吳體智,盛乃娟,楊 麗,毛麗娟,王 川,吳 皓,劉 睿

(南京中醫(yī)藥大學,江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇南京 210023)

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雜色蛤中ACE抑制肽的分離鑒定與分子對接研究

吳體智,盛乃娟,楊 麗,毛麗娟,王 川,吳 皓,劉 睿*

(南京中醫(yī)藥大學,江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇南京 210023)

目的:建立一種快速、準確篩選雜色蛤酶解物中活性多肽的方法。方法:在ACE抑制活性導向下,以超濾技術與離子交換法對雜色蛤酶解物進行分離,確定ACE抑制活性多肽,通過質(zhì)譜分析與已有序列比對的方法,確定活性多肽的氨基酸序列;通過計算機模擬將多肽與ACE蛋白對接,篩選活性多肽,并確定其與ACE蛋白的作用位點。結(jié)果:共鑒定67個多肽,其中QIIVQDLTKR、LDYRPGDKFKGT、NTQIIVQDLTKR和LLFDRAPVNFGNYR這四個多肽能與ACE穩(wěn)定結(jié)合,ACE的Glu403為一重要的結(jié)合位點,且Ala356和Arg522對多肽與ACE的穩(wěn)定結(jié)合也產(chǎn)生了重要影響。結(jié)論:基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對接技術,建立從混合多肽中快速篩選、鑒定活性多肽的方法,明確活性多肽與ACE可能的結(jié)合位點,為后續(xù)的深入研究提供了依據(jù)和參考。

雜色蛤,ACE抑制肽,分子對接

雜色蛤(Ruditapesphilippinarum)是廣泛分布于江蘇沿海的一種重要雙殼經(jīng)濟貝類[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為其貝殼和軟體部份均可入藥,蛤蜊肉咸、冷、無毒,歸胃、肝、膀胱經(jīng),宋代《嘉祐本草》中關于蛤蜊有記載:“潤五臟,止消渴,開胃,解酒毒。主老癖能為寒熱者,及婦人血塊,宜煮食之”。現(xiàn)代研究表明蛤蜊酶解肽具有抗腫瘤、抗氧化、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性抑制等多種生物活性[2-4]。然而現(xiàn)階段對蛤蜊酶解肽這類生物活性肽進行分離、鑒定與評價的思路和方法較為缺乏[5]?；诖它c,本論文以中醫(yī)藥理論為依據(jù),結(jié)合超濾技術,離子交換法及串聯(lián)質(zhì)譜等現(xiàn)代技術方法來探尋和建立一種快速、準確地篩選雜色蛤酶解肽的方法,為中國沿海地區(qū)貝類中酶解肽活性的評價與研究提供實驗基礎與理論依據(jù),為優(yōu)化生物活性肽的分離鑒定及其活性評價方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雜色蛤軟體 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所提供,批號:201409;胰蛋白酶 北京索萊寶公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE，馬尿酰-組氨酰-亮氨酸HHL 美國西格瑪奧德里奇公司;乙腈 色譜級 Tedia company;甲酸 國產(chǎn)分析純 13020110155;超純水(實驗室自制),其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

BP 211D電子天平，BT1250D電子天平 德國Sartorious公司;JJ-2型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市榮光儀器制造公司;3-16PK高速冷凍離心機 德國Sigma公司;Mini Pellicon超濾系統(tǒng) 美國Merck Millipore公司;RotavaporR-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國BUCHI公司;Free zone 4.5 plus冷凍干燥機 美國Labconco公司;pHs-3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;Waters e2695 高效液相色譜儀 美國沃特斯公司;AKTA 900 蛋白質(zhì)純化儀 瑞典AKTA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ACE抑制活性測定方法 活性測定方法參照賈夢蛟等人的方法[6]。ACE與HHL溶液的配制:取適量ACE用0.1 mol/L含0.3 mol/L NaCl硼酸緩沖液(pH8.3)配成濃度為100 mU/mL 的ACE 溶液;取適量HHL用0.1 mol/L硼酸緩沖液(含0.3 mol/L NaCl pH8.3)配成濃度為5 mmol/L的HHL溶液;反應過程:將30 μL HHL和10 μL 樣品(或緩沖溶液)混勻后,于37 ℃環(huán)境下預熱5 min(37 ℃水浴),再加入20 μL的ACE 啟動反應,混勻后繼續(xù)于37 ℃環(huán)境下反應1 h(37 ℃水浴),然后迅速加入70 μL HCl(1 mol/L)終止反應,用高效液相色譜分析結(jié)果。用硼酸緩沖液代替樣品溶液做空白對照。

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱:SunFire-C18柱(2.1 mm×100 mm,3.5 μm,美國 Waters 公司);流動相:乙腈-0.5%甲酸水溶液,流速:0.5 mL/min;雙波長檢測:220 nm、254 nm;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。梯度洗脫條件:0～5 min,2%乙腈;5～25 min,2%～40%乙腈;25～30 min,40%乙腈。

ACE抑制率(%)=(1-樣品組的馬尿酸峰面積/空白組的馬尿酸峰面積)×100

1.2.2 IC50的計算 IC50即半數(shù)抑制濃度,表示抑制率為一半時樣品液的濃度,配置不同濃度的雜色蛤酶解物(μg/mL),測定ACE 抑制率,以 log(酶解物的濃度)為橫坐標,ACE抑制率(%)的概率單位為縱坐標,進行回歸分析得出回歸方程,計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。很明顯,IC50的值越小,其抑制作用越強。

1.2.3 雜色蛤酶解物的制備 將雜色蛤軟體洗凈泥沙,加入3倍量水煎煮2次,每次1 h,過濾,棄上清液,保留肉渣并瀝干稱重。取適量肉渣加3倍量水勻漿,加入胰蛋白酶進行酶解,加酶量為肉渣量的0.60%,溫度48 ℃、pH8.50,反應時間2 h。酶解結(jié)束后于沸水浴滅活15 min,然后于10000 r/min,4 ℃離心20 min,取上清液,備用。

1.2.4 雜色蛤活性酶解物的分離 將制備得的酶解液先經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜抽濾,然后順序透過截流分子質(zhì)量為3 ku和1 ku的平板膜,分別得到分子量>3 ku、1～3 ku和<1 ku的酶解產(chǎn)物。然后將酶解產(chǎn)物凍干,配成不同濃度的溶液,測定ACE抑制活性。然后將ACE抑制活性最好的一部分酶解產(chǎn)物過0.45 μm濾膜后經(jīng)AKTA 900 蛋白質(zhì)純化儀純化分段。對離子交換分離得到的各部位進行ACE抑制活性測定,篩選活性部位。

離子分段色譜條件:離子交換注:色譜填料,DEAE Sepharose Fast Flow;流動相:0.6 mol/L氯化鈉——水:流速:3 mL/min;進樣量:50 mL;檢測波長:254 nm,梯度洗脫條件:1 mol/L氯化鈉溶液0%(0～40 min),1 mol/L氯化鈉溶液0%～100%(40～140 min)。

1.2.5 活性多肽的鑒定——質(zhì)譜測序 將離子分段后所得活性最高的部分進行質(zhì)譜掃描,并結(jié)合de novo sequencing從頭測序軟件測定其中所含多肽的氨基酸序列。

數(shù)據(jù)庫比:串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer1.3 軟件,SEQUEST 搜庫,選擇軟體動物數(shù)據(jù)庫(Mollusca 2015年3月下載于www.uniprot.org)檢索參數(shù)設置為:前體離子誤差 10 ppm;子離子誤差 1 u;半胱氨酸殘基固定修飾(氨甲酰甲基化 57.021 5 u);甲硫氨酸殘基可變修飾(氧化+15.994 9 u);允許 2 個位點誤切,假陽性率(FDR)≤1%;酶切方式選擇胰蛋白酶酶切(trypsin);其他參數(shù)為默認參數(shù),在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(p<0.05)被認定為有效的鑒定結(jié)果。

1.2.6 分子對接 受體蛋白的準備:從PDB數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)中下載ACE-lisinopril 復合物(1O86.pdb)X 衍射三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(PDB code:1O86),依據(jù)此復合物確定抑制肽與ACE相互作用的結(jié)合位點,并利用Discovery Studio3.0 軟件處理該蛋白質(zhì):去除所有水分子,為蛋白加氫,去除Lisinopril配體,保留Zn2+和Cl-并優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

1.2.6.1 小分子配體的準備 用ChemBioDraw Ultra 13.0軟件繪制多肽的分子結(jié)構(gòu)式,用DS中Clean Geometry工具對其進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,然后再利用CHARMm工具對其進行能量優(yōu)化,準備好對接配體。

1.2.6.2 分子對接 將ACE蛋白定義為受體,準備好的多肽分子設為配體,按照對接程序,使用CDDOCK程序?qū)⑴潴w對接到受體中去。根據(jù)所得結(jié)果中-CDOCKER_ENERGY值判定最優(yōu)構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE抑制活性部位的分離

首先通過超濾分離將雜色蛤酶解物分為三段。如圖1所示,分離所得的三段酶解物均表現(xiàn)出一定的ACE抑制作用,其中以分子量小于1 ku部分的抑制效果最好,抑制率為37.44%,這與很多研究結(jié)果相一致[7-8],所以對分子量小于1 ku部分的酶解物進一步進行離子交換分離,共分離得到三段物質(zhì)(圖2)。如圖3所示,三段離子交換部位除D3段外,另外兩段均有明顯的ACE活性抑制作用,抑制率分別為:D1:77.01%,D2:61.65%。與未進行離子分段的酶解物的抑制率相比較,分段后所獲得的酶解物的抑制率顯著提高,這說明通過離子分段,雜色蛤活性酶解物的ACE抑制活性大大增強了。

圖1 雜色蛤酶解物超濾分離所得各段的ACE抑制曲線圖Fig.1 ACE inhibitory of clams hydrolysate separated by ultrafiltration

圖2 雜色蛤酶解物離子交換分段部位Fig.2 Parts of Clams hydrolysate supernatant separated by ion-exchange

圖3 雜色蛤酶解物離子交換所得各部分的ACE活性抑制曲線Fig.3 ACE inhibitory of clams hydrolysate separated by ion-exchange

經(jīng)計算知,D1段的IC50值為17.60 μg/mL遠小于D2段IC50值541.71 μg/mL,可知第一段的ACE抑制作用要比第二段的強很多(表1)。故選取離子分段后的第一段進行下一步的篩選研究。

表1 雜色蛤酶解物離子交換所得各部分的ACE活性抑制IC50值比較

Table 1 IC50of clams hydrolysate separated by ion-exchange

組別D1D2D3IC501760μg/mL54171μg/mL-

2.2 活性部位多肽的鑒定

通過質(zhì)譜分析,并結(jié)合數(shù)據(jù)庫比對與de novo sequencing從頭測序軟件分析,我們共得到1000多種多肽序列。我們選取-10lgP值≥40的多肽,de novo sequencing軟件分析獲得的多肽,選取ALC(%)值≥98的多肽,認為這些多肽的序列可信度更高,共得到67個多肽序列(見附件)。

2.3 活性多肽與ACE的分子對接

計算機分子對接技術現(xiàn)已廣泛應用于模擬分析生物活性物質(zhì)與藥物作用靶點的分子作用機制[9-12]。本實驗通過分子對接來進一步研究從雜色蛤活性酶解物中分離得到的具有高活性的ACE抑制肽對ACE酶抑制作用的分子機制。

ACE酶是一種含鋅的二羧肽酶,而鋅原子正處于一個包含多個氨基酸殘基的活性位點中。據(jù)文獻查閱可知[13],初步可確定的氨基酸殘基共有16種,分別為Arg522,His353,Ala354,Ser355,Ala356,Val380,His383,Glu384,His387,Glu411,Lys511,Phe512,His513,Val518,Tyr520,Tyr523。我們將鑒定所得的67個多肽序列全部進行分子對接,最終根據(jù)-CDOCKER_ENERGY值大小,共得到四個較優(yōu)的多肽序列,分別為QIIVQDLTKR,其-CDOCKER_ENERGY值為140.842;LDYRPGDKFKGT,其-CDOCKER_ENERGY值為150.135;NTQIIVQDLTKR,其-CDOCKER_ENERGY值為172.892;LLFDRAPVNFGNYR,其-CDOCKER_ENERGY值為183.785。在圖4中ABCD 四張圖分別顯示了這四個多肽與ACE相互作用的整體視圖,從圖中可以明顯看出,四個多肽均處于ACE蛋白的空腔中,周圍被氨基酸殘基緊緊包圍著,形成一個較穩(wěn)定的復合體。

圖4 多肽與ACE相互作用的整體視圖Fig.4 The overall view of interaction schemes between polypeptides and ACE(說明:1. 圖4、圖5、圖6中A代表多肽QIIVQDLTKR(分子量為1195.69 u),B代表多肽LDYRPGDKFKGT(分子量為1395.71 u),C代表多肽NTQIIVQDLTKR(分子量為1427.81 u),D代表多肽LLFDRAPVNFGNYR(分子量為1680.87 u);2. 圖6中親水氨基酸殘基用綠色表示,疏水氨基酸殘基用藍色表示)。

圖5中是四個多肽分別與ACE蛋白之間的氫鍵作用,多肽QIIVQDLTKR—共與ACE蛋白形成7個氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基有Asn66,His353,Ala356,Asn374,Tyr360,Glu384,Glu403;多肽LDYRPGDKFKGT共與ACE蛋白形成14個氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基分別是Glu403,Ala356,Glu384,Asn70,Ser517,Arg522,Ala354,His353,Glu162,Ala170,Asn285,Thr302,其中氨基酸殘基Arg522和Glu162均形成兩個氫鍵;多肽NTQIIVQDLTKR共與ACE蛋白形成13個氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基分別是Glu123,Glu403,Ser517,Thr166,Glu376,Tyr520,Ala356,Ala354,Arg522,Lys511,其中,Arg522形成3個氫鍵,Lys511形成2個氫鍵;多肽LLFDRAPVNFGNYR共形成7個氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基分別是Asn285,Asn374,Asp377,His353,Lys511,Glu403,其中氨基酸殘基Glu403形成兩個氫鍵。氫鍵作用是分子間較強的作用力,對兩分子間的相互作用有著極其重要的影響[14-15]。從以上參與氫鍵作用產(chǎn)生的氨基酸殘基分布來看,Glu403與四個多肽之間均產(chǎn)生了氫鍵作用,這說明Glu403對于形成的復合物的穩(wěn)定存在給予了極大的貢獻。而Glu403與多肽LLFDRAPVNFGNYR 之間產(chǎn)生了2個氫鍵作用,這也可能解釋了為什么多肽LLFDRAPVNFGNYR 與ACE蛋白之間只形成了7個氫鍵但其-CDOCKER_ENERGY值最高。同時,我們還發(fā)現(xiàn),Ala356與四個多肽中的3個產(chǎn)生了氫鍵作用,Arg522雖只與其中的2個多肽產(chǎn)生氫鍵作用,但是它分別與多肽11和多肽5產(chǎn)生了3個、2個氫鍵作用,并且管驍?shù)热说难芯縖15]發(fā)現(xiàn)Arg522是ACE活性位點中起重要作用的氨基酸殘基,郭慧青等人的研究[16]認為Ala356 與Arg522均對抑制肽與ACE之間相互作用產(chǎn)生重要影響,故我們推測Ala356 和Arg522也是導致多肽與ACE蛋白穩(wěn)定結(jié)合的兩個重要氨基酸殘基。

圖5 多肽與ACE間的氫鍵作用Fig.5 Hydrogen bonding interaction between polypeptides and ACE

圖6顯示的是四個多肽周圍的親水氨基酸與疏水氨基酸的分布,其中多肽QIIVQDLTKR與18個氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,與8個氨基酸殘基產(chǎn)生疏水作用,多肽LDYRPGDKFKGT與18個氨基酸產(chǎn)生親水作用,與6個氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,多肽NTQIIVQDLTKR與19個氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,7個氨基酸殘基產(chǎn)生疏水作用,多肽LLFDRAPVNFGNYR與18個氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,與4個氨基酸殘基產(chǎn)生疏水作用(見附件)。同時多肽自身含有大量的親水性基團(-COOH、-NH3、-CO-NH-、-CO-)也參與了分子間親水作用的形成,這些親水和疏水作用共同將多肽包裹在ACE蛋白空腔內(nèi),使得形成的復合物變得更加穩(wěn)定。此外,據(jù)前期文獻報道可知,活性肽的氨基酸序列對其活性有著重要影響[6,17]。當多肽N端含有較多的亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)等氨基酸,C端含有一些如精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等與ACE活性位點親和力較強的氨基酸時,能夠促進多肽與ACE的位點結(jié)合,是ACE抑制肽發(fā)揮活性的主要因素。而我們篩選得到的四個活性較高的多肽,其中有兩個在N端含有亮氨酸,三個在C端含有精氨酸,并且其中-CDOCKER_ENERGY值最高的多肽(LLFDRAPVNFGNYR)在N端連續(xù)含有兩個亮氨酸。這也再一次證明篩選得到的四個多肽可能有很強的ACE抑制活性。

圖6 多肽與ACE蛋白間的疏水作用和親水作用Fig.6 Hydrophobic and hydrophilic interaction between polypeptides and ACE

3 結(jié)論

本文研究通過超濾技術與離子交換法對雜色蛤活性酶解物進行分離純化,LC-MS/MS對純化后的活性部位鑒定,通過分子對接技術進一步研究篩選活性多肽,及多肽與ACE可能的作用位點。本文方法快速、準確的實現(xiàn)混合多肽中活性多肽的尋找、評價與作用方式,建立了一種快速篩選活性多肽的方法。結(jié)果表明,分離鑒定得到的多肽能夠與ACE中Glu403,Ala356,Arg522等主要活性位點的氨基酸殘基結(jié)合,對于促進活性多肽與ACE蛋白形成的復合物穩(wěn)定性有著重要影響。本文的方法為后續(xù)已知靶點的活性多肽的尋找與評價提供參考與借鑒。

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Separation and identification of ACE inhibitory peptides fromRuditapesphilippinarumand molecular docking

WU Ti-zhi,SHENG Nai-juan,YANG Li,MAO Li-juan,WANG Chuan,WU Hao,LIU Rui*

(Jiangsu key laboratory of research and development on marine bio-resource pharmaceutics, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

Objective:ToselectthebioactivepeptidesquicklyandaccuratelyfromRuditapes philippinarumhydrolysate.Methods:PeptidesfromRuditapes philippinarumhydrolysatecouldbeseparatedbyultrafiltrationandionexchangechromatographybasedontheACEinhibitoryassay-directfractionation.ThenaminoacidssequencesofpeptideswereidentifiedaccordingtotheMS/MSspectraandproteindatabase.InteractionmechanismbetweenthepeptidesandACEwasinvestigatedbymoleculardocking.Results:67peptideswereidentified,amongwhichfourpeptides,QIIVQDLTKR,LDYRPGDKFKGT,NTQIIVQDLTKRandLLFDRAPVNFGNYR,canbindtoACEstably.OurdockingresultsalsosuggestedthattheACEinhibitorypeptidesbindtoACEviainteractionswithGlu403,Ala356andArg522residuesandtheresidueGlu403mightbeasignificantbindingsite.Conclusions:thisstudycanquicklyselect,identifyandevaluatethebioactivepeptideswhilefindingpotentialbindingsitesbetweenbioactivepeptidesandACE,whichprovidesthebasisandreferenceforfurtherresearch.

Ruditapes philippinarum;ACEinhibitorypeptide;moleculardocking

2016-02-01

吳體智(1993-)，男，本科生，研究方向：藥物制劑，E-mail：2465724882@qq.com。

*通訊作者:劉睿(1982-)，男，博士，副研究員，研究方向：海洋藥物研究與開發(fā)，E-mail：liurui@njucm.edu.cn。

2013，2014國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201305007, 201405017) ；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程(PAPD)；江蘇省高等學校大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃；江蘇省青藍工程；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心資助。

TS254.9

A

1002-0306(2016)19-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.021