沈陽軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科(沈陽110016) 劉 蕾 馬 壯 謝 華 孫文武

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·論著·基礎研究·

氧化苦參堿干預TGF-β1誘導A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用研究*

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院呼吸科(沈陽110016) 劉 蕾 馬 壯 謝 華 孫文武

目的：探討氧化苦參堿(Oxy)對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導肺泡上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預作用，期望為肺纖維化治療提供新的候選藥物。方法：選用0.25、0.5、1 mg/ml氧化苦參堿預處理A549細胞30 min后，再給與(5 ng/ml)TGF-β1共孵育培養(yǎng)48 h，MTT法檢測細胞增殖變化，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，Western blot檢測TGF-β1下游信號分子Smad2/3磷酸化變化和EMT標志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin表達變化。結(jié)果：氧化苦參堿能有效干預TGF-β1誘導A549細胞細胞增殖、細胞形態(tài)變化，抑制TGF-β1介導的Smad2/3磷酸化和E-candherin表達下調(diào)、N-cadherin和Vimentin表達上升。結(jié)論：氧化苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，氧化苦參堿可以作為抗肺纖維化治療的候選藥物。

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是各種不同病因所致肺部疾病的共同結(jié)局，包括特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、結(jié)節(jié)病、塵肺、過敏性肺炎、藥物和放射線導致肺纖維化以及與膠原血管病有關的致肺纖維化肺泡炎等。肺纖維化的致死率高，5年生存率僅次于肺癌，且其發(fā)病率正呈逐年上升趨勢[1]。肺纖維化的發(fā)病機制復雜，目前研究認為上皮細胞受損后發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞，同時成纖維細胞發(fā)生異常增殖是肺纖維化形成的兩個主要環(huán)節(jié)[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor，TGF-β1)是一種重要的致纖維化生長因子，能夠通過其下游TGF-β受體以及Smads蛋白刺激成纖維細胞增殖和膠原的合成，促進膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖等在細胞外基質(zhì)中沉淀，減少細胞外基質(zhì)的降解，在很多器官纖維化疾病中都被認為是纖維化的“總開關”[3]。研究報道指出，TGF-β1介導的肺泡上皮細胞EMT是介導肺纖維化的主要機制之一[4]。氧化苦參堿(Oxymatnine, Oxy)，又稱苦參堿，是從豆科植物苦參(Sophora flavescens ait)或萍科植物廣豆根(Sophora subprostrata)中分離出來的生物堿。研究表明其能夠直接抑制乙型肝炎的復制，并能夠阻斷肝細胞的凋亡同時抑制肝纖維化的發(fā)生[5]。本研究中，我們體外培養(yǎng)人肺泡II型上皮細胞A549，TGF-β1誘導其發(fā)生EMT，使用氧化苦參堿干預處理，觀察對細胞增殖、細胞形態(tài)、細胞EMT發(fā)生的影響,期望為肺纖維化治療提供新的候選藥物，有效提高肺纖維化患者的治療效果和生存率。

材料和方法

1 實驗材料 人肺泡II型上皮細胞A549購自北京協(xié)和醫(yī)學研究所細胞庫；TGF-β1重組蛋白購自 Sigma公司(純度分別 >99%)；氧化苦參堿購自Baomanbio公司(純度分別>99%)；兔抗人Smad2/3、p-Smad2/3、E-candherin、N-cadherin、Vimentin和β-actin 多克隆抗體和HRP 標記羊抗兔 IgG 購自沈陽萬類科技有限公司；ECL 化學發(fā)光試劑盒為 Pierce 公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)培養(yǎng)基為 Gibco 公司產(chǎn)品，細胞培養(yǎng)所用胎牛血清購自Hyclone公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)： 人肺泡A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)以及細胞生長情況，待細胞長至80%融合時進行消化傳代。

2.2 實驗分組： 對數(shù)生長期A549細胞隨機分為5組：A：對照組(Control)；B：TGF-β1處理組(TGF-β1)；C:TGF-β1+氧化苦參堿低劑量組(TGF-β1+L-Oxy)；D:TGF-β1+氧化苦參堿中劑量組(TGF-β1+M-Oxy)；E:TGF-β1+氧化苦參堿高劑量組(TGF-β1+H-Oxy)。氧化苦參堿預處理30 min后，再給與(5 ng/ml)TGF-β1共孵育培養(yǎng)48 h，氧化苦參堿參考劑量分別為0.25、0.5、1 mg/ml。

2.3 MTT法檢測氧化苦參堿干預對TGF-β1誘導A549細胞增殖的影響： 選擇對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，按2000/孔的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后換液為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入濃度為0、0.25、0.5、1 mg/ml氧化苦參堿預處理30 min后，再給與(5 ng/ml)TGF-β1共孵育48 h，每組設置5個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后分別加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，加入DMSO 150 μl，充分震蕩20 min，于酶標儀上測定其在490 nm處的吸光度值。

2.4 Western blot檢測各組細胞TGF-β信號通路以及EMT相關指標的表達： 收集各組細胞后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4℃ 12000 rpm/min離心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白樣品，于10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后100 V電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將PVDF膜放入封閉液中37℃封閉1 h，稀釋一抗4℃孵育過夜。PBS洗膜4次，加入堿性磷酸酶標記的稀釋二抗孵育，37℃震搖1 h，洗膜。ECL發(fā)光法曝光成像，掃描入電腦并進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件。各組實驗測試指標經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗呈正態(tài)分布，以平均值±標準差表示，經(jīng)F檢驗證實方差齊。采用單因素方差分析，組間的兩兩比較均采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 氧化苦參堿干預TGF-β1誘導A549細胞增殖 MTT法檢測細胞增殖，測量OD490值代表細胞數(shù)的多少，體現(xiàn)細胞增殖能力的變化。按照實驗分組干預處理48h得到氧化苦參堿(Oxy)干預后，TGF-β1誘導A549細胞增殖能力逐漸減弱，低中高Oxy干預組與TGF-β1處理組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。表明Oxy能有效抑制TGF-β1誘導的A549細胞增殖,見表1。

表1 氧化苦參堿干預TGF-β1誘導A549細胞增殖的影響

2 氧化苦參堿干預TGF-β1誘導A549細胞形態(tài)變化 熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，得到與對照組細胞相比，TGF-β1處理細胞與鄰近細胞分離，細胞形態(tài)從鵝卵石狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，由上皮性細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞狀。低中高濃度Oxy干預后，細胞形態(tài)變化有所緩解，其中高濃度Oxy干預效果最佳，細胞形態(tài)與對照組相比未有明顯改變(圖1)。表明Oxy能有效抑制TGF-β1誘導的A549細胞間充質(zhì)狀轉(zhuǎn)化。

3 氧化苦參堿干預TGF-β1誘導A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 TGF-β1活化Smad2/3信號調(diào)控上皮細胞EMT發(fā)生。Western blot 法檢測Smad2/3、p-Smad2/3表達得到，TGF-β1處理后 p-Smad2/3表達上調(diào)，使用Oxy干預后，能有效抑制p-Smad2/3，高濃度Oxy作用后p-Smad2/3表達下調(diào)最明顯(圖2A)。表明Oxy能有效干預TGF-β1/Smad2/3信號活化。同時檢測EMT標記分子的表達變化，得到TGF-β1處理后，A549細胞上皮標記分子E-candherin表達降低，間質(zhì)標記分子N-cadherin和Vimentin的表達上調(diào)，Oxy干預能有效恢復E-candherin表達，降低N-cadherin和Vimentin的表達，高濃素Oxy作用效果更明顯(圖2B)。表明氧化苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導的A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其可能的機制為干預TGF-β1/Smad2/3信號活化。

圖2 氧化苦參堿干預TGF-β1誘導A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[A：Western blot 法檢測TGF-β1下游信號Smad2/3的活化(p- Smad2/3的表達)；B：Western blot 法檢測細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志分子E-candherin、N-cadherin和Vimentin的表達]

討 論

EMT在肺纖維化發(fā)生中發(fā)揮重要作用，抑制EMT發(fā)生有助于緩解肺纖維化[6]。本研究通過使用TGF-β1體外處理肺泡Ⅱ型上皮細胞A549，誘導細胞EMT發(fā)生；通過氧化苦參堿干預，得到氧化苦參堿能夠有效抑制TGF-β1誘導的細胞增殖、細胞形態(tài)的改變；并檢測得到氧化苦參堿能夠有效抑制TGF-β1下游信號分子Smad2/3的磷酸化，抑制間質(zhì)細胞標志分子N-cadherin和Vimentin的表達，恢復E-candherin的表達。這些提示氧化苦參堿可能通過干預TGF-β1介導的Smad2/3的活化，抑制A549細胞EMT；氧化苦參堿可以作為抗肺纖維治療獲選藥物。

研究顯示，在多種肺疾病中，例如哮喘、慢性阻塞性肺病、先天性肺纖維化、博來霉素誘導的肺纖維化等病理損害誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞向肌成纖維母細胞分化通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，喪失正常表皮完整性，細胞粘附分子E-candherin和ZO-1表達丟失；增加間質(zhì)表型分子的表達如N-cadherin和Vimentin，增強細胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力，介導肺纖維化的發(fā)生[7]。在PF早期階段肺泡巨噬細胞數(shù)量和活性增多，合成釋放大量具有多種活性的細胞因子、前炎性介質(zhì)、趨化因子及蛋白酶類；TGF-β1是關鍵的纖維相關因子，其能有效誘導上皮性細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，增殖分化為肌成纖維細胞母細胞，誘導肺纖維組織的細胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生，當肺泡Ⅱ型上皮細胞慢性接觸TGF-β1后細胞將經(jīng)歷EMT[8]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在百草枯處理的大鼠血清和肺組織增加，TGF-β1 mRNA表達水平逐漸增加在第7天達到一個峰值，且TGF-β1增加在羥基脯氨酸和膠原蛋白增加之前，干預TGF-β1/Smads信號活化后將有效抑制肺纖維化，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[11]。本研究中，體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細胞A549，使用TGF-β1處理，觀測得到TGF-β1處理能有效促進細胞增殖、細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞間粘附減少，細胞呈長梭形，表現(xiàn)間質(zhì)樣表型；同時檢測細胞EMT標記分子得到E-candherin表達降低、N-cadherin和Vimentin表達增加。表明已成功建立TGF-β1誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞的EMT轉(zhuǎn)化。

氧化苦參堿具有廣泛的抗腫瘤、抗心律失常、抗炎以及抗病毒等多種藥理作用，苦參堿及其制劑的開發(fā)與應用已成為近年來藥學領域的熱門課題之一[10]。馬鵬等[11]報道，氧化苦參堿能夠改善晚期肝癌患者肝功能，降低AFP、CEA和CA125,延長患者生存時間。張靜等[12]報道，氧化苦參堿可使慢性中度乙肝患者肝功能復常，膠原纖維下降及凝血酶原活動度恢復得到明顯改善。已有的研究提示氧化苦參堿能夠通過抑制TGF-β1誘導的Smad3的磷酸化和核轉(zhuǎn)移有效抑制瘢痕纖維母細胞膠原蛋白的表達[13]，通過抑制NF-κB通路減少炎性細胞因子生成，進而抑制腎纖維化[14]。我們的前期研究證實氧化苦參堿能夠通過有效緩解小鼠肺纖維化，抑制炎癥反應和氧化應激損傷，下調(diào)炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，降低MPO活性和MDA水平，并能有效抑制TGF-β1的表達及其下游信號分子Smad2/3的活化[15]。本研究中，通過使用高、中、低三個濃度的氧化苦參堿干預TGF-β1誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞的EMT轉(zhuǎn)化，得到氧化苦參堿能有效抑制TGF-β1誘導的增殖、細胞形態(tài)的間質(zhì)變化，恢復E-candherin的表達，降低N-cadherin和Vimentin表達，且可能的機制亦與干預Smad2/3的活化有關。表明氧化苦參堿能有效干預TGF-β1誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞上皮機制轉(zhuǎn)化，可能成為有效的抗肺纖維化藥物。

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(收稿：2016-01-14)

Effect of oxymatnine on TGF-β1 inducing A549 epithelial to mesenchymal cell transition Department of Respiratory Diseases,Shenyang Military Region General Hospital

(Shen yang 110016) Liu Lei Ma Zhuang Xie Hua et al

Objective: We investigated the effect of Oxymatnine (Oxy) on TGF-β1 inducing alveolar epithelial to mesenchymal cell transition, and hope to provide a new candidate for the treatment of pulmonary fibrosis. Methods: After treatment with 0.25, 0.5, 1 mg/ml Oxy separately for 30 min , A549 cells were co-incubation with TGF-β1 (5 ng/ml) for 48h to detecte the cell proliferation changes by MTT, observed the cell morphological changes through microscopy, and analyzed the expression of phosphorylation of Smad2/3and EMT marker molecules E-candherin, N-cadherin and Vimentin by Western blotting. Results: Oxy could effectively interfere with the cellular proliferation and cell morphological changes, inhibited the expression phosphorylation of Smad2/3, E-candherin down-regulated,and N-cadherin and Vimentin up-regulated mediated by TGF-β1. Conclusion: Oxymatrine could inhibit TGF-β1 induced A549 cells epithelial - mesenchymal transition, Oxymatrine could been used as a new candidate drugs for treatment of pulmonary fibrosis.

Oxymatrine Pulmonary fibrosis/physiopathology Transforming growth factor beta 1 Epithelial cells Cell line,transformed

*遼寧省博士啟動基金資助項目(20141175)

氧化苦參堿 肺纖維化/病理生理學 轉(zhuǎn)化生長因子β1 上皮細胞 細胞系，轉(zhuǎn)化

R364.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.001