董小華， 申光輝， 王 佳， 馬 麗， 黎杉珊， 張志清

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

花椒籽：產(chǎn)地四川金陽；大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

酵母膏、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉、氯化鈉：成都市科龍化工試劑廠；胃蛋白酶 1∶3 000（比活力 1∶3 000～1∶3 500）：如吉生物科技；凝膠制備試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸：上海瑞永生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白：北京索萊寶有限公司。

CP225D型電子天平：德國賽多利斯股份公司；SW-CJ型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZQ-A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-3100型紫外-可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；BCD-224西門子冰箱：博西華家用電器有限公司；Gel Doc XR

天然抑菌物質(zhì)是傳統(tǒng)殺菌劑和抗生素的替代物研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞等有抑制作用，抗菌肽是其中一大類，它還可以有效抑制對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌[1]。由于天然物質(zhì)來源廣泛、成分復(fù)雜，要獲得抗菌肽單體還較困難[2]，國內(nèi)研究仍集中在抗菌肽的提取純化、抑菌活性和機(jī)理研究等方面。而從天然植物、動(dòng)物、微生物中，通過化學(xué)法、酶解法以及基因工程技術(shù)得到的抗菌肽，多為混合物質(zhì)發(fā)揮協(xié)同抑菌作用。對(duì)于抗菌肽來說，這類物質(zhì)具有各種各樣的結(jié)構(gòu)構(gòu)象特征，一方面它們有共性，如在中性pH一般為陽離子狀態(tài)，在與病原體膜作用時(shí)呈兩親特性[3]；另一方面，抗菌肽的同分異構(gòu)體之間的抗菌性能有所差異[4]。前處理因素（如實(shí)驗(yàn)原料的儲(chǔ)藏、離心、緩沖液、干燥等）[5]、分離純化過程中抗菌肽某種氨基酸的變化或者三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞都會(huì)影響到后續(xù)所得活性肽的得率、穩(wěn)定性、活性以及實(shí)驗(yàn)操作的可重復(fù)性，但目前還沒研究這些因素對(duì)其的影響，而在菌體保藏、食品品質(zhì)以及蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)等方面的研究表明，儲(chǔ)藏條件、冷凍條件以及其他處理對(duì)蛋白質(zhì)、食品的性質(zhì)等有不同程度的影響。

本研究所采用的實(shí)驗(yàn)原料為花椒籽蛋白酶解物，為了最大限度地保持生物活性和穩(wěn)定性，制備時(shí)采用真空冷凍干燥，而在整個(gè)過程中仍存在多種因素可能會(huì)引起蛋白質(zhì)變性[6]，如預(yù)冷凍的方式和溫度。冷凍可能使蛋白質(zhì)變性，目前對(duì)魚類以及豆類蛋白質(zhì)的冷凍變性的探究比較多，鄧敏[7]、胡亞芹[8]、董開成[9]等分別研究了不同凍結(jié)、預(yù)凍方式對(duì)草魚、帶魚、小黃魚的影響，通過相應(yīng)指標(biāo)的測定，表明不同的凍結(jié)方式對(duì)魚蛋白質(zhì)的變性程度不一樣。王玲等[10]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白（SPI）隨著冷凍溫度降低和冷凍時(shí)間延長，其游離巰基、二硫鍵含量及表面疏水性逐漸減少，冷凍過程中SPI大部分的分子內(nèi)二硫鍵轉(zhuǎn)化為分子間二硫鍵。

課題組前期從花椒 （Zanthoxylum bungeanum Maxim）籽（椒目）中制備得到了具有一定抗菌活性的抗菌肽[11]，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其存在抗菌活性不穩(wěn)定、酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量不確定等問題。作者在上述研究基礎(chǔ)上，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為受試菌種，旨在探究酶解物制備過程中低溫冷凍以及不同分子段對(duì)其自身性質(zhì)及兩種試驗(yàn)菌的抑菌活性的影響。型凝膠成像儀：Bio-Rad公司；超濾離心管（截留相對(duì)分子質(zhì)量 3 000、10 000）：Millipore。

1.2 方法

1.2.1 花椒籽粗酶解物制備 花椒籽粗酶解物（以下簡稱粗酶解物）的制備參照姜太玲等的方法[12]。本研究中由400 g花椒籽所提粗酶解物液 （50 mL）為一組進(jìn)行預(yù)凍。

1.2.2 低溫和分子量對(duì)酶解物抑菌活性、巰基含量的影響

1）冷凍溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌活性的影響：分別將等量粗酶解物液分別置于溫度為 （-70±1）℃，（-50±1） ℃，（-20±1） ℃，（-15±1） ℃下冷凍 12 h，取出迅速置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥（溫度維持在55℃左右）至樣品無結(jié)晶冰后取出，分別置于相應(yīng)溫度下保存?zhèn)溆谩y定酶解物的抑菌率、巰基含量等指標(biāo)，分析酶解物相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。

2）凍融次數(shù)對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌活性的影響：將粗酶解液分別凍融 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 次， 在-20℃下冷凍6 h，在常溫下融化至酶解液達(dá)到常溫即進(jìn)行下一次冷凍。樣品經(jīng)真空冷凍干燥后備用。

3）不同相對(duì)分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物抑菌活性分析：分別取不同溫度冷凍下的粗酶解物進(jìn)行超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量分別為＜3 000、3 000～10 000、＞10 000的酶解物，真空冷凍干燥后備用。

1.2.3 分析指標(biāo)測定

1）花椒籽粗酶解物抑菌率的測定：參照GB 15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和QB/T 2738-2012日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評(píng)價(jià)方法[13-14]，采用平板計(jì)數(shù)法測定抑菌活性和抑菌率（%）。具體參考姜太玲等[11]的方法。

2）花椒籽粗酶解物SDS-PAGE分析：利用SDS-PAGE比較不同冷凍溫度處理得到的粗酶解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。

3）花椒籽粗酶解物巰基質(zhì)量摩爾濃度測定：參考Tang[15]和陳茜茜[16]的方法進(jìn)行測定酶解物的巰基質(zhì)量摩爾濃度。巰基質(zhì)量摩爾濃度公式如下：

-SH 質(zhì)量摩爾濃度（μmol/g）=73.53×A412×D/C其中，D為稀釋系數(shù) （溶液總體積/樣品體積）；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）；73.53=1/13 600（由摩爾消光系數(shù) 13 600 L/（mol·cm）計(jì)算而得）。

4）花椒籽粗酶解物的溶解性分析：參考張立娟的方法，并做一定的修改[17]。溶解性公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對(duì)花椒籽酶解物抑菌活性的影響

2.1.1 不同冷凍溫度處理對(duì)酶解物溶解性的影響溶解度是蛋白質(zhì)最重要的功能特性之一，溶解度的高低往往決定了蛋白質(zhì)其他功能特性的強(qiáng)弱[18]。由圖1可知，-15℃處理產(chǎn)物的溶解性最好，為85.71%；其次是-70℃和-50℃處理產(chǎn)物，分別為83.43%和82.31%，但三者之間差異不顯著；-20℃處理產(chǎn)物的溶解性最低，為77.22%，顯著低于其他三組（p＜0.05）。說明低溫處理對(duì)酶解物的溶解性無顯著影響。

圖1 不同冷凍溫度處理后酶解物的溶解性Fig.1 Solubility of hydrolysate after different freezing temperature treatment

2.1.2 不同冷凍溫度處理對(duì)酶解物蛋白質(zhì)條帶比較分析 由圖2可以看出，不同冷凍溫度處理酶解物的SDS-PAGE條帶基本一樣，主要有4條較明顯的條帶，相對(duì)分子質(zhì)量分布近似，說明冷凍溫度沒有引起酶解物分子間變性。

2.1.3 不同冷凍溫度處理對(duì)酶解物巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響 由表1可以看出，-15℃冷凍處理的酶解物巰基質(zhì)量摩爾濃度最高，顯著高于其他組（p＜0.05）；其次為-20 ℃和-50 ℃組，它們之間差異不顯著（p＞0.05）；-70℃組最低，顯著低于其它三組（p＜0.05）。 與-15℃相比，-20℃組總巰基和活性巰基分別下降 5.14、4.57 μmol/g，-50 ℃分別下降 5.0、4.17 μmol/g，-70 ℃分別下降 7.82、6.95 μmol/g。 不同冷凍溫度處理的酶解物的總巰基和活性巰基質(zhì)量摩爾濃度均隨著溫度的降低呈下降趨勢。鄭子懿等[19]研究發(fā)現(xiàn)，面條在冷凍過程中不同蛋白質(zhì)組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)分子巰基和二硫鍵發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。而在冷凍過程形成的冰晶可能使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能會(huì)暴露出某些功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)改變會(huì)引起巰基位置的變化，同時(shí)蛋白質(zhì)中的活性巰基易被氧化生成二硫鍵[20]。本實(shí)驗(yàn)也說明低溫對(duì)酶解物巰基質(zhì)量摩爾濃度有影響，而不同冷凍溫度處理的酶解物蛋白質(zhì)條帶一致，它們之間的相對(duì)分子質(zhì)量沒有區(qū)別，這說明減少的巰基可能被氧化形成分子內(nèi)二硫鍵，對(duì)酶解物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而影響對(duì)微生物的抑制作用。

2.1.4 不同冷凍溫度處理對(duì)酶解物抑菌率的影響由表2可以看出，不同溫度處理的酶解物對(duì)E.coli的抑菌率大小順序?yàn)椋?15℃＞-50℃＞-20℃＞-70℃，且-15℃和-70℃冷凍處理的酶解物的抑菌率分別與其他三組差異顯著（p＜0.05），-20℃和-50℃之間差異不顯著。對(duì)S.aureus的抑菌率大小順序?yàn)椋?15℃＞-50℃＞-70℃＞-20℃，且-15℃、-50℃和-70℃之間差異不顯著（p＞0.05），但-20℃顯著低于其它三組（p＜0.05）。

圖2 不同冷凍溫度處理后粗酶解物的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of hydrolysate after different freezing temperature treatment

表1 不同冷凍溫度處理后酶解物總巰基、活性巰基質(zhì)量摩爾濃度Table 1 Total and active sulfydryl content of hydrolysate after different pre -freezing temperature treatment

根據(jù)QB/T 2738-2012日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14]可知，抑菌率在50%～90%時(shí)產(chǎn)品有抑菌作用，抑菌率≥90%時(shí)產(chǎn)品有較強(qiáng)抑菌作用。由此可知，不同冷凍溫度處理的酶解物對(duì)兩受試菌均具有抑菌作用。冷凍溫度對(duì)抑菌率有所影響，隨著溫度的降低，對(duì)兩受試菌的抑制率也隨之降低。大量研究表明，抗菌肽對(duì)熱穩(wěn)定性好，一般在100℃下處理15 min甚至30 min依然保持較高抑菌活性[21]，本研究說明，酶解物中的抗菌肽成分對(duì)低溫也有一定的耐受性，但抗菌肽作為活性蛋白質(zhì)，不同于某些植物抗凍蛋白[22]，而且不同來源和不同分離純化方法得到的抗菌肽分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性對(duì)高溫和低溫的穩(wěn)定性也有所不同。

根據(jù)2.1.1和2.1.3分析可知，不同溫度冷凍的酶解物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用可能與巰基質(zhì)量摩爾濃度變化有關(guān)，因?yàn)橹参锓烙馗缓腚装彼?，所以推測作用位點(diǎn)在于未被氧化的半胱氨酸。而對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用可能與其可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，蛋白質(zhì)溶解性越高，說明肽鏈所暴露的極性基團(tuán)越多，發(fā)揮抑菌作用越強(qiáng)。另外，溶解的蛋白質(zhì)在菌體表面成膜密集，對(duì)菌體作用也越強(qiáng)烈[23]。

表2 不同冷凍溫度處理后酶解物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌率Table 2 Bacteriostatic rate of hydrolysate to E.coli and S.aureusafterdifferentfreezing temperature treatment

2.2 反復(fù)凍融對(duì)花椒籽酶解物抑菌活性的影響

2.2.1 反復(fù)凍融處理對(duì)酶解物抑菌率的影響 由于蛋白質(zhì)溶液多在-20℃冷凍以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，選擇-20℃冷凍的酶解物作為反復(fù)凍融對(duì)大腸桿菌的抑菌作用影響的研究對(duì)象。由圖3可以看出，不同凍融次數(shù)的酶解物對(duì)大腸桿菌的抑菌率均高于60%。經(jīng)凍融的酶解物與未經(jīng)凍融的差異并不顯著（p＞0.05），說明反復(fù)凍融對(duì)酶解物的抑菌率無顯著影響，這與郝剛的研究結(jié)果一致。有研究指出，抗菌肽對(duì)低溫雖然有一定的耐受力，但隨著凍融次數(shù)的增加，抑菌作用有所下降，可能是在低溫條件下形成的細(xì)小冰晶對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，因此，對(duì)樣品不宜反復(fù)凍融[24]。

圖3 反復(fù)凍融處理的酶解物對(duì)大腸桿菌的抑菌率Fig.3 Bacteriostatic rate of hydrolysate to E.coli after multigelation treatment

圖4 反復(fù)凍融處理的酶解物的溶解性Fig.4 Solubility of hydrolysate after multigelation treatment

2.2.2 反復(fù)凍融處理對(duì)酶解物溶解性的影響 由圖4可知，凍融兩次的酶解物溶解性顯著低于未經(jīng)凍融組（p＜0.05），而其它組與未經(jīng)凍融組的差異不顯著（p＞0.05），不同凍融次數(shù)的酶解物的溶解性之間差異不顯著（p＞0.05）。說明凍融不影響花椒籽酶解物中可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，反復(fù)凍融并沒有引起酶解物變性。

2.2.3 反復(fù)凍融處理對(duì)酶解物巰基質(zhì)量摩爾濃度的影響 由表3可知，-20℃冷凍的酶解物的總巰基質(zhì)量摩爾濃度和活性巰基質(zhì)量摩爾濃度均比表2高，可能由于樣品處理時(shí)間和操作的誤差導(dǎo)致的?？梢钥闯觯瑑鋈趦纱蔚拿附馕飵€基質(zhì)量摩爾濃度顯著低于其他處理，這可能與其溶解性有關(guān)。隨著凍融次數(shù)的增加，巰基質(zhì)量摩爾濃度均呈降低趨勢，減少的巰基可能在凍融過程中被氧化形成二硫鍵，但2.2.1和2.2.2結(jié)果表明，凍融并不影響其可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抑菌能力?？妆ＨA[25]等研究表明，隨著凍融次數(shù)的增加，肌原纖維蛋白的ATP酶活性、巰基質(zhì)量摩爾濃度、熱穩(wěn)定性明顯逐漸降低，凝膠形成能力明顯下降，說明酶解液在冷凍過程中仍不適宜反復(fù)凍融。

表3 反復(fù)凍融處理的酶解物總巰基、活性巰基質(zhì)量摩爾濃度Table 3 Total and active sulfydryl content of hydrolysate after multigelation treatment

2.3 不同相對(duì)分子質(zhì)量段的酶解物的抑菌率及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，-15℃處理的酶解物對(duì)兩受試菌的作用效果與2.1的結(jié)果相似。3種分子段的酶解物對(duì)E.coli和 S.aureus的的抑菌率大小順序均為：＜3 000、3 000～10 000、＞10 000，其中＞10 000 對(duì)S.aureus無抑菌作用；-20℃處理的不同分子段的酶解物對(duì)E.coli的抑菌率大小順序?yàn)椋? 000～10 000、＜3 000、＞10 000， 其中＞10 000 的酶解物無抑菌作用；對(duì)S.aureus的抑菌率大小順序?yàn)椋海? 000、3 000～10 000、＞10 000，其中＞10 000 無抑菌作用；-50℃處理的酶解物與-20℃的作用效果相似；-70℃處理的酶解物對(duì)E.coli的抑菌率大小順序?yàn)椋海? 000、＞10 000、3 000～10 000，其中＜3 000 的有較強(qiáng)抑菌作用，3 000～10 000和＞10 000的有抑菌作用；對(duì)S.aureus的抑菌率大小順序?yàn)椋海? 000、3 000～10 000、＞10 000。4 種冷凍溫度處理的酶解物蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)同一種趨勢：（＞10 000）＞（3 000～10 000）＞（＜3 000）。 對(duì)比表 1 可知，經(jīng)超濾后的相對(duì)分子質(zhì)量段酶解物抑菌率遠(yuǎn)高于同一溫度下未經(jīng)超濾的粗酶解物，說明經(jīng)過超濾膜截留分離后，大分子雜蛋白質(zhì)越來越少，小肽以及其它小分子物質(zhì)增多，不同分子段能發(fā)揮抑菌作用的物質(zhì)不同，這也是不同相對(duì)分子質(zhì)量段酶解物抑菌率不同的原因。張順亮等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，＞10 000相對(duì)分子質(zhì)量的牛骨膠原蛋白源抑菌肽組分沒有抑菌能力，這可能是因?yàn)槎嚯牡南鄬?duì)分子質(zhì)量較大，具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，不易與細(xì)菌發(fā)生作用；＜10 000相對(duì)分子質(zhì)量的組分具有較好的抑菌活性。

表4 不同相對(duì)分子質(zhì)量酶解物的抑菌率及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 Bacteriostatic rate and protein contentof hydrolysate with different molecular weight

研究表明，蛋白質(zhì)水解物的平均相對(duì)分子質(zhì)量是決定其生物學(xué)性質(zhì)最重要的因素之一，蛋白肽組分的理化性質(zhì)、功能特性與其相對(duì)分子質(zhì)量大小有關(guān)[27]。鄧成萍等[28]研究發(fā)現(xiàn)，隨著大豆多肽段相對(duì)分子質(zhì)量的降低，其溶解性、抗氧化性和ACE抑制活性呈增加趨勢。祝婧等研究也發(fā)現(xiàn)，海鱸魚膠原蛋白肽不同相對(duì)分子質(zhì)量組分的理化特性存在顯著差異，其功能特性和相對(duì)分子質(zhì)量分布有密切關(guān)系?；ń纷训鞍捉?jīng)酶解成不同相對(duì)分子質(zhì)量的混合物質(zhì)，肽鏈某些位點(diǎn)可能斷開，暴露某些基團(tuán)或氨基酸，使得不同相對(duì)分子質(zhì)量段的酶解物對(duì)同種受試菌株的抑菌性能不同。馮小強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖抑菌活性高于高相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖。殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量越小，越容易進(jìn)入細(xì)胞壁的空隙結(jié)構(gòu)內(nèi)，干擾細(xì)胞的新陳代謝而達(dá)到殺菌目的。另外，我們發(fā)現(xiàn)不同冷凍溫度下不同相對(duì)分子質(zhì)量的粗酶解物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用規(guī)律并不一致。一方面，可能因?yàn)椴煌鋬鰷囟犬a(chǎn)生交互影響；另一方面，抑菌物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的作用機(jī)理不一樣。

3 結(jié)語

隨著冷凍溫度的降低，花椒籽粗蛋白酶解物的活性巰基和總巰基質(zhì)量摩爾濃度降低，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率也降低，-15℃處理的酶解物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率最高，分別為78.24%和72.46%。反復(fù)凍融并不影響抑菌率，均在60%以上，但是隨著凍融次數(shù)的增加，活性巰基和總巰基質(zhì)量摩爾濃度會(huì)降低。-15℃和-70℃冷凍處理的酶解物對(duì)大腸桿菌的抑菌率最高的為相對(duì)分子質(zhì)量小于3 000的酶解物，-20℃和-50℃的則為相對(duì)分子質(zhì)量在3 000～10 000的酶解物；4種冷凍溫度對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌率最高的均為相對(duì)分子質(zhì)量小于3 000的酶解物，相對(duì)分子質(zhì)量大于10 000的酶解物對(duì)金黃色葡萄球菌并沒有抑菌作用。這為花椒籽蛋白酶解物在制備過程中冷凍條件的探討提供一定的理論基礎(chǔ)。