豐江舟，楊夢(mèng)夢(mèng)，朱彬彬，曹文清，鄭立春，周興路，王 潞，吳志浩

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)院，安徽 蕪湖 241002;3.皖南醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；4.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像與檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；5.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

?

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

人PD-L1基因啟動(dòng)子克隆及其熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

豐江舟1，楊夢(mèng)夢(mèng)2，朱彬彬3，曹文清2，鄭立春4，周興路4，王 潞1，吳志浩5

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)院，安徽 蕪湖 241002;3.皖南醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；4.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)影像與檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；5.皖南醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：對(duì)人源PD-L1基因啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建PD-L1熒光素酶報(bào)告基因。 方法：用PCR擴(kuò)增方法獲得PD-L1基因啟動(dòng)子；PD-L1啟動(dòng)子和載體行KpnⅠ、XhoⅠ酶切、連接和轉(zhuǎn)化，然后行菌落PCR以及測(cè)序等。構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中并檢測(cè)PD-L1啟動(dòng)子活性。 結(jié)果：經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出PD-L1基因啟動(dòng)子片段,；菌落PCR鑒定各重組體構(gòu)建正確并經(jīng)生工測(cè)序成功；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后經(jīng)報(bào)告基因檢測(cè)得知所克隆的不同片段序列具有啟動(dòng)子活性。 結(jié)論：成功克隆PD-L1基因啟動(dòng)子,構(gòu)建出不同片段基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因，為進(jìn)一步研究其分子機(jī)制提供詳實(shí)基礎(chǔ)。

PD-L1；啟動(dòng)子克??；雙熒光素酶報(bào)告基因

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.06.004

程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)為PDCD1基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白[1]，PD-1表達(dá)于活化的免疫細(xì)胞表面，如CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞等[2]。PD-L1(programmed death-1-ligand 1，程序性死亡配體-1)是程序性細(xì)胞死亡蛋白1的配體之一，同屬CD28/B7家族。PD-L1多表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，如PD-L1在乳腺癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、黑色素瘤[5]等癌細(xì)胞表面都呈過表達(dá)。腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與免疫細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合后可抑制免疫細(xì)胞的增殖與活性并可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡，從而對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答過程起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[6-7]。PD-1/PD-L1通路在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸中具有重大意義，近年來越來越多與此相關(guān)的實(shí)驗(yàn)得以開展，并且PD-1單克隆抗體、PD-L1單克隆抗體在晚期腫瘤病人身上發(fā)揮驚人的療效。 目前關(guān)于調(diào)控PD-L1的分子機(jī)制尚未明了，為了深入研究其調(diào)控機(jī)制，我們克隆了PD-L1基因啟動(dòng)子,并構(gòu)建到報(bào)告基因載體PGL3-Basic上，然后對(duì)其啟動(dòng)因子活性進(jìn)行初步檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基，購自Gibco公司；Lipofectamine2000，購自invitrogen 公司；E.coli DH5α Competent Cells為TaKaRa公司產(chǎn)品； pGL3-Basic質(zhì)粒、質(zhì)粒小量提取試劑盒,購自 Promega公司； KpnⅠ、XhoⅠ，購自NEW ENGLAND BioLabs； T4 DNA連接酶，Takara公司；A549細(xì)胞，本室凍存。

1.2 方法

1.2.1 PD-L1基因系列啟動(dòng)子的擴(kuò)增

1.2.1.1 引物設(shè)計(jì) 在NCBI網(wǎng)站中根據(jù)PD-L1基因序列，選擇啟動(dòng)子區(qū)域。設(shè)計(jì)5對(duì)引物，其中1987 bp片段的擴(kuò)增引物如下，上游5′-TCTCCGGGTAGTTGATCAATTGTATGG-3′；1375 bp的擴(kuò)增引物為：上游5′-TCCTAGAGGTCACAGTCACCAAAGTTG-3′；1011 bp的擴(kuò)增引物為：上游5′-AGAAGGAAAGGCAAACAACGAAGAGTC-3′；632 bp的擴(kuò)增引物為：上游5′-TCATTATGTCGAGGAACTTTGAGGAAG-3′； 145 bp的擴(kuò)增引物為：上游5′-TCACCGAAGGTCAGGAAAGTCCAACGC-3′；下游引物共為：5′-GGAGCCTCGGGAAGCTGCGCAGAACTG-3′。

1.2.1.2 PCR擴(kuò)增 對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)用細(xì)胞基因組提取試劑盒提取基因組，提取的基因組DNA為PCR擴(kuò)增的模板，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃、3 min；變性94℃、30 s，退火61℃、30 s，延伸72℃、60 s，共30 個(gè)循環(huán)，延伸72℃、5 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 PD-L1熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將上述克隆的系列PD-L1啟動(dòng)子和PGL3-Basic載體分別經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切、連接，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。挑取單克隆菌落做菌落PCR鑒定其陽性的克隆,然后陽性的克隆再次進(jìn)行搖菌，保種后行質(zhì)粒提取并送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 PD-L1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞與活性檢測(cè) 將上述構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作按轉(zhuǎn)染試劑說明書嚴(yán)格進(jìn)行。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒兩天后，進(jìn)行收樣等處理，利用雙螢光檢測(cè)試劑盒在螢光檢測(cè)儀GloMax20/20(Promega 公司)上檢測(cè)螢火蟲和海腎螢光素酶活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次平行做3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件的t-test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1不同片段啟動(dòng)子的克隆 以A549細(xì)胞基因組DNA為模板，克隆出5段啟動(dòng)子，分別命名為F1：1987 bp，F(xiàn)2:1375 bp，F(xiàn)3:1011 bp，F(xiàn)4:632 bp，F(xiàn)5:145 bp。將克隆出的目的片段進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析，其結(jié)果與所設(shè)計(jì)的PD-L1片段大小一致，表明PD-L1不同片段啟動(dòng)子的克隆成功(圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 PD-L1啟動(dòng)子報(bào)告基因載體的PCR鑒定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選取1011 bp、632 bp和145 bp的PD-L1啟動(dòng)子及選取熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic進(jìn)行酶切、連接和轉(zhuǎn)化。挑取單個(gè)菌落作模板加入相應(yīng)上下游引物等進(jìn)行菌落PCR,初步證實(shí)重組體構(gòu)建成功。圖2中圖A、B 和C分別為構(gòu)建的不同片段的PD-L1熒光素酶報(bào)告基因載體熒光素酶報(bào)告基因菌落PCR結(jié)果。

圖2 PD-L1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒菌落PCR鑒定結(jié)果

2.3 啟動(dòng)子活性的檢測(cè) 在12孔板A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染與螢光素酶基因融合的PD-L1 promoter，并且與海腎螢光素酶基因以1000∶1的比例共轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染空載pGL3-Basic質(zhì)粒為對(duì)照，pGL3-Basic-PDL1 Promoter F3、pGL3-Basic-PDL1 Promoter F4和pGL3-Basic-PDL1 Promoter F5重組體為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染48 h后利用Promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay Systerm(雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng))檢測(cè)顯示，pGL3-Basic-PDL1 Promoter F3、pGL3-Basic-PDL1 Promoter F4和pGL3-Basic-PDL1 Promoter F5與對(duì)照PGL3-Basic相比顯著升高，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，由此可見所克隆的報(bào)告基因具有啟動(dòng)子活性(圖3)。

**P<0.01,***P<0.01。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)PD-L1啟動(dòng)子活性

3 討論

兩種新的PD-1/PD-L1 抗體被批準(zhǔn)用于不能手術(shù)或者轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療[8]。除了惡性黑色素瘤，PD-1/PD-L1 抗體在肺癌病人中也顯示出令人驚喜的療效。我們運(yùn)用PCR擴(kuò)增、酶切、連接等實(shí)驗(yàn)方法克隆出不同片段的PD-L1啟動(dòng)子，然后經(jīng)過菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證,證實(shí)成功構(gòu)建PD-L1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與空載體對(duì)照組相比所構(gòu)建的PD-L1啟動(dòng)子報(bào)告基因具有明顯的啟動(dòng)子活性。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，PD-L1在人體多種腫瘤細(xì)胞表面均有表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1的相關(guān)因素大體可分為腫瘤細(xì)胞外在因素和內(nèi)在因素。腫瘤微環(huán)境中外在刺激促進(jìn)PD-L1表達(dá)主要通過激活TLRs和IFN-γ受體，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，如NF-kB[9]、MAPK[10]、PI3K[11]和JAK/STAT[12]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等；腫瘤細(xì)胞內(nèi)在因素促進(jìn)PD-L1表達(dá)，主要是通過抑癌基因LKB1和Pten[13]缺失來激活PI3K/Akt/mTOR通路，核增殖抗原Ki-67的活化[14]，EGFR通路的激活[15]等途徑來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1。目前報(bào)道的腫瘤細(xì)胞中調(diào)控PD-L1表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路主要有Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。為了研究腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)PD-L1的調(diào)控機(jī)制，我們運(yùn)用PCR擴(kuò)增、酶切和連接等實(shí)驗(yàn)技術(shù)構(gòu)建了人PD-L1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因，并根據(jù)相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子在PD-L1啟動(dòng)子區(qū)域的潛在結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建出不同片段的PD-L1基因熒光素酶報(bào)告基因，以明確該信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平這方面促進(jìn)PD-L1的轉(zhuǎn)錄，以及根據(jù)不同片段的PD-L1報(bào)告基因來明確促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄的具體轉(zhuǎn)錄因子。我們可明確該信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)PD-L1的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，阻斷該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1將明顯下調(diào)，從而阻斷腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸等惡性事件的發(fā)生，同時(shí)為臨床抗PD-L1的靶點(diǎn)藥物的研發(fā)提供詳實(shí)的分子基礎(chǔ)。

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Construction of human PD-L1 gene promoter luciferase reporter gene vectors

FENG Jiangzhou,YANG Mengmeng,ZHU Binbin,CAO Wenqing,ZHENG Lichun,ZHOU Xinglu，WANG Lu,WU Zhihao

Department of Medical Oncology，The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China

Objective：To clone PD-L1 gene promoter for constructing the luciferase reporter gene vectors.Methods:PD-L1 gene promoter was obtained via PCR amplification,and then sub-cloned into luciferase reporter gene vector to construct three different recombinant plasmids that were transfected into A549 cell lines after digestion with enzyme KpnI and Xho I. Then the transcription activation of these promoters was determined.Results:Segments of PD-L1 gene promoter was amplified by PCR. Recombined plasmids were identified by colony PCR and verified through contracted sequencing by Biotechnology (Shanghai,China),which indicated successful construction of the vectors. Transient transfection of the A549 cells showed activation of different sequences of reporter gene.Conclusion:Human PD-L1 gene promoter luciferase reporter gene vector was successfully constructed,which may lay a foundation for following research of the molecular mechanisms of PD-L1.

PD-L1; promoter cloning; dual luciferase reporter gene

1002-0217(2016)06-0524-03

2016-09-09

豐江舟( 1989-) ，男，2014 級(jí)碩士研究生，(電話)18315361831，(電子信箱) feng421937821@ 163.com； 王 潞，女，主任醫(yī)師，(電子信箱) lucyyjs@163.com 通信作者; 吳志浩，男，教授，(電子信箱)zwu2ster@163.com，通信作者.

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