王 芳,曹錦軒,潘道東,孫楊贏,周昌瑜,徐 嬌

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

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肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌活性及其機(jī)理

王 芳,曹錦軒*,潘道東,孫楊贏,周昌瑜,徐 嬌

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

本文利用濾紙片法和二倍稀釋法分別測(cè)定了肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)來(lái)評(píng)估肉桂精油對(duì)其的抑菌活性,通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡探究肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的形態(tài)影響,以及通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞膜的完整性和膜電位來(lái)共同闡釋肉桂精油對(duì)兩種菌活性抑制的機(jī)理。結(jié)果表明肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制作用,且對(duì)腐生葡萄球菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于成團(tuán)泛菌的抑制作用;肉桂精油改變細(xì)胞的形態(tài)、增加膜的通透性、破壞了膜的完整性、并造成了細(xì)胞內(nèi)容物的泄露、膜電位的降低,從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。

肉桂精油,成團(tuán)泛菌,腐生葡萄球菌,抑菌效果,抑菌機(jī)理

肉桂是樟科植物肉桂的樹(shù)皮或者桂皮,樹(shù)皮芳香,可作香料使用,主要分布在中國(guó)、印度、越南、老撾等地區(qū)[1]。肉桂精油是由桂皮、桂葉、桂枝等提取而得,一般為黃色或琥珀色液體。研究表明,肉桂油具有強(qiáng)烈的抑制或殺死微生物的特性,可以作為天然食品防腐保鮮劑。Oussalah等[2]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油對(duì)李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有很強(qiáng)的抑制能力,MIC均小于0.05%。此外,李京晶等[3]將肉桂精油與常見(jiàn)的化學(xué)防腐劑作了對(duì)比探討,采用體外抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示肉桂精油的MIC是0.2～1.6 mg/mL,而山梨酸鉀及苯甲酸鈉的MIC為6.4～25.6 mg/mL。李揚(yáng)蘋等[4]報(bào)道了肉桂精油對(duì)香莢蘭根腐病尖鐮孢菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑制效果,且抑制率可達(dá)99.74%和100%。顧仁勇等[5]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油可以有效的抑制枯草芽孢桿菌、青霉、酵母、黑曲霉和大腸桿菌的活性,抑菌圈直徑在20.6～49.6 mm之間。上述研究表明,關(guān)于肉桂精油的抑菌活性研究主要集中在李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等,而其對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌活性研究相對(duì)較少,其抑制機(jī)理尚未被明確闡述。

生物胺具有潛在的毒性,若人體內(nèi)生物胺的含量積累到一定程度,就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用,如引起血管膨脹、偏頭痛、高血壓,導(dǎo)致嘔吐、腹痛和腹瀉等[6]。組胺是對(duì)人類健康危害最大的生物胺,其次是酪胺。組胺中毒可引起頭暈、皮膚瘙癢、惡心和低血壓[7]。酪胺被認(rèn)為是一種主要的誘變劑,可誘發(fā)呼吸衰竭、心悸、濕疹、高血壓等疾病的發(fā)生[8]。此外,多胺如腐胺、尸胺、精胺和亞精胺能與亞硝酸鹽發(fā)生作用生成亞硝胺等雜環(huán)類致癌物質(zhì)從而威脅人們的健康[9]。如何控制產(chǎn)生物胺細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,減少食品中生物胺的含量,從而提高食品的品質(zhì)及安全性顯得尤為重要。

因此,本研究以生鮮豬肉香腸中產(chǎn)生物胺的成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌為研究對(duì)象,通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)來(lái)評(píng)估肉桂精油對(duì)其的抑菌活性,然后通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡來(lái)探究肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的形態(tài)影響,以及通過(guò)測(cè)定細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞膜的完整性和膜電位來(lái)共同闡釋肉桂精油對(duì)兩種菌活性抑制的機(jī)理。本研究為提高食品安全性以及開(kāi)發(fā)天然的抗菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomeransstrain GS 1)及腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticusstrain CIFT MFB 5247(7)) 浙江省動(dòng)物蛋白精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離,生工生物工程技術(shù)(上海)股份有限公司鑒定出來(lái)的產(chǎn)生物胺菌;100%純度肉桂單方精油,萃取部位(蒸餾樹(shù)皮) 上海卓典食品香料有限公司;羅丹明123 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;吐溫80 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)。

H-2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司;S-3400N掃描電鏡 Hitachi公司;JEM-1230透射電鏡 日本JEOL公司;YXQ-LS-50A高壓滅菌鍋 西安常儀儀器設(shè)備有限公司;Infinite 200酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;HSW型智能恒溫恒濕箱 寧波江南儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備方法 甘油保藏的成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基中活化2～3代后,吸取1 mL菌液接種到盛有100 mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中,將含有成團(tuán)泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(120 r/min)培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中(120 r/min)培養(yǎng)24 h,然后分別于4 ℃ 8000 r/min離心20 min后,收集菌體,用0.1 mol/L,pH為7.2的磷酸鹽(PBS)緩沖液清洗三次,然后用0.85%無(wú)菌生理鹽水洗滌三次后離心,將菌體重新懸浮于0.85%無(wú)菌生理鹽水中,用平板菌落記數(shù)的方法制備成107cfu/mL的菌懸液,備用。

1.2.2 抑菌圈(DIZ)的測(cè)定 參考Tepe等[10],用濾紙片法來(lái)測(cè)定抑菌圈的大小。吸取100 μL的菌懸液然后均勻地涂布于有固體LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面,無(wú)菌鑷子夾取一個(gè)直徑為7 mm的已滅菌的圓形濾紙片,置于每個(gè)培養(yǎng)基的中央,將10 μL肉桂精油滴加到濾紙片表面,將含有成團(tuán)泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后用游標(biāo)卡尺來(lái)測(cè)定抑菌圈的直徑大小,每種細(xì)菌做三個(gè)重復(fù)。以常用的抗生素(1.35 mg/mL的注射用硫酸鏈霉素溶液)為細(xì)菌抑菌實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。抑菌圈實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考黃曉冬等[11]。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 參考閆紹悅等[12]的方法略作修改,采用試管雙倍稀釋法,將肉桂精油用1%吐溫80稀釋成16、8、4、2、1、0.5 μL/mL的肉桂精油溶液,然后分別加入事先裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的小試管中,使其最終濃度為8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL。再向各個(gè)試管中加50 μL的菌懸液,充分混勻,將含有成團(tuán)泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)試管中液體的渾濁程度來(lái)判定精油的MIC值(液體澄清,無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)),以1%的吐溫80做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在MIC值的基礎(chǔ)之上,取50 μL的混合菌懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基上,將含有成團(tuán)泛菌的LB液體培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將含有腐生葡萄球菌的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,無(wú)菌落生長(zhǎng)的精油濃度即為MBC值。

1.2.4 掃描電鏡觀察肉桂精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響 參考Kumar等[13]的方法略作修改。向已制備好的107cfu/mL的菌懸液中分別加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),充分混勻后,成團(tuán)泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h,8000 r/min離心15 min,棄去上清液,用0.1 mol/L,pH為7.2的PBS緩沖液漂洗三次,每次10 min,依次用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液進(jìn)行脫水,每次10 min,然后用無(wú)水乙醇洗兩次,每次10 min。接著依次用3∶1,1∶1以及1∶3的無(wú)水乙醇和叔丁醇的混合溶液來(lái)逐級(jí)脫水10 min,最后用100%的純叔丁醇來(lái)脫水兩次,每次10 min,加少量純叔丁醇來(lái)覆蓋樣品,放在4 ℃冰箱里,冷凍干燥,樣品噴金,用掃描電鏡(S-3400N,Hitachi)來(lái)觀察。

1.2.5 透射電鏡觀察肉桂精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的影響 參照Yi,S.M[14]的方法并稍作修改。

固定:向已制備好的107cfu/mL的菌懸液中分別加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),充分混勻后,成團(tuán)泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用3 h,8000 r/min離心15 min,棄掉上清液,然后將沉淀的菌體轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中,再次離心15 min后,將沉淀菌體在3%的戊二醛中固定2 h,用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液漂洗15 min,重復(fù)三次,離心棄去上清,再用1%的鋨酸固定2 h,離心棄去上清,用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液漂洗15 min,重復(fù)三次。

脫水:依次用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液脫水15 min,離心丟棄上清后,用90%的丙酮溶液處理15 min。

浸透:用無(wú)水丙酮浸泡15 min,重復(fù)三次。然后用1∶1的包埋劑與丙酮的混合液,室溫浸泡l h,再用2∶1的包埋劑與丙酮的混合液,室溫浸透24 h,最后使用純包埋劑處理1 h。

包埋:將樣品放在包埋塊兒的槽子前部,加過(guò)包埋劑后,在37 ℃恒溫箱內(nèi)放24 h。然后取出來(lái)包埋塊,于45 ℃恒溫箱里聚合14 h,再轉(zhuǎn)移到60 ℃恒溫箱里聚合24 h。

表1 肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌的DIZ、MIC和MBC的影響

Table 1 Effects of diameter of inhibition zone(DIZ),minimum inhibitory concentration(MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of cinnamon essential oil againstPantoeaagglomeransandStaphylococcussaprophyticus

切片:用超薄的切片機(jī)割成70 nm的超薄片,銅網(wǎng)撈片之后要自然晾干。

染色:用鉛染液與醋酸鈾枸緣酸來(lái)雙染色。

電鏡觀察:用日本的JEM-1230透射電鏡來(lái)觀察并挑選典型的樣品拍片。

1.2.6 細(xì)菌細(xì)胞膜通透率的測(cè)定 參考Kong 等[15]的方法略作修改,將已制備好的107cfu/mL的菌懸液在5000 r/min離心15 min,棄去上清液,然后用5%的葡萄糖(C6H12O6)溶液來(lái)清洗菌懸液,使得菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率幾乎和5%的C6H12O6一樣為止,此時(shí)的菌懸液為等滲菌液。接著向5%的C6H12O6里加肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),充分混勻后,立即測(cè)其相對(duì)電導(dǎo)率,記為L(zhǎng)1;成團(tuán)泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h,每2 h取出來(lái)測(cè)其相對(duì)電導(dǎo)率,記作L2。最后將在5%的C6H12O6中懸浮的菌液在沸水浴中加熱5 min后冷卻,測(cè)其相對(duì)電導(dǎo)率記作L0。相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式如下:

相對(duì)電導(dǎo)率(%)=100×(L2-L1)/L0

1.2.7 細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響 參考Du等[16]的方法,將制備好的菌懸液在5000 r/min下離心10 min,棄上清液,菌體用0.1 mol/L,pH為7.2的PBS緩沖液沖洗3次后重新懸浮于此磷酸鹽緩沖液中,加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),成團(tuán)泛菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h;腐生葡萄球菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用4 h后,8000 r/min離心5 min,取上清液于石英酶標(biāo)板中,在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定其吸光度[17]。蛋白質(zhì)含量及還原糖含量的測(cè)定參考Xu 等[18]的方法進(jìn)行。

1.2.8 細(xì)菌膜電位的測(cè)定 參考Novo等[19]的實(shí)驗(yàn)方法并稍作修改,在備好的107cfu/mL的菌懸液中分別加入不同濃度的肉桂精油(0 MIC、1 MIC和1 MBC),150 r/min振搖3 h后5000 r/min離心10 min棄上清液,菌體用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液沖洗3次。用乙醇將羅丹明123粉末配成濃度為1 mg/mL的母液,分別加到菌懸液中,使其最終濃度為5 μg/mL,避光孵育45 min后,10000 r/min離心5 min,用0.1 mol/L,pH7.2的PBS緩沖液沖洗兩次后重新懸浮,然后用流式細(xì)胞儀通過(guò)激光通道FL1進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行差異性分析(p<0.05),并用Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈直徑、MIC和MBC

肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑大小、最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知,肉桂精油作用于成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的抑菌圈直徑大小分別為20.78 mm以及28.16 mm,MIC均為0.5 μL/mL,MBC分別為2 μL/mL和1 μL/mL。

抑菌圈大小、MIC和MBC是評(píng)價(jià)精油抑菌效果的常用指標(biāo)[20]。Zhang等[20]報(bào)道了肉桂精油對(duì)常見(jiàn)的食品腐敗菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有很好的抑菌效果,抑菌圈直徑分別為19.2 mm和28.7 mm,MIC均為1.0 mg/mL,MBC分別為4.0 mg/mL和2.0 mg/mL。肉桂醛是肉桂精油的主要成分[21],Prabuseenivasan等[22]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛有抑菌、防腐及抗氧化的特性。本研究結(jié)果顯示,肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌都有很強(qiáng)的抑菌作用,很可能是肉桂精油中的肉桂醛抑制了這兩種菌的活性;本研究還發(fā)現(xiàn)肉桂精油對(duì)腐生葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)的抑菌效果明顯好于成團(tuán)泛菌(革蘭氏陰性菌),這與Bagamboula等[23]的結(jié)果類似,這可能是由于革蘭氏陰性細(xì)菌存在的高脂多糖含量的雙層膜結(jié)構(gòu),革蘭氏陽(yáng)性菌的單層膜結(jié)構(gòu)使得肉桂精油更容易侵入。

2.2 掃描電鏡觀察肉桂精油對(duì)細(xì)菌壁膜的影響

肉桂精油對(duì)細(xì)菌壁膜影響的掃描電鏡結(jié)果如圖1所示,由圖1A可知,未經(jīng)肉桂精油處理的成團(tuán)泛菌(A1)呈現(xiàn)典型的短桿狀,菌體表面平整光滑,形態(tài)完好。添加1 MIC肉桂精油處理3 h后(A2),一部分細(xì)胞形態(tài)遭到破壞,菌體發(fā)生了扭曲變形,部分菌體的表面出現(xiàn)了明顯的凹陷褶皺或孔洞。添加1 MBC肉桂精油作用3 h后(A3),菌體細(xì)胞壁膜的破壞程度更嚴(yán)重,出現(xiàn)明顯凹陷褶皺或孔洞的菌體數(shù)量明顯增多。由圖1B可知,無(wú)肉桂精油添加的腐生葡萄球菌(B1)細(xì)胞表面光滑、平整,外觀呈飽滿的圓球狀,菌體形態(tài)完好,折光性好。添加1 MIC肉桂精油處理3 h(B2)后,菌體表面不平整,形態(tài)也遭到了破損,添加1 MBC肉桂精油作用3 h后(B3),菌體的形態(tài)破損更加嚴(yán)重。由此可知,肉桂精油對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞都有破壞作用。掃描電鏡圖可以從形態(tài)學(xué)方面來(lái)表明肉桂精油的抑菌機(jī)制。

圖1 成團(tuán)泛菌(A1、A2、A3)和腐生葡萄球菌(B1、B2、B3)的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microphotographs of Pantoea agglomerans(A1、A2、A3) and Staphylococcus saprophyticus(B1、B2、B3)注:A1、B1:對(duì)照組;A2、B2:1 MIC肉桂精油處理3 h;A3、B3:1 MBC肉桂精油處理3 h，圖2同。

2.3 透射電鏡觀察肉桂精油對(duì)細(xì)菌壁膜的影響

肉桂精油對(duì)細(xì)菌壁膜影響的透射電鏡結(jié)果如圖2所示,由圖可知,未經(jīng)肉桂精油處理的成團(tuán)泛菌(A1)細(xì)胞形態(tài)完好,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密,細(xì)胞質(zhì)均勻。添加1 MIC肉桂精油處理3 h后(A2),細(xì)胞質(zhì)分布開(kāi)始出現(xiàn)不均勻,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破損,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)低密度空白區(qū)。繼續(xù)加大肉桂精油濃度為1 MBC作用3 h后(A3),菌體細(xì)胞壁膜的破損非常嚴(yán)重,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大面積的低密度空白區(qū)。無(wú)肉桂精油添加的對(duì)照組(B1)腐生葡萄球菌的細(xì)胞質(zhì)均勻,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密,細(xì)胞膜完整,清晰可見(jiàn)。添加1 MIC肉桂精油處理3 h后(B2),菌體表面出現(xiàn)了皺縮,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布不均勻,出現(xiàn)了低電子密度區(qū),當(dāng)1 MBC精油濃度作用3 h后(B3),細(xì)胞壁與細(xì)胞膜開(kāi)始出現(xiàn)模糊不清,細(xì)胞內(nèi)有大面積的低電子密度空白區(qū)。結(jié)果表明,肉桂精油對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的破壞作用,且作用效果與精油的濃度有關(guān),這與掃描電鏡的變化相呼應(yīng)。

圖2 成團(tuán)泛菌(A1、A2、A3)和腐生葡萄球菌(B1、B2、B3)的透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microphotographs of Pantoea agglomerans(A1、A2、A3) and Staphylococcus saprophyticus(B1、B2、B3)

2.4 肉桂精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響

肉桂精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果如圖3所示。隨著肉桂精油濃度的增大,成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加(p<0.05);隨著肉桂精油作用時(shí)間的延長(zhǎng),成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加(p<0.05)。由圖3A可知,從0～4 h,未經(jīng)肉桂精油處理(Control)的成團(tuán)泛菌菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率由0.2%增加至4.77%,其增加幅度較小。而分別加入1 MIC、1 MBC濃度的精油后,成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率分別增加至41.2%和56.63%。由圖3B可知,當(dāng)分別加入1 MIC、1 MBC濃度的精油后,成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率分別增加至65.67%和75.66%。

Diao等[24]研究指出正常的細(xì)菌結(jié)構(gòu)選擇性透過(guò)H+、K+、Na+等小分子物質(zhì),此作用使得細(xì)菌生存于穩(wěn)定的H+、K+、Na+等離子濃度環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn),成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌菌懸液的相對(duì)電導(dǎo)率隨著肉桂精油濃度的增大而增加,這與Zhang等[20]研究結(jié)果類似。這種現(xiàn)象很可能是肉桂精油作用于細(xì)胞膜,使得電解質(zhì)大量泄漏影響細(xì)菌的正常代謝,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

圖3 肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌(A)及腐生葡萄球菌(B)細(xì)胞膜通透性的影響Fig.3 Effects of cinnamon essential oil on the permeability of cell membrane of Pantoea agglomerans(A) and Staphylococcus saprophyticus(B)注:大寫字母代表不同處理組之間的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05);小寫字母代表不同時(shí)間點(diǎn)之間的差異性,字母不同表示差異顯著(p<0.05)，圖4同。

2.5 肉桂精油對(duì)細(xì)菌膜完整性的影響

表2 肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌的內(nèi)容物釋放的影響Table 2 Effects of cinnamon essential oil on cell constituents’ release of tested Pantoea agglomerans and Staphylococcus saprophyticus

注:同一列的字母不同代表差異顯著(p<0.05)。不同濃度的肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知,隨著精油濃度的增大,成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌菌液的OD260 nm、蛋白質(zhì)和還原糖的含量顯著增加(p<0.05)。與對(duì)照組相比,當(dāng)添加1 MIC肉桂精油時(shí),成團(tuán)泛菌菌液中的OD260 nm、蛋白質(zhì)和還原糖分別增加至6.30、4.31和3.61倍;而當(dāng)肉桂精油濃度為1 MBC時(shí),成團(tuán)泛菌菌液中的OD260 nm、蛋白質(zhì)和還原糖分別增加至14.62、9.75和5.12倍。與成團(tuán)泛菌類似,未經(jīng)肉桂精油處理(Control)的腐生葡萄球菌,OD260 nm吸光度值較低,蛋白質(zhì)以及還原糖的含量也不高,當(dāng)添加1 MIC肉桂精油時(shí),腐生葡萄球菌菌懸液中的OD260 nm、蛋白質(zhì)和還原糖分別增加至7.68、4.23和4.04倍,然而當(dāng)添加1 MBC肉桂精油后,腐生葡萄球菌菌懸液中的OD260 nm、蛋白質(zhì)和還原糖分別增加至14.08、6.76和5.24倍。

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量和OD260 nm吸光度值可以反映細(xì)胞內(nèi)容物的泄露情況,進(jìn)而推測(cè)細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性[25]。細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和核酸,它們是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)組分。本研究結(jié)果顯示,肉桂精油破壞了成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性,可能是由于肉桂精油造成了細(xì)胞膜的不可逆損傷,引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸及還原糖物質(zhì)的釋放,進(jìn)而可致細(xì)胞死亡,這與Diao等[24]的研究一致。

2.6 肉桂精油對(duì)細(xì)菌膜電位的影響

圖4 肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌及腐生葡萄球菌膜電位的影響Fig.4 Effects of cinnamon essential oil on the membrane potential of Pantoea agglomerans and Staphylococcus saprophyticus

從圖4可知,隨著肉桂精油濃度的增大,成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的平均熒光強(qiáng)度顯著降低(p<0.05);腐生葡萄球菌的平均熒光強(qiáng)度顯著低于成團(tuán)泛菌的平均熒光強(qiáng)度(p<0.05)。其中,未經(jīng)肉桂精油處理(Control)的成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的平均熒光強(qiáng)度分別為34.15 AU和19.44 AU。當(dāng)添加1 MIC肉桂精油時(shí),成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的菌懸液的平均熒光強(qiáng)度分別下降了55.64%和56.12%,而當(dāng)肉桂精油濃度為1 MBC時(shí),成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的平均熒光強(qiáng)度分別下降了91.41%和86.38%。

膜電位指的是生物膜內(nèi)外的電勢(shì)差,它作為一個(gè)質(zhì)子動(dòng)力元件,可參與ATP的形成[26]。膜電位在細(xì)菌的生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用[27],例如細(xì)菌膜電位的改變可以引起細(xì)胞代謝活動(dòng)的變化。本研究結(jié)果顯示,添加肉桂精油可以顯著降低成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球的平均熒光強(qiáng)度,這與張赟彬等[28]的發(fā)現(xiàn)相符,平均熒光強(qiáng)度的降低表明細(xì)胞膜產(chǎn)生去極化,干擾了細(xì)菌的正常代謝,從而使細(xì)菌死亡。

3 結(jié)論

本研究顯示肉桂精油對(duì)成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌均有明顯的抑菌作用,且抑菌效果:腐生葡萄球菌>成團(tuán)泛菌;肉桂精油改變了成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài),破壞了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性,增加了細(xì)胞膜的通透性,使得細(xì)胞膜電位降低,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸和還原糖發(fā)生了泄漏,影響了細(xì)菌的正常代謝活動(dòng),導(dǎo)致其死亡。本研究為開(kāi)發(fā)天然、高效的成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌的抑制劑,提高食品安全性提供了理論依據(jù)。

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Bacteriostatic activity and mechanism of cinnamon essential oil againstPantoeaagglomeransandStaphylococcussaprophyticus

WANG Fang,CAO Jin-xuan*,PAN Dao-dong,SUN Yang-ying,ZHOU Chang-yu,XU Jiao

(Ocean University,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Bacteriostaticactivitywasevaluatedbymeansoftheinhibitionzonediameterswithfilterpaperandminimuminhibitoryconcentration(MIC)andminimumbactericidalconcentration(MBC)bythedoubledilutionmethod.Inaddition,theantibacterialmechanismaccordingtoscanningelectronmicroscopy,transmissionelectronmicroscopy,cellmembranepermeabilityandintegrityandmembranepotentialwerediscussed.Resultsindicatedthatcinnamonessentialoilexhibitedsignificantinhibitionoftwotestedstrains,andStaphylococcus saprophyticuswasmoreeffectivethanPantoea agglomerans.Furthermore,cinnamonessentialoilcouldcauseseveredamagetocellmicrostructure,cellwallandcellmembrane,enhancingthemembranepermeability,leadingtotheleakageofcellularmaterials,resultinginbacterialdeath.

cinnamonessentialoil;Pantoea agglomevans;Staphylococcus saprophyticus;bacteriostaticactivity;antibacterialmechanism

2016-03-01

王芳(1989-)，女，碩士研究生，主要從事畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制研究，E-mail：15728046548@163.com。

*通訊作者:曹錦軒(1982-)，男，博士，副研究員，主要從事畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制研究，E-mail：caojinxuan@nbu.edu.cn。

寧波市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2012B82017);國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2013GB2C200191);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471681)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0075-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.006