陜西省人民醫(yī)院血液病研究室(西安 710068)

韓秀蕊 楊娣娣 張麗潔 李艷春 趙 園 王九菊 趙喬佳杰 魏緒倉(cāng)△

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·臨床檢驗(yàn)·

骨髓形態(tài)聯(lián)合免疫分型檢測(cè)對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病診斷及預(yù)后價(jià)值研究*

陜西省人民醫(yī)院血液病研究室(西安 710068)

韓秀蕊 楊娣娣 張麗潔 李艷春 趙 園 王九菊 趙喬佳杰 魏緒倉(cāng)△

目的：探討慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者骨髓形態(tài)、免疫表型特征，以及它們之間的關(guān)系。方法；采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)89例CLL患者骨髓或外周血標(biāo)本進(jìn)行免疫表型檢測(cè)，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析將CLL患者分為典型CLL和混合型CLL兩組，比較兩組之間各抗原表達(dá)差異，并分析其對(duì)預(yù)后的影響。結(jié)果： 89例CLL患者抗原表達(dá)陽(yáng)性率由高至低依次為CD19(98.9%)、HLA-DR(97.8%)、CD5(88.8%)、CD20(85.4%)、CD22(71.9%)、CD23(61.8%)、CD38(39.3%)、FMC-7 (11.2%)、CD3(2.2%)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型89例CLL中，典型CLL72例(80.9%)，混合型CLL17例(19.1%)。CD38在典型CLL及混合型CLL組間的陽(yáng)性表達(dá)存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、HLA-DR、FMC-7各抗原在兩組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.預(yù)后分析顯示混合型CLL生存期較典型CLL短(P<0.01),死亡患者與存活患者之間CD38表達(dá)差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫表型分析不僅是CLL診斷、鑒別診斷的主要手段，而且對(duì)預(yù)后判斷具有重要價(jià)值。

慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia ,CLL)是淋巴細(xì)胞的惡性增殖性疾病，其特征為近似成熟的小淋巴細(xì)胞在外周血、骨髓、外周淋巴器官高度聚集。2008年國(guó)際CLL診斷組與美國(guó)國(guó)家癌癥研究所共同發(fā)表了CLL診斷指南[1]，定義CLL為B細(xì)胞腫瘤。本研究對(duì)89例初診CLL患者的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型資料進(jìn)行了回顧性分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 89例患者選自2005年l月至2015年10月在我院就診的CLL患者，其中男60例 , 女29 例, 年齡27～86歲。

2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 所有患者骨髓涂片經(jīng)瑞-姬氏染色后由有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，每份骨髓涂片分類200～500個(gè)有核細(xì)胞，CLL診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)參照 《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn) 》[ 2]。

3 免疫分型檢測(cè) 取肝素抗凝的骨髓液或外周血 3 ～ 5 ml , 經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離獲取單個(gè)核細(xì)胞 , 以CD45/ SSC設(shè)門采用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國(guó) Becton Dickinson 公司) 進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果采用 CellQuest 軟件進(jìn)行分析。檢測(cè)的單克隆抗體包括、 CD5、CD19、 CD20、CD22、CD10、CD23、CD38、HLA-DR、FCM-7、CD3、CD7。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn): 白血病細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性率 ≥20 %為陽(yáng)性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier方法及Long-rank檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 89例CLL患者中，典型CLL最常見占 72例(80.9%)，CLL/PL15例(16.9%)，大小細(xì)胞混合型CLL最少見2例(2.2%)(為了便于分析，我們將CLL/PL及混合型CLL均歸為混合細(xì)胞型CLL組)。所有患者骨髓象增生度均達(dá)活躍-極度活躍，淋巴細(xì)胞比例明顯增高，多為類似成熟的小淋巴細(xì)胞，伴有不同比例的幼稚淋巴細(xì)胞、粒系、紅系及巨核系表現(xiàn)不同程度減少。

2 免疫表型檢測(cè)結(jié)果 89例CLL 患者抗原表達(dá)陽(yáng)性率由高至低依次為CD1998.9%(88/89)、HLA-DR 97.8%(87/89)、CD588.8%(79/89)、CD2085.4%(76/89)、CD2271.9%(64/89)、CD2361.8%(55/89)、CD3839.3%(35/89)、FMC-7 11.2%(10/89)、CD32.2%(2/89)；無1例表達(dá)CD7及CD10。

3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分型與免疫表型的關(guān)系 典型CLL與混合細(xì)胞型CLL兩組間CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC-7及HLA-DR陽(yáng)性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)而混合型CLL中CD38陽(yáng)性表達(dá)的比例明顯高于典型CLL組，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見附表。

附表 典型CLL與混合型CLL免疫表型比較[n(%)]

4 預(yù) 后 有完整隨訪資料的患者69例，死亡15例。其中典型CLL 53例，6例死亡，中位生存期為118個(gè)月，混合細(xì)胞型CLL 16例，死亡9例，中位生存期63個(gè)月，經(jīng)Long-rank檢驗(yàn)，兩組生存期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。15例死亡病人中CD38陽(yáng)性表達(dá)10例，存活患者54例中CD38陽(yáng)性表達(dá)15例，經(jīng)χ2檢驗(yàn)死亡患者與存活者之間CD38陽(yáng)性表達(dá)存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

討 論

慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)屬慢性B淋巴細(xì)胞增殖性疾病，外周血/骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是CLL最基本及主要的診斷方法。根據(jù)幼稚淋巴細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中所占的不同比例可將CLL分為三種亞型。①典型CLL：90%以上為類似成熟的小淋巴細(xì)胞；②CLL伴隨幼淋細(xì)胞增多(CLL/PL)：幼稚淋巴細(xì)胞>10%,但<54%。③混合細(xì)胞型：有不同比例的不典型淋巴細(xì)胞，幼稚淋巴細(xì)胞<10%。本組89例CLL患者中72例(80.9%)為典型CLL，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)以體積較小的類似成熟小淋巴細(xì)胞為主；15例(16.9%)為CLL/PL，形態(tài)除見小淋巴細(xì)胞外，還可見到11～52%的幼稚淋巴細(xì)胞，該類細(xì)胞胞體較大，核染質(zhì)細(xì)致，可見核仁1～2個(gè)，胞質(zhì)量較豐富；混合型CLL 2例(2.2%)，幼稚細(xì)胞胞體較大，核漿比減低，胞漿呈不同程度嗜堿性。本研究將CLL/PL及混合細(xì)胞型CLL均歸為混合細(xì)胞型CLL，本文混合細(xì)胞型CLL占所有病例19.1%，與文獻(xiàn)報(bào)道大致相符。Baeso-Ramos等[3]研究認(rèn)為，混合型CLL細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和凋亡活性，患者更易發(fā)生克隆性染色體異常，預(yù)后較差。本研究證實(shí)混合細(xì)胞型CLL生存期較典型CLL短，是獨(dú)立的預(yù)后不良因素之一，因此瘤細(xì)胞形態(tài)特征不僅是CLL診斷的主要指標(biāo)，而且對(duì)預(yù)后評(píng)估也具有重要意義。

細(xì)胞免疫分型是診斷血液惡性腫瘤的重要參考指標(biāo)之一，它對(duì)CLL的診斷、鑒別診斷及預(yù)后判斷具有重要意義，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL) 是一種B 淋巴細(xì)胞腫瘤，CLL 細(xì)胞主要的表型特點(diǎn)是 CD5陽(yáng)性 B 細(xì)胞， 即CD5+CD19+，同時(shí)表達(dá)CD23、CD20， 弱表達(dá)CD22， 不表達(dá)CD79b ，F(xiàn)MC7。 本研究中CLL 抗原表達(dá)陽(yáng)性率最高的是CD1998.9%及H LA-D R 97.8%；其次為CD588.8%、CD2085.4%、CD2271.9%；CD23、 CD38則分別為 61.8%和39.3%；由此可見大部分CLL同時(shí)表達(dá)CD19、CD5、CD20及CD22，它們可作為CLL診斷的重要依據(jù)。一般認(rèn)為，CD5+是CLL的重要特征，但是確實(shí)存在少數(shù)CD5陰性CLL。Inamdar 等[4]報(bào)道7 %～20 %的 CLL 患者不表達(dá)CD5。本研究89例CLL患者中有10例(11.2%)為CD5陰性，與Inamdar 等結(jié)果相一致，因此對(duì)于CD5陰性而CD19和CD20陽(yáng)性的患者，在診斷時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，需結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)，遺傳學(xué)及臨床表現(xiàn)綜合分析判斷。

CD38表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為CD38表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Gentile等[ 5]對(duì)242例患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn) CD38+與 CD38-相比，男性多于女性, 血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)顯著減少 ,淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，CD38+患者PFS較CD38-者明顯縮短, 對(duì)化療藥物反應(yīng)差 , 病情進(jìn)展迅速 , 完全緩解率低 。CD38+還是疾病侵襲性的一個(gè)重要標(biāo)志, 無論患者的臨床分期如何，即使處于Rai分期的0期,CD38+患者亦常具有明顯的侵襲性。本研究結(jié)果顯示典型CLL與混合型CLL兩組之間CD38陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且死亡患者與存活患者之間CD38表達(dá)也存在明顯的差異，提示CD38陽(yáng)性表達(dá)時(shí)預(yù)后較差，CD38可作為判斷CLL患者的預(yù)后指標(biāo)。易莎等[6]研究報(bào)道60.42%CLL患者CD38陽(yáng)性表達(dá)。本文CD38陽(yáng)性率39.3%較易莎研究結(jié)果低，可能與病例數(shù)較少有關(guān)，有待今后繼續(xù)研究。

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(收稿：2016-03-14)

The research on the value of cell morphology combined with immunophenotyping test in the diagnosis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068) Han Xiurui Yang Didi Zhang Lijie et al

Objective: To investigate cell morphology and immunophenotypes characteristics of CLL patients and to understand the relationship between them .Methods: Immunophenotyping of bone marrow and blood specimens was performed in 89 CLL patients by flow cytometry, meanwhile the patients were divided into the typical CLL group and the mixed CLL group according to the analysis of cell morphology. We compared the antigen expression differences between the two groups, and thus analyzed the impact of the differences on prognosis. Results: In all patients, the rates of antigen expression from high to low were CD19(98.9%), HLA-DR(97.8%), CD5(88.8%), CD20(85.4%)，CD22(71.9%),CD23(61.8%),CD38(39.3%), FMC-7 (11.2%)and CD3(2.2%) . For cell morphologic classification of 89 cases, 72 (80.9%) cases were typically CLL and 17(19.1%) cases mixed CLL. There was significant difference in the expression of CD38between the typical CLL and mixed CLL group . There were no significant differences in the expressions of CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, HLA-DR, FMC-7 between the two groups . Prognostic analysis showed that the survival time of mixed CLL patients was shorter than that of typical CLL patients (P<0.01), the difference of the expression of CD38between the deceased and survived patients was statistically significant .Conclusion: The combination of cell morphology and phenotype analysis is not only the main means of CLL diagnosis and differential diagnosis, and also has great value for prognosis estimation.

Leukemia,lymphocytic,chronic,B-cell/diagnosis Immunophenotyping Bone marrow cells Prognosis

*陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(2011K12-23)

白血病，淋巴細(xì)胞,慢性B-細(xì)胞/診斷 免疫表型分型 骨髓細(xì)胞 預(yù)后

R

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.049

△通訊作者