李石磊，木云雷，滕煒鳴，付成東，劉項峰，于佐安，張 明，王慶志，陳 遠

( 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧省應用海洋生物技術開放試驗室，遼寧 大連 116023 )

四種因子對仿刺參幼參生長的影響

李石磊，木云雷，滕煒鳴，付成東，劉項峰，于佐安，張 明，王慶志，陳 遠

( 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧省應用海洋生物技術開放試驗室，遼寧 大連 116023 )

以益生菌、水溫、寡糖和配合飼料為因素，仿刺參幼參的特定生長率為指標，通過L9(34)正交試驗方法，研究4種因子對仿刺參幼參生長的影響，獲得各因子的最佳組合參數(shù)。試驗結果顯示，4種因子對幼參特定生長率的影響均極顯著(P<0.01)，影響因素為益生菌>水溫>寡糖>配合飼料。最佳的因素搭配為益生菌5 mL/m3，水溫24 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖混合0.002 g/L，幼參B型配合飼料。各因素水平對仿刺參幼參特定生長率影響為益生菌5 mL/m3>15 mL/m3>10 mL/m3，水溫24 ℃>17 ℃>10 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖>褐藻膠寡糖>殼寡糖，幼參飼料B型>幼參飼料加強型>稚參飼料。

仿刺參；特定生長率；益生菌；寡糖；正交設計

仿刺參(Apostichopusjaponicus)又稱刺參，屬于棘皮動物門、海參綱、楯手目、刺參科、仿刺參屬[1]。海產八珍之一，富含蛋白質、黏多糖、維生素、氨基酸、海參皂苷以及多種微量元素和眾多生理活性物質，具有極高的營養(yǎng)和藥用價值。刺參產業(yè)發(fā)展迅速，總產量10年間增加了27倍[2]，養(yǎng)殖的過速發(fā)展及集約化養(yǎng)殖模式下的不規(guī)范運作導致該產業(yè)存在較多問題。如各階段餌料營養(yǎng)配比不盡合理，化學藥品和抗生素的過量濫用造成環(huán)境污染，導致食品安全隱患，嚴重影響了該產業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。

溫度是影響仿刺參生長的重要因子之一，過高或過低的水溫均會抑制仿刺參的生長。適溫范圍內，隨著水溫的升高，仿刺參的呼吸和基礎代謝水平增加，而當溫度繼續(xù)升高超出適溫范圍時，仿刺參的呼吸代謝率又開始減慢，降低能量和物質的消耗，進入夏眠狀態(tài)[3-4]。水溫過低時，仿刺參會進入冬季半休眠狀態(tài)。不同規(guī)格的仿刺參對溫度的適應能力不同，小規(guī)格仿刺參的夏眠臨界溫度高于大中規(guī)格[5]。益生菌可以調整微生態(tài)失調，保持生態(tài)平衡，提高水產養(yǎng)殖動物的健康水平，以達到防病、治病的效果。益生菌作為一種新型的抗生素替代品以其安全、環(huán)保等特點被廣泛應用在水產養(yǎng)殖當中。益生菌對仿刺參的養(yǎng)殖水體具有良好的改善作用[6-7]，可有效地提高幼參消化功能和非特異性免疫能力[8-9]，促進仿刺參的生長[10-11]。寡糖,又稱低聚糖,是指2～10個單糖通過糖苷鍵連接而成的直鏈或支鏈的一類糖。寡糖可改善水產動物腸道內的微生態(tài)環(huán)境,能夠提高水產動物免疫相關酶的活性,提高機體的免疫功能,增強其抵抗疾病的能力，是一類穩(wěn)定、安全和環(huán)保的抗生素替代物。近年來的研究表明,通過注射卡拉膠寡糖可以增強仿刺參免疫活性[12]，飼料中添加殼寡糖，對仿刺參的生長和抵抗燦爛弧菌(Vibriasplendidus)的能力有一定的促進作用[13]，飼料中添加半乳甘露寡糖不僅可以提高仿刺參免疫力,并且可以提高特定生長率,并改善體壁氨基酸組成[14]。仿刺參幼參苗種的室內養(yǎng)殖需要投喂一定比例的人工配合飼料，飼料的質量是關系刺參生長和水體環(huán)境的重要因素，不同原料成分和配比的配合飼料對仿刺參生長的影響也有所不同。我國學者在仿刺參飼料的蛋白和脂肪需求量、不同蛋白來源組成、飼料添加劑等方面做過大量的研究[15-18]。研究表明，仿刺參稚參在粗蛋白水平為18.21%～24.18%、粗脂肪為5%時，獲得最大生長；投喂植物性為主的飼料時，仿刺參的營養(yǎng)價值較高；飼料中添加甘草酸、硒酵母和維生素E對仿刺參的特定生長率均有顯著的影響。

本試驗主要針對仿刺參幼參培育階段，利用正交設計方法，探討溫度、益生菌、寡糖、配合飼料4種因子對仿刺參幼參生長的影響，獲得上述各因子的最佳組合參數(shù)，為安全健康的仿刺參養(yǎng)殖模式構建提供可靠的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌、寡糖和配合飼料

試驗用益生菌為工大3號，由大連工業(yè)大學生物技術實驗室提供。主要成分為該實驗室前期篩選得到的菌株芽孢桿菌(Bacillus)2株、乳酸桿菌(Lactobacillus)2株及實驗室保藏的酵母菌和乳酸菌，6株菌進行混合培養(yǎng)，混合培養(yǎng)的活菌數(shù)達1.0×108cfu/mL；殼寡糖和褐藻膠寡糖由大連化學物理研究所提供；配合飼料分為幼參B型，幼參加強型，稚參類3種，由大連海洋大學提供。

1.2 試驗方法

幼參購自大連水益生海洋生物科技有限公司，個體濕質量(1.52±0.34) g，試驗采用L9(34)正交試驗設計，設4個因素3個水平(表1)，各組因素水平正交設計見表2。試驗采用9個1.6 m3水槽，每個水槽內懸掛3個聚乙烯網片制作成的網箱作為平行組，網箱口高于水面以防幼參爬出，網箱內放上與箱底大小相當?shù)暮谏y板一塊,板上鉆有直徑2 cm的小孔5～7個，便于幼參附著攝食和餌料投喂，利用控溫設備使各組水溫變化幅度保持±0.5 ℃。每個網箱內放置幼參30頭，試驗開始前饑餓48 h，用分析天平逐個測量全部幼參個體濕質量，試驗期間每日16:00投喂配合餌料，投喂量為幼參體質量的10%，益生菌和寡糖每5 d投放一次，每次的投放量為寡糖2 mg/L，寡糖混合組為殼寡糖+褐藻膠寡糖各1 mg/L。每10 d換水一次。62 d后試驗結束，饑餓48 h，用分析天平逐個測量全部幼參個體濕質量。計算各網箱幼參特定生長率：

特定生長率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，m0為幼參個體平均初質量(g)，mt為幼參個體平均末質量(g)，t為試驗天數(shù)(d)。

正交試驗設計及試驗數(shù)據(jù)方差分析處理均使用SPSS 16.0軟件。

表1 因素水平

2 試驗結果

2.1 各組幼參生長結果

試驗結果表明,第7組的幼參特定生長率值最高，其次是第4組，然后是第9組， 24 ℃下,3組幼參的特定生長率平均值要高于17 ℃和10 ℃組， 17 ℃下,3組的特定生長率平均值高于10 ℃(表2)。在試驗階段，幼參的特定生長率值隨著水溫的升高而變大。

表2 各組試驗幼參特定生長率

2.2 正交方差分析

將幼參特定生長率取反正弦值，通過SPSS 16.0軟件進行方差分析，結果見表3。4種因素對幼參特定生長率的影響均極顯著(P<0.01)，水溫和益生菌(P=0.000)較寡糖(P=0.006)和配合飼料(P=0.008)對幼參特定生長率有更大的影響，益生菌的平方和大于水溫的平方和，故益生菌對幼參特定生長率的影響大于水溫。影響因素的順序為益生菌、水溫、寡糖和配合飼料。

表3 方差分析

2.3 水溫對幼參特定生長率的影響

水溫對幼參的特定生長率，24 ℃均值最大(32.324)￣(表4),且24 ℃>17 ℃>10 ℃(表4)；由水溫配對比較(表5)可見，24 ℃與10 ℃及17 ℃的幼參特定生長率差異極顯著(P<0.01)，10 ℃和17 ℃的幼參特定生長率差異顯著(0.01

表4 水溫單因素統(tǒng)計量

表5 水溫的配對比較

2.4 益生菌對幼參特定生長率的影響

益生菌對幼參特定生長率，5 mL/m3試驗組均值最大(32.900)(表6),且5 mL/m3>15 mL/m3>10 mL/m3；由益生菌配對比較(表7)可見，5 mL/m3試驗組與10 mL/m3、15 mL/m3試驗組的幼參特定生長率差異極顯著(P<0.01)，10 mL/m3和15 mL/m3試驗組的幼參特定生長率差異不顯著(P>0.05)。

表6 益生菌單因素統(tǒng)計量

表7 益生菌的配對比較

2.5 寡糖對幼參特定生長率的影響

殼寡糖+褐藻膠寡糖的幼參特定生長率，均值最大(30.468),且殼寡糖+褐藻膠寡糖>褐藻膠寡糖>殼寡糖(表8)；殼寡糖與褐藻膠寡糖差異顯著(0.010.05)(表9)。

表8 寡糖單因素統(tǒng)計量

表9 寡糖的配對比較

2.6 配合飼料對幼參特定生長率的影響

配合飼料對幼參生長率，幼參B型均值最大(30.96),且幼參B型>幼參加強型>稚參類(表10)；由配合飼料配對比較(表9)可見，稚參類與幼參B型差異極顯著(P<0.01)，稚參類和幼參加強型差異不顯著(P>0.05)，幼參B型和幼參加強型差異不顯著(P>0.05)。

表10 配合飼料單因素統(tǒng)計量

表11 配合飼料配對比較表

綜合以上正交試驗數(shù)據(jù)的方差分析結果可知，各因素水平對幼參特定生長率影響的強弱順序為：益生菌5、15、10 mL/m3，水溫24、17、10 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖>褐藻膠寡糖>殼寡糖，幼參B型>幼參加強型>稚參類。4種因素對幼參特定生長率的影響均極顯著(P<0.01)，影響因素的順序為益生菌>水溫>寡糖>配合飼料。因此可以確定最佳的因素搭配為益生菌5 mL/m3，水溫24 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖2 mg/L，幼參B型。這與本次試驗的結果位次相同。

3 討 論

3.1 溫度對仿刺參幼參生長的影響

不同規(guī)格的仿刺參對溫度的適應能力也不盡相同。Yang等[12]采用質量20～134 g的仿刺參進行研究，認為最佳生長溫度為10～20 ℃；Dong[13]采用9～10 g的仿刺參進行研究，認為在12～18 ℃，仿刺參幼參的生長速度隨著溫度的升高而增加，但過高的溫度會導致生長速度下降，仿刺參幼參的適溫為12～21 ℃，最適生長水溫為16～18 ℃[14]。本試驗中生長率最高的組別溫度為24 ℃，仿刺參體質量為(1.52±0.34) g，推測這可能是由于本次試驗所用仿刺參規(guī)格不同于以上研究所導致。夏季仿刺參幼參室內保苗處于高水溫期，本試驗所選用24 ℃水溫也是從現(xiàn)實角度考慮，試驗結果對生產具有一定的指導作用。

3.2 益生菌和益生元對仿刺參生長的影響

根據(jù)微生態(tài)制劑的物質組成，可將其劃分為益生菌、益生元和合生元。目前水產中常用的益生菌種類包括弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬、酵母菌屬(Saccharomyces)及乳酸菌屬一些種類。益生元指一些非消化性食物成分，最早發(fā)現(xiàn)的益生元是雙歧因子，后來發(fā)現(xiàn)多種不能消化的寡糖可作為益生元。合生元為益生菌和益生元結合的生物制劑，其特點是同時發(fā)揮益生菌和益生元的作用。

有研究表明,在仿刺參養(yǎng)殖中投喂益生菌，可以有效的改善水質，同時益生菌本身含有大量的營養(yǎng)物質，為機體提供營養(yǎng)[19]，通過競爭、抑制和排斥作用，幫助建立和維持正常的水產動物腸道優(yōu)勢種群，提高無脊椎動物體液因子中的酶活力，增強免疫力和抗病性。益生菌可以減少機體皮質醇的分泌和熱休克蛋白的表達，提高水產動物應激條件下的耐受力[20-21]。在海參養(yǎng)殖中添加益生菌，可以有效促進刺參的生長，如袁成玉等[7]使用光合細菌和芽孢桿菌投喂幼參能明顯促進幼參生長；周慧慧等[8]采用分離自刺參腸道的益生菌投喂稚參，顯著提高了稚參的成活率和生長率。也有學者對益生元在仿刺參養(yǎng)殖中的作用進行了研究，韓麗蓉等[10]進行了殼寡糖對仿刺參生長、免疫反應和抗病力的影響研究，結果表明飼料中添加殼寡糖對仿刺參的生長有一定程度的促進作用，能提高機體免疫反應，并在一定程度上增強仿刺參抗病力。王際英等[11]研究發(fā)現(xiàn)，以飼料添加劑的形式在仿刺參配合飼料中添加適量的半乳甘露寡糖不僅可以提高其特定生長率,改善體壁營養(yǎng)組成,還可以提高仿刺參機體免疫力,在 0.2%添加量即可起到促進生長、提高免疫力的作用,當添加量高于1.2%時，降低了仿刺參的生長性能及相關免疫酶活性。益生菌和益生元在水產動物養(yǎng)殖中的相互作用是研究的熱點問題之一。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，果糖和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)可以顯著的提高三角魴(Megalobramaterminalis)免疫力和抗氧活能力，混合投喂的效果好于單獨投喂。Lin等[23]研究表明殼寡糖和凝結芽孢桿菌(B.coagulans)提高錦鯉(Cyprinuscarpio)的免疫力和抗病力。Ai等[24]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)可以促進大黃魚(Larimichthyscrocea)生長，增強免疫力，但單獨使用低聚果糖以及二者混合使用效果不明顯。Daniels等[25]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中補充益生菌、益生元和合生元，可以改善歐洲龍蝦(Homarusgammarus)幼蟲的生長和存活率，芽孢桿菌能大幅度提高幼蟲的抗逆性。在海參飼料中添加枯草芽孢桿菌和果聚糖，枯草芽孢桿菌和果聚糖可協(xié)同作用，有效提高仿刺參免疫力，改善抗病力[26]。在本試驗中所用的益生菌為芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌混合菌類，試驗嘗試了不同投喂劑量的益生菌和不同種類寡糖的配比組合，結果表明，5 mL/m3的益生菌與0.002 g/L的褐藻膠寡糖+殼寡糖混合搭配投喂條件下，仿刺參幼參的生長速度最快，而這種搭配組合對仿刺參幼參的免疫指標的影響及其作用機理還需進一步研究。

4 結 論

4種因素對仿刺參幼參的生長均具有極顯著影響，其影響效果依次為益生菌>水溫>寡糖>配合飼料。最佳的投喂組合為即益生菌5 mL/m3，水溫24 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖2×10-6mg/L，幼參B型。本次試驗通過正交設計試驗研究了水溫、復合益生菌、寡糖和配合飼料4種因素對仿刺參幼參生長的影響，找到了仿刺參幼參保苗階段各因素的最佳配比組合，為安全健康的仿刺參保苗新模式的構建提供基礎數(shù)據(jù)。

致謝：

感謝大連工業(yè)大學肖珊老師、大連化學物理研究所許青松副研究員和大連海洋大學任同軍老師提供的益生菌、寡糖和配合飼料。

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EffectsofProbiotics,Temperature,Oligosaccharide,andFormulatedFeedonGrowthinJuvenileSeaCucumberApostichopusjaponicus

LI Shilei,MU Yunlei,TENG Weiming,FU Chengdong,LIU Xiangfeng,YU Zuoan,ZHANG Ming,WANG Qingzhi,CHEN Yuan

( Liaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology,Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute,Dalian 116023,China )

Effects of probiotics,water temperature,oligosaccharide,and formulated feed on specific growth rate of juvenile sea cucumberApostichopusjaponicuswere investigated in a L9(34) orthogonal experiment to optimize the four factors.The results showed that there was significant influence of the factors on specific growth rate of juvenile sea cucumber (P<0.01),as the order of probiotics> water temperature> oligosaccharide> formulated feed.The best growth performance of the juveniles was observed under the conditions of probiotic at a dose of 5 mL/m3,water temperature 24 ℃,oligochitosan and alginate oligomers mixed at a dose of 0.002 g/L,and formulated feed type B.The strong-to-weak order of various factors and levels on specific growth rate of the juveniles was expressed as probiotic 5 mL/m3>15 mL/m3>10 mL/m3,water temperature 24 ℃>17 ℃>10 ℃,oligochitosan and alginate oligomers mixed> alginate oligomers > oligochitosan,type B for sea cucumber juvenile > fortified feed of sea cucumber juvenile > feed for sea cucumber juvenile.

Apostichopusjaponicus;specific growth rate(SGR);probiotic;oligosaccharide;orthogonal design

S968.9

A

1003-1111(2016)01-0021-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.004

2015-05-07；

2015-09-15.

遼寧省科技計劃項目(2015103044);大連市科技興海專項資金資助項目(大海漁科字20140101)；大連市科技計劃項目(2012B14NC127).

李石磊(1981-)，男，助理研究員;研究方向：海洋動物遺傳育種與養(yǎng)殖技術.E-mail:lnlylsl@126.com.通訊作者：陳遠(1960-)，男，研究員;研究方向：海洋經濟動物繁育及增養(yǎng)殖技術.E-mail:chenyuan65432101@sina.com.