陜西省腫瘤醫(yī)院內一科(西安 710061)李 旭 安改麗 黃尚科 鄭 琪 張 茜 廖子君 趙新漢#

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阿帕替尼對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞抑制作用體外研究*

陜西省腫瘤醫(yī)院內一科(西安 710061)李 旭 安改麗△黃尚科▲鄭 琪 張 茜 廖子君 趙新漢▲#

目的:探討阿帕替尼對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231生長影響及其機制。方法：將不同濃度的阿帕替尼作用乳腺癌MDA-MB-231細胞24h、48h、72h，采用MTT法檢測不同濃度及時間的阿帕替尼對MDA-MB-231細胞的生長抑制作用；采用流式細胞儀檢測阿帕替尼對MDA-MB-231細胞作用后的凋亡率及其細胞周期分布的影響。結果：阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞有明顯的生長抑制作用，且存在時間劑量依賴關系；阿帕替尼可以明顯的促進細胞凋亡, 其凋亡率隨時間延長而顯著增加, 與對照組相比, 差異具有統(tǒng)計學意義；阿帕替尼對MDA-MB-231細胞的作用與其對細胞周期的相關性作用不明顯。結論 阿帕替尼能通過誘導細胞凋亡抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖能力。

新生血管為腫瘤的生長和發(fā)展提供了必要的條件,腫瘤血管生成和腫瘤發(fā)生和發(fā)展的密切關系，所以腫瘤血管成為抗腫瘤治療的重要靶點之一，這在多種惡性腫瘤的治療中得到了驗證和應用[1]。近年來乳腺癌抗血管生成治療再次引起了人們的廣泛關注[2-3]。甲磺酸阿帕替尼片是一種口服的小分子抗血管生成新藥，通過抑制腫瘤血管生成來發(fā)揮抗腫瘤的作用，目前臨床發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤有抗腫瘤作用。不僅可以抑制腫瘤新生血管, 還能直接抑制腫瘤細胞的生長發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。三陰性乳腺癌是一種特殊類型的乳腺癌亞型，不能從內分泌治療和抗Her-2治療中獲益，是目前臨床研究的熱點和難點，作為三陰性乳腺癌代表的MDA-MB-231細胞系被發(fā)現(xiàn)與血管生成較為密切。因此，本研究旨在探討阿帕替尼對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的影響及可能機制，為阿帕替尼應用于三陰性乳腺癌患者的治療提供實驗基礎。

材料與方法

1 材 料 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株(中科院上海細胞庫)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；噻唑蘭(MTT)(美國sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國sigma公司)；Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒(江蘇凱基)；DNA含量檢測試劑盒(細胞周期)(江蘇凱基)；細胞培養(yǎng)箱( 美國Thermo 公司)；Genios 多功能酶標儀( 美國TECAN 公司)； FACScan 流式細胞儀( 美國BD 公司)； Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描儀(美國LI-COR 公司產(chǎn)品)；倒置顯微鏡( DXM1200) (日本Nikon 公司)。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)：對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞采用含10%小牛血清的RMPI-1640進行培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待其貼壁生長至70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞實驗。

2.2 細胞增殖抑制率檢測：取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細胞以約1×104/ml密度接種于96孔板上，將5、10、20、40、80 g/ml濃度的阿帕替尼分別加入孔內，每孔加200l，每組5個復孔。以含相同濃度的DMSO培養(yǎng)液為對照，培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 L，孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 L DMSO，振蕩10 min，充分溶解結晶物。用多功能微板測試系統(tǒng)于490 nm處測定OD值。實驗重復3次。抑制率(%)=(1-試驗孔平均OD 值/對照孔平均OD值)×100%，繪制生長抑制曲線。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡：取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞消化后將細胞濃度控制在1×106個/ml，以2ml/孔接種于6孔板內，RPMI-1640培養(yǎng)基孵育48h 后，用阿帕替尼(20mg/ml)處理24h 、48h 、72h后, 收集各處理組MDA-MB-231細胞。細胞周期檢測將收集的細胞用PBS 洗滌二次后以70 %乙醇4 ℃固定過夜, 加入RNA 酶至終濃度為100 mg/ml , 加入PI 至終濃度50 mg/ml , 37 ℃避光染色30 min,流式細胞儀檢測。凋亡檢測采用不含EDTA的胰酶消化收集后，用PBS洗滌細胞2次，加入500ml的Bingding Buffer懸浮細胞，加入5ml Annexin-V/PI混勻后，加入5ml PI，混勻后室溫避光反應15min后在1h內進行流失細胞儀的檢測。本實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學軟件進行獨立樣本t檢驗及多個樣本均數(shù)比較的方差分析， 以P<0 .05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MTT 不同濃度梯度的阿帕替尼作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞24 -72 h 后, 其生長抑制率，見表1。繪制生長抑制曲線，見圖1。多個樣本均數(shù)比較的方差分析顯示,阿帕替尼24h組與阿帕替尼作用72h組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。阿帕替尼對MDA-MB-231細胞體外生長具有明顯的增殖抑制作用, 隨濃度的增加, 抑制率明顯升高, 呈現(xiàn)明顯的時間-劑量依賴關系 (P<0 .05)。

表1 阿帕替尼作用MDA-MB-231細胞不同時間的生長抑制率

圖1 阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞生長抑制

2 流式細胞儀測定細胞凋亡及細胞周期 MDA-MB-231細胞經(jīng)20mg/ml的阿帕替尼分別處理24h、48h、72h后, 與空白對照組一起上流式儀檢測凋亡情況。結果對照組、阿帕替尼24h、48h、72h組凋亡率均值分別為0.46 %、5.32 %、9.17 %、13.83 %,對照組與各干預組，以及各干預組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示阿帕替尼處理后各組細胞凋亡率均顯著增加, 呈時間依賴關系(圖2、圖3)。阿帕替尼20mg/ml作用MDA-MB-231細胞48h，與空白對照比較細胞周期，處理組G0/G1、G2/M、S期均值比例分別為63.15%、31.76%、5.09%；對照組分別為62.64%、32.89%、4.47%，處理組對細胞周期無明顯影響，同對照組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

討 論

乳腺癌是一類異質性很高的惡性腫瘤，基于分子表型可分為4種亞型：Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2過表達型和基底樣型[5]。四種不同分子亞型的乳腺癌患者具有不能的臨床病理特征及不同的預后，治療方面也存在一定的差異[6]。 三陰性乳腺癌(TNBC)是ER、PR、Her-2受體均陰性的乳腺癌，是具有獨特生物學特性及臨床特征的一種乳腺癌亞型,有將近10%～20.8%的乳腺癌患者屬于此種類型[7]。由于其不能從內分泌治療及靶向Her-2治療中獲益，導致三陰性乳腺癌患者預后差、復發(fā)轉移率高、病死率高。

圖2 阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞不同作用時間點流式凋亡

圖3 阿帕替尼對乳腺癌MDA-MB-231細胞不同作用時間流式凋亡率比較

隨著科學家對惡性腫瘤認識的不斷加深，腫瘤抗血管生成已經(jīng)成為當今腫瘤研究的熱點及治療新策略。甲磺酸阿帕替尼片是一種小分子抗血管生成的口服抑制劑，通過高度選擇性地抑制血管內皮生長因子受體-2( VEGFR-2) 酪氨酸激酶的活性，阻斷血管內皮生長因子( VEGF) 與其受體結合后的信號轉導通路，從而抑制腫瘤血管生成，實現(xiàn)抗腫瘤作用[8]。2014年12月國家食品藥品管理監(jiān)督總局( CFDA)批準其為晚期胃癌或胃食管結合部腺癌三線及三線以上治療方案。

本研究用不同濃度的阿帕替尼作用MDA-MB-231細胞24～72 h 后, 采用MTT 法檢測不同濃度實驗組的細胞生長抑制率, 結果表明MDA-MB-231細胞的生長受到明顯抑制,抑制率隨阿帕替尼濃度和作用時間的增加而增加, 呈一定的時間-劑量依賴關系?？梢姲⑴撂婺釋DA-MB-231細胞的生長抑制作用可能還通過誘導腫瘤細胞的凋亡發(fā)揮直接抗腫瘤作用[4]。本實驗觀察阿帕替尼作用MDA-MB-231細胞的凋亡情況，證實阿帕替尼可以誘導MDA-MB-231細胞的凋亡,凋亡率隨給藥時間的遞增而增強。是否也參與對MDA-MB-231細胞血管生成的作用還有待進一步研究?？傊?，阿帕替尼對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞具有生長抑制作用，且存在時間-劑量依賴關系；阿帕替尼可以誘導細胞凋亡，其對乳腺癌MDA-MB-231的抑制作用機制與其促進乳腺癌細胞凋亡有關。

阿帕替尼作為新型的口服小分子抗血管生成抑制劑新藥，以其毒性低,療效確切的特點在腫瘤治療中備受矚目。其不僅通過抑制腫瘤新生血管起到抗腫瘤作用，我們的研究證實其也能通過直接抑制腫瘤細胞的生長、誘導腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為阿帕替尼和其他腫瘤治療方式的結合, 提高腫瘤綜合治療療效提供了一定的實驗基礎,我們還將研究其與其他化療藥物聯(lián)合應用的抗腫瘤作用機制，為以后其臨床應用提供更充分的實驗依據(jù)。

[1] 王志東，楊 軍，李宗芳.腫瘤抗血管生成靶向治療[J].中國實用外科雜志, 2010,30(7):613-615.

[2] 朱鵬晉，鄒立群.三陰乳腺癌抗血管生成治療進展及影像學評價[J].華西醫(yī)學，2015, 30(8):1587-1592.

[3] Luo M, Hou L, Li J,etal.VEGF/NRP-1axis promotes progression of breast cancer via enhancement of epithelial-mesenchymal transition and activation of NF-κB and β-catenin[J].Cancer Lett,2016,(16):22-27.

[4] Scott AJ, Messersmith WA, Jimeno A,etal.Apatinib: A promising oral antiangiogenic agent in the treatment of multiple solid tumors[J].Drugs Today (Barc),2015,51(4):223-229.

[5] 張改華,杜文英. 乳腺癌151例分子亞型臨床與病理特點[J]. 陜西醫(yī)學雜志,2014,43(7):909-911.

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(收稿：2016-02-23)

The inhibitory effect of Apatinib on the growth of triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 in vitro Department of First Internal Medicine, Shaanxi Province Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Li Xu An Gaili Huang Shangke et al

Objective: To investigate the effect of Apatinib on the proliferation of triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 cells as well as the relevant underlying mechanism. Methods:MDA-MB-231 cells were treated with Apatinib at different concentration and different time, Cell growth inhibition was assessed by MTT, the apoptosis and cell cycle changes of the cells in response to apatinib treatment were observed by flow cytometry. Results:Apatinib significantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells in vitro, and the inhibition effects presented with time-and dose-dependent response. Apatinib treatment obviously increased the apoptotic rate of the MDA-MB-231cellsina time-dependent manner, and the difference has statistical significance compared with the control group; but produced no significant effect on the cell cycle. Conclusion: Apatinib inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells through inducing cell apoptosis.

Breast neoplasms/immunology Angiogenesis inhibitors MDA-MB-231 Cell proliferation Apoptosis

*陜西省自然科學基金資助項目(2015JM8394)

乳腺腫瘤/免疫學 血管生成抑制劑/治療應用 MDA-MB-231 細胞增殖 細胞凋亡

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.002

陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目(2014D15)

△陜西省人民醫(yī)院

▲西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內科

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