高 倩，秦小明，鐘賽意，陳建平

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶工藝的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化

高 倩，秦小明，鐘賽意，陳建平

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，利用JMP 7.0中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，在接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量等4個(gè)方面對(duì)黑曲霉CⅠCC 2475發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高酶活力的β-葡萄糖苷酶。結(jié)果表明：接種量約11.0%、初始pH值5.6、發(fā)酵時(shí)間130 h以及裝液量70.0mL條件下，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力達(dá)到最大值118.73 U/mL，與單因素優(yōu)化前61.01 U/mL相比，酶活力提高了48.61%。

黑曲霉CⅠCC2475；β-葡萄糖苷酶；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC 3.2.1.21）廣泛存在于各類生物體中，屬于纖維素酶類水解酶，作用于纖維寡糖中的 β-1,4糖苷鍵及糖苷類物質(zhì)中的羥基或芳香基團(tuán)與糖基之間的糖苷鍵，在食品[1]、醫(yī)藥[2]、化工[3]等領(lǐng)域具有重要的作用，在糖苷合成過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)研究學(xué)者不斷研究β-葡萄糖苷酶的分離純化[5-6]，但結(jié)果仍不理想，分離純化出的β-葡萄糖苷酶的酶活性與國(guó)外研究相比較低，因此仍需要加大對(duì)β-葡萄糖苷酶分離純化的研究。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從微生物中提取的β-葡萄糖苷酶活性遠(yuǎn)高于植物中提取的β-葡萄糖苷酶[7]。黑曲霉生長(zhǎng)速度較快，發(fā)酵周期較短，其發(fā)酵生產(chǎn)的酶制劑安全可靠，不含有毒物質(zhì)，其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的安全性是國(guó)際公認(rèn)的[8]。在黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究中，常用的優(yōu)化分析方法是響應(yīng)面分析，但是響應(yīng)面分析有一定的局限性，僅適用于二次函數(shù)模型的模擬[9]。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是以已知分類的數(shù)據(jù)作為輸入，在初始閾值和權(quán)值的作用下計(jì)算輸出結(jié)果，再與實(shí)際結(jié)果比較得到實(shí)驗(yàn)誤差；通過(guò)不斷調(diào)整閾值和權(quán)值減少誤差，使輸出結(jié)果近似實(shí)際值。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有強(qiáng)大的分類和預(yù)測(cè)能力，對(duì)于非線性系統(tǒng)具有較好的優(yōu)化處理能力，可保存已訓(xùn)練好的模型，輸入數(shù)據(jù)后可準(zhǔn)確快速預(yù)測(cè)輸出結(jié)果[10]?；诖藘?yōu)勢(shì)，許多國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化應(yīng)用于微生物發(fā)酵過(guò)程中[11-12]。筆者在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，利用JMP 7.0中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，在接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量等4個(gè)方面對(duì)黑曲霉CⅠCC2475發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較高酶活力的 β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 黑曲霉（Aspergillus niger） CⅠCC 2475，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。將菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基中，25℃ 活化5 d。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉20、葡萄糖 10、MgSO4·7H2O 1、KH2PO41、酵母膏 5、自然pH（不加調(diào)整），121℃滅菌20min；

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）[13]：麩皮 20、硫酸銨1.5、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、吐溫-80 2mL，pH 5.0，121℃滅菌20min。

1.1.3 其他試劑 對(duì)硝基苯β-D-葡萄糖苷（pNPG）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，檸檬酸，檸檬酸鈉，無(wú)水碳酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

凈化工作臺(tái)（SW-CJ-270，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UⅤ-3200PC，上海精密科學(xué)儀器有限公司），全溫培養(yǎng)搖床（HZQ-A，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS，上海申安醫(yī)療器械廠），高速冷凍離心機(jī)（CR22GⅢ，HⅠTACHⅠ公司）

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn) 在 PDA斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌種，接種于裝有200mL種子培養(yǎng)液的500mL搖瓶中，28℃下培養(yǎng)48 h。按8%的接種量（4mL）接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250mL搖瓶中，28℃、170 r/min下培養(yǎng)4 d。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取 從搖瓶中取適量發(fā)酵液，4 500 r/min條件下離心10min，取上清液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0）稀釋5倍，用于酶活性的測(cè)定。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定[14]1.8mL、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.0）中加入0.1mL、10 mmol/L對(duì)硝基苯β-D-葡萄糖苷（pNPG）作為反應(yīng)底物，加入0.1mL酶液，45℃反應(yīng)30min后加入2mL、1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)并顯色，在410 nm處測(cè)定吸光值。45℃時(shí)，每min每mL酶液酶解1 μmol pNPG的酶活性濃度為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 以體積分?jǐn)?shù)計(jì)，分別以4%、6%、8%、10%和12%的接種量接種于裝液量為50mL的250mL搖瓶中，其他因素不變。

1.3.5.2 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 用1 mol/L HCl及1 mol/L KOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH，使發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6和6.5，其他因素不變。

1.3.5.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)定為 24、48、72、96、120、144、168和192 h，其他因素不變。

1.3.5.4 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響 在250mL搖瓶中分別加入50、75、100、125和150mL培養(yǎng)液，其他因素不變。

1.3.6 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立及產(chǎn)酶工藝條件優(yōu)化本研究以接種量（X1）、初始pH（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）、裝液量（X4）4個(gè)試驗(yàn)因素為主，以酶活力（U/mL）為響應(yīng)因素。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平編碼表。采用JMP 7.0數(shù)據(jù)處理軟件中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型及對(duì)產(chǎn)酶工藝條件的優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

理論上，當(dāng)接種量在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，酶活力會(huì)隨之增大，但接種量超過(guò)飽和量時(shí)，菌種的存活空間變小，產(chǎn)酶能力變低。從圖1可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)酶活力隨著接種量的增加而增大，當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)，酶活力達(dá)到最大。

圖1 接種量對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on production of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.2 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

在適合pH的條件下，菌種的產(chǎn)酶能力會(huì)提高。從圖2可見(jiàn)，隨著pH值的增大，菌種的產(chǎn)酶能力先提高后降低，pH在5.5時(shí)酶活力相對(duì)較高。

圖2 初始pH對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.2 Effect of fermentation pH on production of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵時(shí)間也是影響菌種發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。由圖3可見(jiàn)，黑曲霉產(chǎn)酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵120 h后酶活力逐漸趨于平穩(wěn)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.3 Effect of fermentation time on production of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.4 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

裝液量即為菌種的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶空間，同樣影響酶的活力。從圖4可見(jiàn)，裝液量在25mL到75mL范圍內(nèi)，酶活力增加的比較緩慢，當(dāng)裝液量為75mL時(shí)，酶活力達(dá)到最大值。

圖4 裝液量對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響Fig.4 Effect of broth content on production of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立及產(chǎn)酶工藝條件優(yōu)化

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平編碼表（表1）。試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表 1 因素水平編碼Table 1 Code of factors and levels

2.5.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選用“K折疊”交叉驗(yàn)證的方法建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results by Box-Behnken

在經(jīng)過(guò)多次對(duì)交叉驗(yàn)證組數(shù)K及隱藏節(jié)點(diǎn)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練之后，確定交叉驗(yàn)證組數(shù)K值為5，采用4×5×1結(jié)構(gòu)的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（圖5），即4個(gè)輸入神經(jīng)元，分別為接種量（X1）、初始pH（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）和裝液量（X4）；5個(gè)隱含層神經(jīng)元；1個(gè)輸出神經(jīng)元，代表響應(yīng)指標(biāo)酶活力（Y）。設(shè)置各參數(shù)值，隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)5，過(guò)擬合罰項(xiàng)0.001，歷程數(shù)16，最大迭代數(shù)50，收斂準(zhǔn)則0.000 01，交叉驗(yàn)證組數(shù)K為5，執(zhí)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合迭代過(guò)程，擬合決定系數(shù)r2值為0.99以上（圖6），說(shuō)明4×5×1結(jié)構(gòu)的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

2.5.3 產(chǎn)酶工藝條件優(yōu)化 固定接種量（X1）、初始 pH（X2）、發(fā)酵時(shí)間（X3）和裝液量（X4）4個(gè)因素中的兩個(gè)因素為中間水平，作三維曲面圖，將得到4個(gè)因素對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力的影響規(guī)律進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)Fig.5 Structure of artificial neural network

圖6 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相關(guān)性Fig.6 The correlation of actual values and the predicted values

從圖7a、7b、7c中可見(jiàn)，在pH值約低于5.5時(shí)，酶活力逐漸增加；而高于5.5后，酶活力逐漸降低，可見(jiàn)環(huán)境的酸堿程度會(huì)明顯影響酶的活力。有相關(guān)報(bào)道稱，酶活力降低的原因可能是菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成都有一個(gè)最適的酸堿環(huán)境，偏酸或偏堿的環(huán)境會(huì)抑制菌體內(nèi)的代謝，影響黑曲霉的正常生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酶量及酶活力降低[15-16]。

圖7a、7d和7e中顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力明顯增加，在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到約130 h后逐漸平穩(wěn)。這可能因?yàn)樵谝欢ǖ陌l(fā)酵時(shí)間內(nèi)，菌體量的增加使產(chǎn)酶量逐漸增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)減少，代謝產(chǎn)物積累，使菌體停止產(chǎn)酶[16]。

圖7b、7d和7f中顯示，酶活力隨著接種量的增加，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。接種量過(guò)低，產(chǎn)酶活力則低；接種量過(guò)大，可能會(huì)使菌體的濃度增大，培養(yǎng)液對(duì)菌體的供養(yǎng)不足，則產(chǎn)酶降低[17]。圖中顯示在約小于11%時(shí)，酶活力逐漸增加；當(dāng)約大于11%后，酶活力逐漸下降，這說(shuō)明接種量存在一個(gè)最適值。

圖7 接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inoculation amount、fermentation pH、fermentation time and broth content on production of enzymes

從圖7c、7e和7f中可見(jiàn)，裝液量對(duì)黑曲霉產(chǎn)酶的影響顯著，在裝液量大于約70mL時(shí)，酶活力有顯著下降的趨勢(shì)。這可能因?yàn)楹谇篂楹醚跷⑸?，裝液量過(guò)大，則溶氧量減少，致使菌體的生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶隨之降低[18]。

根據(jù)接種量、初始 pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量四個(gè)因素對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響規(guī)律，采用JMP 7.0軟件中的預(yù)測(cè)刻畫(huà)器，優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)酶的條件，預(yù)測(cè)刻畫(huà)見(jiàn)圖8。

從圖8中預(yù)測(cè)得出，當(dāng)接種量為11.09%，初始pH為5.65，發(fā)酵時(shí)間為130.91 h，裝液量為70.38mL時(shí)，黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力達(dá)到最大（120.33 U/mL）。考慮實(shí)驗(yàn)條件的可行性及易控性，確定黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最佳的工藝參數(shù)為：接種量為11.0%，初始pH為5.6，發(fā)酵時(shí)間為130 h，裝液量為70mL。

圖8 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測(cè)刻畫(huà)器Fig.8 Prediction plot of the neural network

2.5.4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證 為驗(yàn)證使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立的模型是否符合實(shí)際情況，隨機(jī)選取3組新的水平因素組合來(lái)測(cè)試該模型（表3）[19]，并對(duì)模型得出的最優(yōu)值進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

表3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值比較Table 3 Predicted values of neural network model and experimental values

從表3的結(jié)果可看，建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確，說(shuō)明使用該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立的模型可對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-糖苷酶具有很好的預(yù)測(cè)能力。經(jīng)過(guò)單因素及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化，酶活力提高48.61%。孫海彥[20]等通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化黑曲霉產(chǎn) β-葡萄糖苷酶，使酶活力提高了46%，凌宏志[21]等通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化黑曲霉HDF05產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，僅使酶活力提高了23.9%，說(shuō)明本研究的結(jié)果處于較優(yōu)水平。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，利用JMP 7.0軟件建立了黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn) β-葡萄糖苷酶的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，從接種量、初始 pH、發(fā)酵時(shí)間及裝液量等 4個(gè)方面探討了其交互作用，以及對(duì)黑曲霉生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響，得到最佳發(fā)酵工藝條件為接種量11.0%、初始pH 5.6發(fā)酵時(shí)間130 h、裝液量70.0mL，制備的β-葡萄糖苷酶的最大酶活力為118.73 U/mL，與單因素優(yōu)化前（61.01 U/mL）相比提高了48.61%。

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[19]張良,劉書(shū)成,章超樺,等.神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化牡蠣的高密度 CO2殺菌工藝[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2011（12）：369-373.

[20]孫海彥，王茜，劉恩世，等.響應(yīng)面方法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn) β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基成分的研究[J].輕工科技，2012，167（10）： 8-9，20.

[21]凌宏志，葛菁萍，平文祥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉HDF05產(chǎn)β-葡萄糖苷酶過(guò)程參數(shù)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2011（3）： 419-426.

（責(zé)任編輯：陳莊）

Optimization of Conditions for Producing β-Glucosidase by Aspergillus niger Based on Neural Network

GAO Qian，QⅠN Xiao-ming，ZHONG Sai-yi，CHEN Jian-ping
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

Based on the single factor experiments，this research obtained high enzyme activity of β-glucosidase from Aspergillus niger CⅠCC 2475 by using Box-Behnken center-united design and JMP 7.0 neural network，the conditions of β-glucosidase were optimized by the control of inoculation amount，fermentation pH，fermentation time and broth content.The results showed that： the inoculation amount was about 11.0%，the initial pH of 5.6，fermentation time was 130 hours and broth content 70.0mL，the enzyme activity of Aspergillus niger fermentation β-glucosidase reached the maximum（118.73 U/mL），compared with the previous optimization（61.01 U/mL），the enzyme activity increased by 48.61%.

Aspergillus niger CⅠCC 2475；β-glucosidase；neural network

TQ925

A

1673-9159（2017）01-0087-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.014

2016-07-11

廣東省教育廳創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目（2013050214）

高倩（1990—），女，碩士研究生，研究方向農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

秦小明，博士，教授，研究方向亞熱帶食品新資源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail:xiaoming0502@21cn.com