張 瑤,周麟依,趙城彬,林海晶,吳 非

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

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水浴法與微波法制備SPI-DX復(fù)合物乳化性質(zhì)的對比研究

張 瑤,周麟依,趙城彬,林海晶,吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

本文采用水浴法和微波法制備大豆蛋白-葡聚糖(SPI-DX)復(fù)合物,比較與分析了復(fù)合物功能特性和二級結(jié)構(gòu)。采用OPA法測定復(fù)合物的接枝度,采用紫外分光光度法測定復(fù)合物的褐變程度。結(jié)果表明,微波法能夠使更多的葡聚糖與SPI發(fā)生美拉德反應(yīng),降低復(fù)合物的褐變程度。由兩種方法得到的SPI-DX復(fù)合物溶解性、乳化性都有所改善,傳統(tǒng)水浴法較微波法對復(fù)合物溶解性、乳化性改善效果好。復(fù)合物的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲的含量都降低,但β-折疊結(jié)構(gòu)含量卻增加,SPI與DX發(fā)生了葡聚糖糖化反應(yīng)。

大豆蛋白,葡聚糖,微波,美拉德反應(yīng)

葡聚糖是一種中性多糖,具有較好的水溶性和穩(wěn)定性,在高濃度時因具有低粘度的特點而被廣泛研究[1]。除此之外,葡聚糖不帶電荷的特點也避免了靜電作用的影響[2]。大豆蛋白因其具有豐富的營養(yǎng)價值以及功能特性成為廣大學(xué)者的研究焦點。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)與多糖之間的美拉德反應(yīng)可以提高一些蛋白質(zhì)的功能性質(zhì),如溶解性、乳化性、起泡性以及凝膠性質(zhì)等[3],因此,采用美拉德反應(yīng)是一種安全、高效、具有良好發(fā)展前景的蛋白質(zhì)改性手段,與此同時,對其結(jié)構(gòu)以及性質(zhì)的研究也越來越深入。從較早的干熱法,到后來的濕法[4-5],以及現(xiàn)如今各種物理手段、化學(xué)方法及酶法的發(fā)展,已經(jīng)使得蛋白質(zhì)-多糖領(lǐng)域取得更廣闊的發(fā)展。Yan Liu等[6]研究了美拉德反應(yīng)對豌豆分離蛋白與葡聚糖接枝物功能性質(zhì)的改善。對于食品領(lǐng)域來說,化學(xué)法和生物法都會向食品中引入一些新的成分,因此,物理法對于要解決食品中的活性成分、維生素、營養(yǎng)成分和色澤等損害的益處就顯得尤為顯著[7]。其中微波法是通過分子振動傳遞能量,而且有加熱迅速、均勻,這樣便避免了物料逐漸升溫的過程[8],這一點也正是微波技術(shù)在現(xiàn)今食品工業(yè)中越來越受到重視和應(yīng)用的原因。其中管軍軍等[3]運用微波法合成大豆蛋白和糖的接枝物并對其產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行研究。目前,越來越多的學(xué)者致力于對美拉德反應(yīng)的研究,而對水浴法和微波法的對比的研究卻較少。對比兩種方法制備接枝物的功能性質(zhì),可以采用改善效果更好的制備方法,有針對性的改善接枝物的某一特定功能特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白(SPI) 哈高科食品有限責(zé)任公司;葡聚糖(DX) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水 所用其他試劑均為分析純。

G70D20CN1P-D2(S0)型格蘭仕微波爐(700 W) 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司;LGJ-10型冷凍凍干機(jī) 上海醫(yī)用離心機(jī)廠;數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州賽普實驗儀器廠;紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;傅立葉紅外光譜儀 美國Nexus儀器公司;室驗室數(shù)顯分散均質(zhì)機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SPI-DX復(fù)合物的制備 將大豆分離蛋白(SPI)與葡聚糖(DX)按質(zhì)量比為1∶1的比例溶于蒸餾水中,配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的混合物,在35 ℃磁力攪拌水浴鍋中攪拌3 h,直至完全溶解,使其混合均勻,調(diào)節(jié)pH為7.0。將混合物于90 ℃水浴中熱處理80 min得到SPI-DX復(fù)合物,將相同濃度的混合物于700 W微波功率下處理60 s得到SPI-DX復(fù)合物,用SPI-DX微波組表示。

1.2.2 接枝度測定 鄰苯二甲醛(OPA)試劑的配制:準(zhǔn)確稱取40.00 mg的OPA溶解于1.00 mL甲醇中,再加入20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS)2.50 mL、硼砂溶液(0.10 mol/L)25.00 mL、β-巰基乙醇100.00 μL,然后用蒸餾水定容至50.00 mL,現(xiàn)配現(xiàn)用[9]。采用OPA法測定蛋白質(zhì)中游離氨基的含量,計算出接枝度[10]。取樣品200.00 μL分別加入4.00 mL OPA試劑,混合均勻后在35 ℃水浴鍋中加熱處理2 min,取出,用紫外分光光度計在340 nm處測定樣品的吸光度A,每個樣品測定三次。對照組用200.00 μL蒸餾水作空白,按下式計算接枝度。

式中,A0為SPI-DX復(fù)合物反應(yīng)前測定的吸光度;A1為SPI-DX復(fù)合物反應(yīng)后測定的吸光值。

1.2.3 褐變程度測定 將大豆蛋白與葡聚糖接枝物配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%的溶液,在420 nm處測定其吸光度[11]。每個樣品測定三次。

1.2.4 溶解性測定 參考郭玉珍等人[12]的方法,采用考馬斯亮藍(lán)法測定蕎麥蛋白質(zhì)的溶解度。

以牛血清蛋白濃度為1 mg/mL的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用上清液中蛋白含量與總蛋白中蛋白含量的比值來表示蛋白質(zhì)的溶解度。用0.90%的生理鹽水100.00 mL溶解0.01 g樣品,取1.00 mL樣品溶液與4.00 mL考馬斯亮藍(lán)混合均勻,在紫外分光光度計595 nm處進(jìn)行測定,計算蛋白質(zhì)的含量。每個樣品測定三次。

1.2.5 乳化性質(zhì)的測定 參照 Pearce and Kinsella的方法稍加改動[13]。用5.00 mL pH7.00的磷酸緩沖液(0.10 mol/L)溶解0.10 g SPI-DX樣品,充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?然后取3.00 mL樣品溶液與1.00 mL大豆油進(jìn)行混合,用均質(zhì)機(jī)以12000 r/min的速度均質(zhì)1 min,然后立即用移液槍將從底部吸取出50.00 μL樣品加入到5.00 mL 0.10%的十二烷基硫酸鈉溶液中,于500 nm波長下測定樣品的吸光度A。10 min后對該SPI-DX樣品進(jìn)行再次測定得A10。吸光度值A(chǔ)即為乳化活性。每個樣品測定三次。吸光度A表示乳化活性(EAI);乳化穩(wěn)定性(ESI)按下式計算:

式中,A0為0 min時的吸光度;A10為10 min時的吸光度。

1.2.6 傅里葉紅外光譜 稱取適量SPI-DX樣品,加入一定量溴化鉀,研磨成粉末后壓成薄片,用傅立葉紅外光譜儀測定波數(shù)范圍4000～400 cm-1內(nèi)的吸收光譜,設(shè)置分辨率為4 cm-1,波數(shù)精度為0.01 cm-1,掃描32次,環(huán)境溫度25 ℃[14]。通過使用PeakFit4.12軟件進(jìn)行擬合分析得出SPI、SPI-DX組、SPI-DX水浴組與SPI-DX微波組中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS軟件以及Origin8.5進(jìn)行處理分析,所用實驗數(shù)據(jù)均為測量三次所得平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物接枝度及褐變程度的影響

由圖1可以看出,經(jīng)水浴處理的SPI-DX復(fù)合物,其接枝度為43.49%,褐變程度為0.61,處理時間80 min;經(jīng)微波處理的SPI-DX復(fù)合物的接枝度為42.71%,褐變程度為0.23,微波處理時間60 s。說明在接枝度相近的情況下,微波法比傳統(tǒng)水浴加熱法處理時間短,且褐變程度低,即降低了美拉德反應(yīng)過程中高級產(chǎn)物類黑精的生成,所以微波法更有利于SPI-DX復(fù)合物在色澤上的評價。

圖1 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物接枝度及褐變程度的影響Fig.1 The influence of SPI-DX conjugates’ grafting degree and browning by water bath and microwave methods注:a:水浴法,b:微波法。

2.2 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物溶解性的影響

從圖2中可以看出,與SPI相比,SPI與DX混合的溶解度降低。這可能是因為未反應(yīng)的葡聚糖與大豆蛋白互相競爭吸收水分子,從而降低了大豆蛋白的溶解度,這與Bei Zhang[7]等人在研究蕎麥分離蛋白-葡聚糖共價復(fù)合物的結(jié)果相符合。經(jīng)過水浴和微波處理的SPI-DX復(fù)合物溶解度都有所增加,尤其SPI-DX水浴組的溶解度增加的幅度顯著(p<0.05),比SPI對照組增加了2.29倍,而SPI-DX微波組比SPI對照組溶解性增加了1.23倍。經(jīng)水浴和微波處理的SPI-DX復(fù)合物溶解性增加的主要原因是糖鏈與蛋白相結(jié)合,而大量的親水性羥基的增加使得SPI的空間位阻和靜電排斥作用得以加大,使得接枝物在高溫下不易發(fā)生聚集,從而提高溶解性[15]。微波處理SPI-DX溶解性比水浴處理SPI-DX溶解性小,說明短時的微波效果沒有長時間的水浴效果好,但經(jīng)微波處理的樣品溶解性也都得到了很好的改善,在一定程度上減少了水浴法所用的時間。

表1 SPI-DX復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)含量

Table 1 The secondary structure content of SPI-DX conjugates

蛋白樣品α-螺旋(%)β-折疊(%)β-轉(zhuǎn)角(%)無規(guī)則卷曲(%)SPI2801c3265a2544b1390cSPI與DX混合2867c3047a2624b1459c水浴處理SPI-DX2433b5132b1719a716a微波處理SPI-DX1067a5909c1818a1206b

圖2 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物溶解性的影響Fig.2 The influence of SPI-DX conjugates’ solubility by water bath and microwave methods注:a:SPI,b:SPI與DX混合,c:水浴處理SPI-DX,d:微波處理SPI-DX，圖3、圖4同。

注：標(biāo)注不同字母差異顯著(p<0.05)。2.3 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物乳化性的影響

如圖3所示,與SPI相比,SPI-DX混合組乳化性質(zhì)沒有明顯的變化,其乳化活性及乳化穩(wěn)定性增加的幅度也很小,這與傅里葉紅外SPI-DX混合組中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量變化相符合。

與SPI對照組相比,經(jīng)水浴法和微波法處理后的SPI-DX復(fù)合物乳化活性和乳化穩(wěn)定性都明顯提高,這說明SPI與DX發(fā)生的美拉德反應(yīng)可以改善SPI的乳化性,這可能是由于SPI與DX形成了大的共價復(fù)合物并吸附在油水界面上,形成一定的空間位阻效應(yīng),使液滴間的聚集作用減弱,從而增加了SPI-DX的乳化活性,這與Li[16]等的研究一致。此外,SPI-DX水浴組的乳化活性和乳化穩(wěn)定性增加程度比SPI-DX微波組顯著,這可能是由于水浴加熱的時間比微波處理的時間長所導(dǎo)致的。

圖3 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物乳化性的影響Fig.3 The influence of SPI-DX conjugates’ emulsification by water bath and microwave methods

2.4 傅里葉紅外光譜分析

用傅里葉紅外光譜對蛋白質(zhì)中二級結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行分析。1610～1640、1670～1680 cm-1范圍內(nèi)是β-折疊結(jié)構(gòu);1650～1660 cm-1范圍是α-螺旋結(jié)構(gòu);1660～1700 cm-1范圍是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu);1640～1650 cm-1范圍是無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[17]。由表1中可以看出,SPI和SPI與DX混合兩組中的二級結(jié)構(gòu)主要以β-折疊、α-螺旋及β-折疊為主,SPI經(jīng)糖化反應(yīng)后,兩組復(fù)合物的α-螺旋以及β-轉(zhuǎn)角含量降低得都比較顯著(p<0.05),而無規(guī)卷曲的含量也有下降趨勢,但β-折疊結(jié)構(gòu)含量卻明顯增加?；旌衔镏懈鞫壓康淖兓皇呛苊黠@,說明SPI與DX混合對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響。大豆蛋白中α-螺旋主要在分子鏈內(nèi)部,α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少說明蛋白質(zhì)分子間氫鍵被破壞,使得蛋白中的游離氨基與糖發(fā)生接枝反應(yīng)。水浴處理SPI-DX中只有α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量高于微波處理SPI-DX,說明微波處理的SPI-DX中更多的氫鍵被破壞,并與葡聚糖發(fā)生糖化反應(yīng),這也與先前兩種反應(yīng)的接枝度相對應(yīng)。因此推測α-螺旋結(jié)構(gòu)可能與SPI-DX復(fù)合物的溶解性及乳化性相關(guān),而其他的二級結(jié)構(gòu)可能與起泡性有關(guān)。而β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加則印證發(fā)生了糖基化反應(yīng),這是因為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中引入了多糖的羥基,而多糖鏈的空間效應(yīng)使得蛋白結(jié)構(gòu)由無序變?yōu)橛行蚪Y(jié)構(gòu),進(jìn)而改變其功能性質(zhì),因此β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加,而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量減少。這與張楠[18]對大豆蛋白-乳糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致。

圖4 水浴法、微波法對SPI-DX復(fù)合物傅里葉紅外光譜的影響Fig.4 The influence of SPI-DX conjugates’ FTIR by water bath and microwave methods

3 結(jié)論

要達(dá)到水浴法處理SPI-DX復(fù)合物的接枝度,微波法處理所用時間更短,微波法降低了SPI-DX復(fù)合物的褐變程度。水浴法與微波法處理均能改善復(fù)合物的乳化性質(zhì)和溶解性。水浴法處理SPI-DX復(fù)合物溶解性及乳化性大于微波法。糖化后的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生改變證明美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

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Research of the comparison of emulsification properties of SPI-DX complexes prepared by water bath and microwave methods

ZHANG Yao,ZHOU Lin-yi,ZHAO Cheng-bin,LIN Hai-jing,WU Fei*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

InordertoimprovetheemulsifyingpropertiesofSPI-DXcomplexespreparedbywaterbathandmicrowavemethods.ThegraftdegreeofthecompositesandbrowningdegreeweredeterminedbyOPAandUVspectrophotometerat420nm,thenthefunctionalpropertiesandsecondarystructureoftheconjugatespreparedintwowayswerecompared.TheresultsshowedthatmicrowavemethodcanmakemoredextranhaveMaillardreactionwithSPIwhilereducingthecomplex’sbrowningdegree.TheSPI-DXconjugatesobtainedfromthetwomethodswereimprovedinsolubility,emulsification,theeffecttosolubilityintraditionalwaterbathmethodwasbetterthanmicrowavemethod,andtheemulsifyingpropertyofwaterbathmethodalsohigherthanthatofmicrowaveway.Fouriertransforminfraredspectroscopyshowedthatthetwoconjugates’contentofα-helix,β-turnandrandomcoilweredecreased,butthecontentofβ-sheetwasincreased.

SPI;Dextran;microwave;Maillardreaction

2016-04-27

張瑤(1992-)，女，碩士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail:190530131@qq.com。

*通訊作者:吳非(1968-),女，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工，E-mail:18745709722@163.com。

黑龍江省科技攻關(guān)項目(GC13B213)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)19-0123-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.015