G250500基因聚集，Seita.7G139500和Seita.1G301800基因聚集，Seita.5G295500和Seita.1G191400基因聚集，這些相互聚集的基因可能具有相似的抗逆響應(yīng)。而據(jù)谷子硒結(jié)合蛋白基因家族系統(tǒng)進化樹(圖1)，得出Seita.2G405600和Seita.1G301800基因親緣關(guān)系相近，Seita.7G139500和Seita.2G031700基因親緣關(guān)系相近，Seita.5G295500和Seita.4G100300基因親緣關(guān)系相近。根據(jù)氨基酸序列得到的親緣關(guān)系與根據(jù)啟動子順式元件預(yù)測得到的聚類分析的結(jié)果不一致。這是因為氨基酸序列會反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性，而啟動子調(diào)控元件則反映啟動子對多種因子的響應(yīng)和基因表達活性。氨基酸序列相似的基因其啟動子序列可能不同，則其蛋白質(zhì)表達時空模式就不同。因此，谷子硒結(jié)合蛋白基因家族在氨基酸序列和表達模式方面(從啟動子特征推測)具有較為豐富的多樣性。

在干旱脅迫下，硒能夠刺激作物產(chǎn)生抗氧化劑，減少植物氧化導(dǎo)致的損傷，提高作物葉綠素含量，調(diào)節(jié)植物水分狀況等，從而可以使處于干旱脅迫下作物的品質(zhì)和產(chǎn)量均得到改善[9,10]。但其只是從生理生化水平對硒及作物抗旱的關(guān)系進行研究，尚未進行分子機理的研究。本試驗發(fā)現(xiàn)谷子具有硒結(jié)合蛋白基因，而且在干旱脅迫下(同正常澆水相比)，谷子硒結(jié)合蛋白基因家族成員中Seita.4G100300基因在耐干旱品種GG中表達水平的增幅顯著大于干旱敏感品種JF16(圖2)，這可能是由于抗旱品種中較多的硒結(jié)合蛋白在干旱脅迫時發(fā)揮了重要保護作用，但仍需后續(xù)對其他干旱和敏感品種進行廣泛而深入的研究以確定其功能。

綜上所述，本研究通過對谷子硒結(jié)合蛋白基因進行生物信息學(xué)分析，并對硒結(jié)合蛋白基因成員中的一個基因進行表達水平分析，有助于我們理解硒結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為硒結(jié)合蛋白與植物抗逆性關(guān)系研究提供理論基礎(chǔ)。

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(編輯：馬榮博)

Selenium-binding protein gene family and its relationship with drought tolerance in foxtail millet

Wu Caijuan1, Su Yanbing1, Cheng Lu1, Wang Yijie1, Yuan Xuzhao1, Gao Wei1, Li Hongying1,2,3*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.KeyLabaratoryofCropGeneResourcesandGermplamEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China; 3.ShanxiKeyLaboratoryofGeneticResourcesandGeneticImprovementofMinorCrops,Taigu030801,China)

[Objective]Selenium in soil and fertilizer becomes selenium-binding protein when it is absorbed by plants and then combined with proteins and active organic ingredients.Based on the structure and function of selenium-binding protein, the study explored the relationship between it and drought tolerance.[Methods]In the study, drought tolerant variety (GG) and drought sensitive variety (JF16) were used as test materials, and 10 genes of selenium-binding protein gene family were studied. Using bioinformatics, the basic information of the genes, the genetic relationship among the genes and the cis-acting elements in promoters were analyzed. The expression pattern of theSeita.4G100300 gene was analyzed.[Results]It was found that the regulatory elements within the upstream 1500 bp in promoter of selenium-binding protein gene family in foxtail millet had the functions of responding to multiple stresses (ABA, Ethy, GA, MeJA, Light, MYB, SA,heat, low temperature). After drought tolerance, the expression levels ofSeita.4G100300 gene increased in both GG and JF16. And the rise of expression level in GG (drought tolerant variety) was significantly higher than that in JF16 (drought sensitive variety).[Conclusion]The selenium-binding protein gene family has rich diversity in the amino acid sequence and expression pattern. The study will help us to understand the structure and function of selenium-binding protein. And it will provide a theoretical basis for the further study of the relationship between selenium-binding protein and plant stress resistance.

Foxtail millet， Selenium-binding protein， Drought tolerance

2016-08-29

2016-10-14

武彩娟(1993-)，女(漢)，山西太原人，碩士研究生，研究方向：谷子抗旱機理

*通訊作者：李紅英，教授，博士生導(dǎo)師。Tel: 0354-6286680; E-mail: swgctd@163.com

國家自然科學(xué)基金(31471556)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2014022.2014YZ2-5)

S515；Q94

A

1671-8151(2016)12-0850-05