祝清芬，馮巧巧，肖 英，魏 霞（.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 500；.山東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，濟(jì)南 5003）

復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究

祝清芬1＊，馮巧巧2，肖 英1，魏 霞1（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101；2.山東省食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心，濟(jì)南 250013）

目的：為建立復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的標(biāo)準(zhǔn)方法提供參考。方法：按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）要求確定復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，并分別采用凝膠法與動(dòng)態(tài)濁度法考察樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況。結(jié)果：樣品調(diào)節(jié)pH近中性后，采用上述兩種方法在4倍稀釋時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾作用。結(jié)論：凝膠法與動(dòng)態(tài)濁度法均可用于復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。由于動(dòng)態(tài)濁度法回收率波動(dòng)大，建議采用凝膠法。

復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；干擾試驗(yàn)；凝膠法；動(dòng)態(tài)濁度法

復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液是一種腸外營(yíng)養(yǎng)藥，適用于不能口服或經(jīng)腸道補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)以及通過這些途徑補(bǔ)給營(yíng)養(yǎng)不能滿足需要的患者[1]。該藥臨床上為靜脈給藥，需對(duì)其細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢查，而以往的該藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究尚存在不完善之處。故本試驗(yàn)參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）[2]采用凝膠法與動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究。

1 材料

1.1 儀器

ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；TAL-40A型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；BET-48G型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液[青島華仁藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：B1406001、B1406002、B1406003，規(guī)格：500 ml：67 g（氨基酸/雙肽）]；凝膠法檢查用鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1403052，靈敏度：0.06 EU/ml；湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：1301310，靈敏度：0.06 EU/ml）；動(dòng)態(tài)濁度法檢查用鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1307110，靈敏度范圍：10～0.01 EU/ml）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150601-201377，規(guī)格：70 EU/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1406160，規(guī)格：5 ml/支）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）確定

該樣品為大容量注射劑，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）[2]規(guī)定及委托方的要求，其L確定為0.50 EU/ml。

2.2 凝膠法[2-3]

2.2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”項(xiàng)下對(duì)于鱟試劑靈敏度復(fù)核的要求，分別對(duì)兩批鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核。結(jié)果，鱟試劑（1403052）的復(fù)核靈敏度λc＝0.03 EU/ml，鱟試劑（1301310）的復(fù)核靈敏度λc＝0.125 EU/ml，兩批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ之間，說明兩批鱟試劑均可用于試驗(yàn)。

2.2.2 干擾預(yù)試驗(yàn) 目前市售鱟試劑靈敏度一般在0.5～0.03 EU/ml之間，根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）＝L/λ（λ指鱟試劑靈敏度），該樣品可采用原液至16倍稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)。采用批號(hào)為B1406001的樣品進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果見表1（注：“-”指凝膠形成陰性，“+”指凝膠形成陽(yáng)性；“樣品+2λ”指樣品中加入2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品）。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果說明樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查具有明顯抑制作用?？紤]到其pH呈酸性，故采用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至近中性后重新進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，樣品調(diào)節(jié)pH近中性后，在2倍稀釋時(shí)對(duì)試驗(yàn)存在干擾作用，而在4倍稀釋時(shí)即對(duì)試驗(yàn)無干擾作用。

表1 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of the interference pre-test for bacterial endotoxin test by gel-clot method

2.2.3 干擾試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用1 mol/L氫氧化鈉溶液將樣品調(diào)節(jié)pH近中性后，采用兩批鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)，考察4倍稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況。用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶，并稀釋制成含細(xì)菌內(nèi)毒素2.0λ、1.0λ、0.5 λ、0.25λ 4種濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，即濃度分別為0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6 EU/ml（C液）；并制備含有上述4種濃度細(xì)菌內(nèi)毒素的樣品4倍稀釋液（B液）。分別采用上述兩批鱟試劑考察樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況，每一濃度平行做4管，同時(shí)取BET水（D液）和樣品4倍稀釋液（A液）各做2支陰性對(duì)照管。分別計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)濃度的幾何平均值Es和Et，判斷樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有無干擾作用，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，Es均在0.5 λ～2.0 λ之間，3批樣品Et均在0.5 Es～2.0 Es之間，即調(diào)節(jié)pH近中性后樣品4倍稀釋液對(duì)凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。

2.3 動(dòng)態(tài)濁度法[2-4]

表2 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of the interference test for bacterial endotoxin test by gel-clot method

2.3.1 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，使最終細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU/ml，各取0.1 ml，分別加入預(yù)先加有0.1 ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)（檢測(cè)波長(zhǎng)為405 nm），每一濃度重復(fù)4管，同時(shí)做陰性對(duì)照2管。以細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)（LgC）為橫坐標(biāo)、平均反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)（lgT）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（詳見表3）。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為L(zhǎng)gT＝2.841 71－0.234 17LgC（r＝－0.992 1，其絕對(duì)值應(yīng)＞0.980），平行管之間的RSD均＜10%，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，故該標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。

表3 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性（n＝4）Tab 3 Standard curve and reliability of bacterial endotoxin（n＝4）

2.3.2 干擾試驗(yàn) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的設(shè)置，選擇0.25 EU/ml作為靠近標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（λm），取批號(hào)為B1406001的樣品，調(diào)節(jié)pH近中性后，分別用BET水將樣品稀釋2、4、8倍，作為供試品溶液（A液）；并分別用上述濃度的供試品溶液制備含細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為λm（0.25 EU/ml）的溶液（B液）。分別取A、B溶液各0.1 ml，加入預(yù)先加有0.1 ml鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)2管。測(cè)定結(jié)束后，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計(jì)算出A液和B液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，樣品稀釋2倍時(shí)，平均回收率在50%以下，說明在此稀釋倍數(shù)下樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定有抑制作用。而樣品稀釋4倍及以上時(shí)，平均回收率均在50%～200%，符合要求。說明干擾試驗(yàn)中可選擇樣品4倍稀釋液。另取B1406002、B1406003兩批樣品，調(diào)節(jié)pH近中性后，分別制備A液和B液（4倍稀釋），依法檢查，平均回收率均在50%～200%，亦符合要求（見表4）。由此表明，樣品在4倍稀釋時(shí)對(duì)動(dòng)態(tài)濁度法細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定無干擾作用。

表4 動(dòng)態(tài)濁度法干擾試驗(yàn)及樣品細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab 4 Result of interference test and bacterial endotoxin test in samples by kinetic turbidimetric limulus test（n＝2）

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法包括凝膠法和光度測(cè)定法（定量法），目前后者在檢驗(yàn)、科研等領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用[5]。動(dòng)態(tài)濁度法是最常用的定量測(cè)定方法之一，通過測(cè)定反應(yīng)溶液達(dá)到規(guī)定濁度所需時(shí)間或測(cè)定溶液自身的濁度變化率定量測(cè)定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。該法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、檢測(cè)范圍寬。動(dòng)態(tài)濁度法的干擾試驗(yàn)，以樣品中加入細(xì)菌內(nèi)毒素的回收率進(jìn)行判斷，若回收率在50%～200%之間，可認(rèn)為樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定無干擾[6]。

凝膠法試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有干擾作用，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。通過進(jìn)一步探討干擾作用的原因發(fā)現(xiàn)，主要與樣品的酸堿性相關(guān)。將樣品調(diào)節(jié)pH近中性后可基本排除干擾，但其2倍稀釋液仍存在干擾，說明這種干擾作用也有其他因素參與。

在動(dòng)態(tài)濁度法試驗(yàn)中，干擾情況與凝膠法基本相同，復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液樣品調(diào)節(jié)pH近中性后，在4倍稀釋時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定無干擾作用。但該試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)很奇怪的現(xiàn)象，在2倍稀釋時(shí)樣品仍存在明顯的抑制作用，但樣品在4倍稀釋時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定有一定的增強(qiáng)作用。而試驗(yàn)過程中也出現(xiàn)過回收率超過200%的情況。同時(shí)，樣品中測(cè)得的內(nèi)毒素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出實(shí)際值，甚至出現(xiàn)樣品不合格的情況。但通過進(jìn)一步驗(yàn)證，采用2015年版《中國(guó)藥典》（四部）規(guī)定的仲裁法凝膠法進(jìn)行檢驗(yàn)，樣品中實(shí)際內(nèi)毒素含量＜0.25 EU/ml。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因仍有待于進(jìn)一步研究。鑒于此，目前在樣品實(shí)際檢驗(yàn)過程中建議采用凝膠法。

本試驗(yàn)建立的復(fù)方氨基酸（15AA）雙肽（2）注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法如下：取本品，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH近中性，然后用BET水稀釋至少4倍后，依照2015年版[《中國(guó)藥典》（四部）通則1143進(jìn)行檢查，本品每1 ml中含內(nèi)毒素的量應(yīng)＜0.50 EU。

[1] 解曉帥，褚燕琦，白向榮，等.復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液臨床用藥調(diào)查研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2014，32（5）：58.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：154-157、400-402.

[3] 中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：310-321.

[4] 魏霞，韓梅，韓瑤，等.血液濾過置換液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究[J].中國(guó)藥房，2013，24（29）：2 752.

[5] 郭萌，李冠民，黃清泉.細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（5）：397.

[6] 張娟，祝清芬，范治云.動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定人參多糖注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].藥學(xué)研究，2014，33（6）：334.

[7] 陳友愛，李鳴.復(fù)方氨基酸（15）雙肽（2）注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法建立及方法學(xué)研究[J].海峽藥學(xué)，2007，19（8）：71.

（編輯：周 箐）

Study on the Test Method for Bacterial Endotoxin in Compound Amino Acids（15AA）and Dipeptide（2）Injection

ZHU Qingfen1，F(xiàn)ENG Qiaoqiao2，XIAO Ying1，WEI Xia（11.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101；2.Center for Drug Evaluation&Certification of Shandong FDA，Jinan 250013，China）

OBJECTIVE：To provide reference for establishing the standard method for the bacterial endotoxin test in Compound amino acids（15AA）and dipeptide（2）injection.METHODS：The limit for bacterial endotoxin in Compound amino acids（15AA）and dipeptide（2）injection was designed according to Chinese Pharmacopoeia 2015 edition（four），and both gel-clot method and kinetic turbidimetric limulus test were conducted for detecting the samples'interference to bacterial endotoxin test.RESULTS：After being adjusted to a near neutral pH，samples showed no interfered to bacterial endotoxin in both methods when the sample was diluted to 4 times.CONCLUSIONS：Both gel-clot method and kinetic turbidimetric limulus test can be used for the bacterial endotoxin test in Compound amino acids（15AA）and dipeptide（2）injection.Gel-clot method is recommended due to the large fluctuations of recovery rate in kinetic turbidimetric limulus test.

Compound amino acids（15AA）and dipeptide（2）injection；Bacterial endotoxin test；Interference test；Gel-clot method；Kinetic turbidimetric limulus test

R927

A

1001-0408（2016）33-4742-03

2015-11-30

2016-09-14）

＊主任藥師，博士。研究方向：藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥物安全性評(píng)價(jià)、藥品檢驗(yàn)。電話：0531-81216599。Email：zhuqingfen73@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.45