范桂強(qiáng)，宋更申，杜艷雪，張李莉（.衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 衡水 05000；.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 0500；.衡水市哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院，河北衡水 05000）

HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方三嗪蘆丁片中5種成分的含量

范桂強(qiáng)1＊，宋更申2，杜艷雪3，張李莉1（1.衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 衡水 053000；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011；3.衡水市哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院，河北衡水 053000）

目的：建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方三嗪蘆丁片中維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪、利血平含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為ZORBAX SB-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.5 ml/min，檢測(cè)波長為291 nm（0～3 min，維生素B6）、273 nm（3～5 min，氫氯噻嗪）、251 nm（5～11 min，蘆丁和鹽酸異丙嗪）、218 nm（11 min，利血平），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為84.0～1 344.0 μg/ml（r＝0.999 8）、171.0～2 736.0 μg/ml（r＝0.999 2）、428.0～6 848.0 μg/ml（r＝0.999 9）、173.5～2 776.0 μg/ml（r＝0.999 5）、5.03～80.48 μg/ml（r＝0.999 1）；定量限分別為18.80、14.92、25.70、12.20、4.99 ng，檢測(cè)限分別為5.54、4.50、8.04、3.66、1.50 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1.0%；加樣回收率分別為98.20%～100.60%（RSD＝0.89%，n＝6）、99.11%～100.28%（RSD＝0.39%，n＝6）、99.07%～100.12%（RSD＝0.38%，n＝6）、98.27%～99.70%（RSD＝0.50%，n＝6）、97.41%～99.40%（RSD＝0.88%，n＝6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方三嗪蘆丁片中維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪、利血平的含量。

高效液相色譜法；復(fù)方三嗪蘆丁片；維生素B6；氫氯噻嗪；蘆丁；鹽酸異丙嗪；利血平；含量測(cè)定

復(fù)方三嗪蘆丁片收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)》[1]第十四冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為WS-10001-（HD-1363）-2003，是由氫氯噻嗪、硫酸雙肼屈嗪、鹽酸異丙嗪、蘆丁、磷酸氯喹、維生素B6、利血平等7種主要成分及輔料制成的復(fù)方制劑，主要用于治療早、中期的高血壓病，因價(jià)格低廉、療效確切，為基層臨床常用抗高血壓藥物。氫氯噻嗪為利尿降壓藥；鹽酸異丙嗪為抗組胺藥，能競(jìng)爭(zhēng)性阻滯組胺H1受體，可對(duì)抗組胺所導(dǎo)致的毛細(xì)血管擴(kuò)張，降低通透性；維生素B6可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞；利血平通過阻滯腎上腺素能神經(jīng)元而起到降壓作用；蘆丁能保持血管彈性，減少血管脆性，降低毛細(xì)血管通透性[2]。由于該制劑成分復(fù)雜，原標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)氫氯噻嗪和鹽酸異丙嗪進(jìn)行含量測(cè)定；現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)也僅對(duì)該制劑中利血平[3-4]、硫酸雙肼屈嗪[5]的含量進(jìn)行測(cè)定。為更好地控制該制劑的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方三嗪蘆丁片中維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁[6-7]、鹽酸異丙嗪和利血平含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1315B二極管陣列檢測(cè)器、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、Chemstation B0302色譜工作站（美國Agilent公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：400 W，頻率：40 kHz）；XS205DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方三嗪蘆丁片（沈陽某制藥有限公司，批號(hào)：20150101、20150216、20150426，規(guī)格：每片含氫氯噻嗪2.0 mg、鹽酸異丙嗪2.0 mg、維生素B61.0 mg、蘆丁5.0 mg、利血平0.03 mg）；氫氯噻嗪對(duì)照品（批號(hào)：100309-201404，純度：99.7%）、鹽酸異丙嗪對(duì)照品（批號(hào)：100422-201002，純度：99.4%）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201408，純度：90.2%）、維生素B6對(duì)照品（批號(hào)：100116-201103，純度：100.0%）、利血平對(duì)照品（批號(hào)：100041-201012，純度：99.4%，60℃減壓干燥3 h后備用）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8-9]

色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.5 ml/min；檢測(cè)波長：291 nm（0～3 min，維生素B6）、273 nm（3～5 min，氫氯噻嗪）、251 nm（5～11 min，蘆丁和鹽酸異丙嗪）、218 nm（11 min，利血平）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取利血平對(duì)照品10.12 mg，置于200 ml棕色量瓶中；再精密稱取維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪對(duì)照品各84.00、171.51、475.50、174.54 mg，分別置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容，搖勻，制得利血平、維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁和鹽酸異丙嗪質(zhì)量濃度分別為50.30、1.68、3.42、8.56、3.47 mg/ml的單一對(duì)照品貯備液。取上述單一對(duì)照品貯備液各2 ml，置于同一10 ml棕色量瓶中，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于氫氯噻嗪14 mg），置于20 ml棕色量瓶中，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容于15 ml，超聲處理4 min，冷卻至室溫，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對(duì)照溶液 按樣品的處方比例，稱取空白輔料適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備空白對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以鹽酸異丙嗪峰計(jì)為6 000，保留時(shí)間為10.18 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、6、8 ml，分別置于20 ml量瓶中，加甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）定容，搖勻，即得系列線性溶液。取上述系列線性溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.空白對(duì)照；1.維生素B6；2.氫氯噻嗪；3.蘆?。?.鹽酸異丙嗪；5.利血平Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.blank control；1.vitamin B6；2.hydrochlorothiazide；3.rutin；4.promethazine hydrochloride；5. reserpine

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 定量限與檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果Tab 3 Determination results of detection limit and quantitation limit

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪、利血平峰面積的RSD分別為0.14%、0.26%、0.42%、0.38%、0.54%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20150101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平峰面積的RSD分別為0.36%、0.52%、0.44%、0.30%、0.69%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20150101）細(xì)粉約0.26 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平的平均含量分別為99.8%、98.2%、98.9%、100.4%、97.8%，RSD分別為0.72%、0.48%、0.80%、0.63%、0.92%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20150101）細(xì)粉適量（約為2片），分別加入一定質(zhì)量的維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

由于復(fù)方三嗪蘆丁片中各成分的溶解性差異較大，氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平為脂溶性藥物，在甲醇中易溶解；維生素B6為水溶性藥物，在水溶液中易溶解，且其在酸性溶液中穩(wěn)定性較好。筆者經(jīng)試驗(yàn)選擇甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）為溶劑時(shí)，上述5種成分均能很好溶解。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）為溶劑。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/片）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/tablet）

3.2 檢測(cè)波長的選擇

取“2.2.1”項(xiàng)下維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平的單一對(duì)照品貯備液各適量，采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果，維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平分別在291、273、251、251、218 nm波長處有最大吸收。為提高檢測(cè)靈敏度，筆者根據(jù)各成分的出峰時(shí)間，運(yùn)用波長切換技術(shù)[9-10]，均采用最大吸收波長進(jìn)行測(cè)定。因此，本試驗(yàn)的檢測(cè)波長分別為291 nm（0～3 min，維生素B6）、273 nm（3～5 min，氫氯噻嗪）、251 nm（5～11 min，蘆丁和鹽酸異丙嗪）、218 nm（11 min，利血平）。

3.3 流動(dòng)相的選擇

筆者考察了乙腈-水[3]、甲醇-水[4]、0.01 mol/L己烷磺酸鈉-乙腈-甲醇-冰乙酸（用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.0）[10]、0.2%己烷磺酸鈉（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.5）-甲醇-乙腈[11]、0.01 mol/L庚烷磺酸鈉-乙腈-三乙胺[12]、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液等作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪和利血平各成分峰的影響。結(jié)果，當(dāng)乙腈-水、甲醇-水、0.01 mol/L己烷磺酸鈉-乙腈-甲醇-冰乙酸（用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.0）、0.2%己烷磺酸鈉（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.5）-甲醇-乙腈、0.01 mol/L庚烷磺酸鈉-乙腈-三乙胺、甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，各成分色譜峰出現(xiàn)了峰形開叉、難以分離、其他成分干擾及個(gè)別成分不能檢出的情況；當(dāng)以乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，各成分峰形和分離良好。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方三嗪蘆丁片中維生素B6、氫氯噻嗪、蘆丁、鹽酸異丙嗪、利血平的含量。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of Five Components in the Compound Trizin and Rutinum Tablet by HPLC

FAN Guiqiang1，SONG Gengshen2，DU Yanxue3，ZHANG Lili1（1.Hengshui Centre for Food and Drug Control，Hebei Hengshui053000，China；2.Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，China；3.Hengshui Halison International Peace Hospital，Hebei Hengshui 053000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of vitamin B6，hydrochlorothiazide，rutin，promethazine hydrochloride and reserpine in Compound trizin and tutinum tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Agilent Zorbax SB-C18with mobile phase of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.5 ml/min，detection wavelength was 291 nm（0-3 min，vitamin B6），273 nm（3-5 min，hydrochlorothiazide），251 nm（5-11 min，rutin，promethazine hydrochloride）and 218 nm（11 min，reserpine），column temperature was 30℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 84.0-1 344.0 μg/ml for vitamin B6（r＝0.999 8），171.0-2 736.0 μg/ml for hydrochlorothiazide（r＝0.999 2），428.0-6 848.0 μg/ml for rutin（r＝0.999 9），173.5-2 776.0 μg/ml for promethazine hydrochloride（r＝0.999 5）and 5.03-80.48 μg/ml for reserpine（r＝0.999 1）；limits of quantification were 18.80，14.92，25.70，12.20，4.99 ng，limits of detection were 5.54，4.50，8.04，3.66 1.50 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；recoveries were 98.20%-100.60%（RSD＝0.89%，n＝6），99.11%-100.28%（RSD＝0.39%，n＝6），99.07%-100.12%（RSD＝0.38%，n＝6），98.27%-99.70%（RSD＝0.50%，n＝6），97.41%-99.40%（RSD＝0.88%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate with high sensitivity and good reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of vitamin B6，hydrochlorothiazide，rutin，promethazine hydrochloride and reserpine in Compound trizin and tutinum tablet.

HPLC；Compound trizin and tutinum tablet；Vitamin B6；Hydrochlorothiazide；Rutin；Promethazine hydrochloride；Reserpine；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）33-4722-04

2016-01-07

2016-09-01）

＊副主任藥師。研究方向：食品、藥品檢驗(yàn)分析。電話：0318-2369176。E-mail：Sagefan@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.33.38