米怡，羅舒予，高建華*，王興春*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801)

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新Cry1B蛋白基因的篩選與鑒定

米怡1,2，羅舒予1，高建華1,2*，王興春1,2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801)

[目的]Cry1B類殺蟲蛋白對(duì)鱗翅目和鞘翅目昆蟲具有較好的殺蟲活性，具有廣闊的應(yīng)用前景。為進(jìn)一步挖掘并研究Cry1B類蛋白。[方法]本文使用一對(duì)引物對(duì)24個(gè)Bt菌株進(jìn)行定性PCR反應(yīng)，嘗試篩選新的cry1B基因。該引物能夠擴(kuò)增包括Cry1B蛋白N-端3個(gè)結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的718個(gè)氨基酸編碼序列。[結(jié)果]共有8個(gè)菌株包含cry1B基因，約占篩選菌株的33.3%。序列分析發(fā)現(xiàn)，獲得8個(gè)基因中有6個(gè)為新基因，其中6-1和15-1基因編碼氨基酸序列與Cry1Bd1完全相同；9-1、10-1、18-1、20-1和21-1對(duì)應(yīng)氨基酸序列與Cry1Bd1的一致性≥98.5%；而4-1基因編碼的氨基酸序列與Cry1Bb1和Cry1Bc1蛋白N-端僅差1個(gè)氨基酸，需要進(jìn)一步鑒定C-端長(zhǎng)尾的編碼序列以判斷其所屬亞類。[結(jié)論]本研究獲得6種新型Cry1B蛋白基因，為進(jìn)一步解析這類蛋白的殺蟲活性和機(jī)理提供了豐富的材料。

蘇云金芽孢桿菌；cry1B基因；基因篩選；序列分析

目前，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)表達(dá)的晶體殺蟲蛋白依然是轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的主要功能蛋白。其中，Cry1B類對(duì)鱗翅目的歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaeaoperculella)、菜粉蝶(Pierisrapae)、小蔗螟(Diatraeasaccharalis)等害蟲均具有良好的活性[1～5]；同時(shí)，Cry1Ba對(duì)馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)和咖啡果小蠹(Hypothenemushampei)等鞘翅目害蟲也具有一定殺蟲活性[1, 6]。根據(jù)已有報(bào)道，Cry1B在靶標(biāo)體內(nèi)的受體與常用的Cry1Ab、Cry1F、Cry9C不同[7～9]，不易產(chǎn)生交叉抗性。因此，該類蛋白具有較大的應(yīng)用潛力。

Cry1B類蛋白全長(zhǎng)約140 kDa。其N-端包含典型的三個(gè)結(jié)構(gòu)域(Domain I、II和III)，是主要的殺蟲區(qū)域；而C-端長(zhǎng)尾，用于促進(jìn)伴孢晶體的形成[10]。本研究設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，在24個(gè)Bt菌株中，篩選cry1B基因。共篩選出8個(gè)基因，并對(duì)其編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，為后期研究相應(yīng)氨基酸變化與殺蟲活性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文涉及的菌株包括：大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、24份Bt菌株。

本文涉及的分子生物學(xué)試劑包括：用于PCR反應(yīng)的Takara Premix Taq(貨號(hào)RR003A)；用于基因克隆的Takara pMD19載體(貨號(hào)6013)和天根大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量為Thermo Scientific GeneRuler 1 kb DNA Ladder(貨號(hào)#SM0313)；Takara限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI(貨號(hào)1010S和1078S)；質(zhì)粒提取使用天根快速質(zhì)粒小提試劑盒(貨號(hào)DP105)；DNA片段凝膠回收使用天根通用型DNA純化回收試劑盒(貨號(hào)DP214)。

1.2 方法

1.2.1cry1B基因的篩選

將Bt菌株28.5 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)過夜。將2 mL菌液放入離心管，然后12 000 r·min-1離心3 min，收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞用2 mL ddH2O重懸，作為PCR反應(yīng)的模板。使用引物1B-F(5＇-GGATCCATGACTTCAAATA GGAAAAATGAGA ATG)和1B-R(5＇-GAGCTCTTATAAGTTTCTTTCATCACTGAGTCG)進(jìn)行PCR反應(yīng)，預(yù)期大小約2.1 kb。反應(yīng)體系為2×Premix Taq 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板0.5 μL、最后加入11 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(包括95 ℃，40 s；58 ℃，40 s；72 ℃，2 min)；最后72 ℃，延伸10 min。

1.2.2cry1B基因的克隆及鑒定

將PCR產(chǎn)物割膠回收(按產(chǎn)品說明書操作)。然后將回收片段連接pMD19載體(總10 μL體系，包括：目的片段4 μL；pMD19-vector 1 μL；Solution I 5 μL)，16 ℃反應(yīng)過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。將獲得的克隆分別提取質(zhì)粒(按產(chǎn)品說明書操作)，并使用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切鑒定。最后，對(duì)鑒定正確的克隆，進(jìn)行測(cè)序和序列分析。

1.2.3 氨基酸序列同源性分析

將測(cè)序獲得的各個(gè)基因編碼氨基酸序列導(dǎo)入MEGA7，并與Cry1Ba1、Cry1Bb1、Cry1Bc1、Cry1Bd1、Cry1Bf1、Cry1Bg1和Cry1Bh1等7個(gè)已知的Cry1B類蛋白進(jìn)行比對(duì)。然后按照Neighbor-Joining法[11]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

使用引物1B-F和1B-R對(duì)24個(gè)Bt菌株進(jìn)行PCR篩選，預(yù)期大小約2.1 kb。篩選結(jié)果顯示，4號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、15號(hào)、18號(hào)、20號(hào)和21號(hào)菌株均為陽性，且擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致(圖1A)。

將上述8份PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和T-克隆。然后對(duì)相應(yīng)的克隆的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，每個(gè)PCR產(chǎn)物均獲得了正確的T-克隆(圖1B)。比如，圖1B中4號(hào)菌株的PCR產(chǎn)物T-克隆的兩個(gè)單克隆均正確，本文將其克隆基因命名為4-1和4-2基因，對(duì)應(yīng)編碼蛋白命名為4-1和4-2蛋白。其它菌株P(guān)CR產(chǎn)物的T-克隆基因和對(duì)應(yīng)編碼蛋白的命名以此類推。

圖1 cry1B基因的篩選(A)及PCR產(chǎn)物T-克隆的鑒定(B)Fig.1 Results of screening cry1B genes by PCR method (A) and the restriction map of T-clones of the putative cry1B genes

將正確的T-克隆測(cè)序，并將其編碼的蛋白質(zhì)序列與已知的Cry1B蛋白亞類N-端對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)(圖2A)并分析其親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，6-1、9-1、10-1、15-1和21-1等基因編碼蛋白與Cry1Bd1屬于一個(gè)分支；18-1和20-1蛋白屬于一個(gè)分支；而4-1蛋白與Cry1Bc1和Cry1Bb1更接近(圖2B)。進(jìn)一步進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，6-1和15-1氨基酸序列完全一致，且與Cry1Bd1蛋白N-端序列相同；10-1和9-1蛋白與Cry1Bd1蛋白N-端序列分別只有兩個(gè)氨基酸的差異；21-1蛋白與Cry1Bd1有3個(gè)氨基酸不同，相似性均大于99.5%。20-1和18-1蛋白之間有3個(gè)氨基酸不同，且與Cry1Bd1一致性分別為98.5%和98.6%，與Cry1Bh1相似性均約93%。4-1蛋白與Cry1Bc1和Cry1Bb1只有1個(gè)氨基酸不同。

圖2 新Cry1B蛋白特異位點(diǎn)示意圖(A, 三角形標(biāo)注)及其與已知蛋白親緣關(guān)系(B, Neighbor-Joining method[11])Fig.2 The phylogenetic tree of the Cry1B proteins

3 結(jié)論與討論

本文從24個(gè)菌株中篩選cry1B基因，獲得了8個(gè)陽性結(jié)果，占33.3%。8個(gè)cry1B基因中，7個(gè)編碼的氨基酸序列與Cry1Bd1高度相似，尤其是6-1和15-1與Cry1Bd1蛋白N-端序列完全一致。只有一個(gè)基因4-1編碼序列與Cry1Bb1和Cry1Bc1蛋白N-端高度相似，僅1個(gè)氨基酸不同。當(dāng)然，如果需要具體確認(rèn)這8個(gè)新基因的分類地位并命名，還需要進(jìn)一步確定其C-端序列。比如，Cry1Bb1和Cry1Bc1蛋白N-端序列完全相同，而C-端序列表現(xiàn)出較大差異。因此，根據(jù)本文測(cè)定的4-1基因序列暫時(shí)無法確定其與Cry1Bb1和Cry1Bc1的親疏關(guān)系。

本文報(bào)道的新基因豐富了Cry1B蛋白變異庫，為研究Cry1B蛋白活性和殺蟲機(jī)理提供了更多的材料。比如，18-1和20-1分支，與Cry1Bd1蛋白的主要氨基酸差異集中在蛋白的N-端(圖2A)。該區(qū)域在Cry蛋白激活時(shí)被切除[12]，因此與殺蟲活性關(guān)系可能較小。而其他4個(gè)新基因(不包括6-1和15-1)編碼氨基酸與相應(yīng)Cry1B蛋白的差異區(qū)域分別分布于結(jié)構(gòu)域I、II和III中(圖2A)，因此在殺蟲活性或靶標(biāo)識(shí)別上可能存在潛在差異。

綜上，本文通過篩選獲得了8個(gè)潛在的新型cry1B基因，將進(jìn)一步確定其完整基因的序列，從而確定其分類地位。另外，新基因的獲得對(duì)進(jìn)一步研究其殺蟲活性或機(jī)理提供了豐富的材料。

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(編輯：武英耀)

Screening and identification of novelcry1Bgenes

Mi yi1,2， Luo Shuyu1， Gao Jianhua1,2*， Wang Xingchun1,2*

(1.Collegeoflifescience,ShanxiAgriculturalUniversity,Shanxi030801,China, 2.InstituteofAgriculturalBioengineering,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]Cry1B toxins from Bt strains are toxic against some lepidoptera and coleopteran pests and therefore are good candidates for insect pest management. In this paper, we screened newcry1Bgenes from 24 Bt strains.[Methods]PCR method was used for new genes screening and the chosen primer pair can amplified the sequences encoding the 718 amino acids of N-terminal of Cry1B proteins.[Results]The results showed that about 33.3 per cent strains (8 of 24 strains) containedcry1Bgenes. Sequencing analysis revealed that 6-1 and 15-1 genes encodes same polypeptides as Cry1Bd1. And 9-1, 10-1, 18-1, 20-1 and 21-1 represented higher amino acid sequence identity than 98.5% with Cry1Bd1. There was only one amino acid difference between the deduced protein of 4-1 gene and N-terminal Cry1Bb1 or Cry1Bc1, so further identifying C-terminal encoding sequence would be necessary to conclude its classification.[Conclusion]In summary, we obtained 6 novelcry1Bgenes which can be ideal candidates for researching insecticidal activity and action mode of Cry1B proteins.

Bacillusthuringiensis，cry1Bgene, Gene screening, Sequence analysis

2016-09-21

2016-10-22

米怡(1992-)，女(漢)，山西運(yùn)城人，在讀碩士研究生，研究方向：Bt殺蟲蛋白殺蟲機(jī)理研究

*通訊作者：王興春，教授，博士生導(dǎo)師，Tel: 13593101640，E-mail：wxingchun@163.com；高建華，副教授，碩士生導(dǎo)師，Tel: 18235430887，E-mail：gaojh_edu@163.com

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601690)；山西省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015011080)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(2014015)

Q78

A

1671-8151(2016)12-0875-04