翁葉靖, 隨志剛, 張麗華*, 張玉奎

(1. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧 大連 116023; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

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外泌體分離及其蛋白質組學分析的研究進展

翁葉靖1,2, 隨志剛1, 張麗華1*, 張玉奎1

(1. 中國科學院大連化學物理研究所, 中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧 大連 116023; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

外泌體是一種由細胞分泌的膜性囊泡小體,直徑通常為30～100 nm,密度為1.10～1.18 kg/L。外泌體廣泛存在于各種體液中,可攜帶脂類、蛋白質、信使RNAs(mRNAs)、microRNAs(miRNAs)、非編碼RNAs(ncRNAs)等多種重要的生物功能分子。許多證據表明,外泌體形成了一種特殊的細胞間信息傳遞系統(tǒng),不僅影響細胞的生理狀態(tài),而且與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關。該文簡要綜述了近年來在外泌體的分離和純化方面取得的研究進展,并對蛋白質組學技術在外泌體分析中的應用進行了概述。此外,還對外泌體蛋白質組學研究的發(fā)展前景進行了展望。

外泌體;分離純化;蛋白質組學;定量分析;綜述;綜述

在20世紀60、70年代,研究人員在細胞外的軟骨[1]、血液[2]和細胞培養(yǎng)液[3,4]中發(fā)現(xiàn)了許多膜包被的囊泡小體。起初,人們認為這類囊泡是通過細胞質膜向外出芽或脫落的方式進行釋放，直到80年代,人們才發(fā)現(xiàn)一種更為復雜的囊泡分泌方式(見圖1)。細胞形成多泡小體并通過質膜融合的方式將其中包含的囊泡釋放到細胞外,最終完成囊泡的分泌[5,6]。Johnstone等[7]詳細地研究了這類囊泡分泌形式,并首次將這一類囊泡命名為外泌體(exosomes)。然而,由于研究手段的匱乏,人們一度認為外泌體只是細胞向外運輸物質的“清潔工”,這導致外泌體研究沉寂了將近20年。2007年,Valadi等[8]首次發(fā)現(xiàn)外泌體中包含信使RNAs(mRNAs)和microRNAs(miRNAs)等核酸類物質。這意味著外泌體可以作為遺傳信息的傳遞者參與細胞間基因的轉移和表達。這一發(fā)現(xiàn)賦予了外泌體新的功能,并翻開了外泌體研究的新篇章。此后,有關外泌體的相關研究在各個領域不斷涌現(xiàn)，而對外泌體的分析中，分離和純化的步驟尤為重要。因此,本文對近年來報道的有關外泌體的分離、純化手段及其蛋白質組學研究進行了總結和展望。

圖 1 真核細胞分泌膜性囊泡示意圖Fig. 1 Schematic of the different types of membrane vesicles released by eukaryotic cells ER: endoplasmic reticulum; PM: plasma membrane.

1 外泌體的分離、純化

外泌體是一種由細胞分泌的膜性囊泡,廣泛存在于各種生物體液和細胞培養(yǎng)液中。這些生物樣品中存在復雜的背景干擾,如細胞碎片、細胞囊泡和蛋白質聚集體等。因此,通過發(fā)展分離和純化方法獲得高純度的外泌體對于開展后續(xù)相關的生物分析至關重要。

外泌體具有獨特的物理化學性質:①外泌體(30～100 nm)具有較小的尺寸,不同于核外顆粒體(ectosome, 150～1 000 nm)、脫落小泡(shedding vesicle, 150～1 000 nm)和凋亡小體(apoptosis body, 100～5 000 nm)等其他類型的囊泡;②外泌體具有磷脂雙分子層膜狀結構，該膜狀結構會導致外泌體沉降系數(shù)與蛋白質聚集體有較大差異;③外泌體膜表面存在與其形成密切相關的特異性多跨膜區(qū)的蛋白質,如CD9、CD63和CD81等?？蒲泄ぷ髡呖衫眠@些獨特的物理化學性質,實現(xiàn)外泌體的分離和純化。

1.1 差速離心法

Johnstone等[7]最初發(fā)展了差速離心法用于網織紅細胞組織培養(yǎng)液中外泌體的分離;Théry等[9]對該方法進行了優(yōu)化,并詳述了改進后的方法(見圖2)。以300 g、2 000 g和10 000 g離心,分別去除細胞、死細胞和細胞碎片;利用超高速離心(>100 000 g)得到外泌體的粗提取物;重復操作2次,以去除污染蛋白質,從而得到外泌體。該方法被廣泛應用于各類生物樣品(如血液[10]、細胞培養(yǎng)液[11]、尿液[12]、唾液[13]和腦脊液[14]等)的外泌體分析，是目前應用最為廣泛的外泌體分離方法。Wang等[15]采用差速離心法結合多維蛋白質鑒定技術(MudPIT)對尿液中的外泌體蛋白質進行了分析,一共鑒定得到3 280個蛋白質,其中1 788個未見報道。此外,他們還利用該方法從25 mL尿液的外泌體中鑒定得到超過1 000個蛋白質,是當時報道的最大的人尿蛋白質數(shù)據集。Kislinger等[16]利用差速離心法對4種卵巢癌細胞系(OVCAR3、OVCAR433、OVCAR5和SKOV)的外泌體展開了深度的蛋白質組學分析,鑒定得到3 096個蛋白質。

圖 2 基于差速離心法的外泌體分離純化流程圖Fig. 2 Flow chart of the exosomes purification procedure based on differential velocity centrifugation PBS: phosphate buffer saline.

由于細胞分泌囊泡的不均一性,采用超高速離心得到的沉淀中常包含其他類型的分泌囊泡和蛋白質聚集體,導致外泌體的純度降低。此外,差速離心法在后續(xù)外泌體的蛋白質組學分析中也存在不足:1)重復的超高速離心步驟會造成外泌體的破壞,降低樣品的回收率;2)通常需要大量的初始樣品量(>150 mL的細胞培養(yǎng)液),不適合微量樣品和珍貴樣品的蛋白質組學分析[17]。

1.2 蔗糖梯度離心法

針對差速離心法獲得外泌體純度不高的問題,人們又發(fā)展了蔗糖梯度離心法[18,19]。將兩種濃度的蔗糖溶液(如2.5 mol/L和0.25 mol/L)配制成連續(xù)梯度體系后,置于超速離心管中,再將樣本鋪在蔗糖溶液上,以100 000 g離心數(shù)小時，蛋白質聚集體會沉降于離心管底部,而含脂類結構的外泌體會沉降到等密度區(qū)(1.10～1.18 kg/L),從而獲得較高純度的外泌體。Hogan等[20]采用蔗糖梯度離心法對人尿液中外泌體的蛋白質組進行鑒定。從患腎小球疾病的患者的尿液樣品中鑒定得到5 657個蛋白質。然而,蔗糖梯度離心法的前期準備工作十分繁雜,不適合后續(xù)大規(guī)模的蛋白質組的分析。

1.3 基于聚合物的外泌體富集方法

近些年,Systems Biosciences和Life Technologies等公司發(fā)展了基于體積排阻聚合物分離細胞外囊泡的方法,并申請了相關專利[21,22]。一般認為聚合物沉淀外泌體的機理是體積排阻的聚合物通過“劫持”水分子,從而造成外泌體溶解度的降低,進而在低速離心條件下發(fā)生沉降[17],不過該機理還值得進一步研究。許多公司先后開發(fā)了一系列針對不同樣品來源(血樣、細胞培養(yǎng)液、尿樣等)的外泌體提取試劑盒,實現(xiàn)了外泌體的快速分離和純化[23-25]。這些商品化的試劑盒往往價格昂貴,如用于細胞培養(yǎng)液中外泌體分離的ExoQuickTM、PureExoTM、Total Exosome IsolationTM等產品,每處理10 mL培養(yǎng)液所用試劑盒的價格高達50～100美元,而針對血液樣品的外泌體試劑盒則更加昂貴,因此不適合較大規(guī)模的樣品處理。此外,人們還發(fā)現(xiàn)商品化試劑盒獲得的外泌體中常伴隨較多的干擾蛋白質,如血液外泌體中的白蛋白和免疫球蛋白等,這主要是蛋白質聚沉以及清洗不充分所致。后續(xù)應用方面,由于富集的外泌體中常伴隨聚合物,因此外泌體的電鏡分析難度較大;如果不去除聚合物,同樣會對后續(xù)的質譜分析產生嚴重的離子干擾,因此基于聚合物沉淀機理的商品化試劑盒的方法開發(fā)還值得進一步優(yōu)化和提高。

早在40多年前,人們就發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)可以作為沉淀劑用于病毒的分離,并具有良好的效果[26,27]?？紤]到外泌體與病毒具有相似的尺寸結構和物質組成,Meckes等[28]提出了一種基于PEG的外泌體分離純化方法(ExtraPEG)。采用0.08 kg/L的PEG(數(shù)均分子量為6 000)與培養(yǎng)液進行孵育后,低速離心獲得粗外泌體,再采用超高速離心進一步清洗,以得到外泌體。該方法獲得的外泌體具有較高的回收率和純度,適用于后續(xù)蛋白質組學和測序分析。通過分析人宮頸癌(HeLa)細胞培養(yǎng)液中的外泌體,共鑒定得到517個蛋白質,其中492個蛋白質能與ExoCarta數(shù)據庫中的外泌體蛋白質相匹配。Zhang等[29]通過優(yōu)化PEG的相對分子質量、含量和鹽濃度等參數(shù),確定了最佳的外泌體富集條件。取0.1 kg/L的PEG(重均分子量為10 000)進行2次PEG沉淀，以進一步去除血清蛋白質的干擾。通過高分辨率的電鏡分析,PEG能形成聚合物膜,從而將數(shù)十至上百個外泌體包裹在一起,顯著提高了外泌體聚集體的沉降系數(shù),使外泌體得以在低轉速下獲得分離。將該策略用于HeLa細胞培養(yǎng)液中外泌體的蛋白質組學分析,3次生物學重復共鑒定得到6 299個蛋白質,對應5 120個基因,包含ExoCarta數(shù)據庫中100種外泌體標志蛋白質的97%。通過進一步分析外泌體蛋白質N端肽段可以發(fā)現(xiàn),相比于細胞蛋白質,外泌體蛋白質具有較高程度的蛋白質N端水解,表明外泌體在積累和轉運蛋白質降解中間體方面具有潛在功能。

PEG沉淀法可以實現(xiàn)低成本、高效快速的外泌體分離和純化,利用超濾膜設備可以排除聚合物的干擾,并兼容后續(xù)的蛋白質組學分析。然而,生物樣品中常包含大量的蛋白質,PEG沉淀的產物中不可避免地會存在蛋白質的共沉淀,因此后續(xù)的清洗步驟對于外泌體蛋白質的可靠鑒定十分重要。此外,可利用細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術(SILAC)區(qū)分鑒定結果中的細胞外泌體蛋白質和血清蛋白質,以提高鑒定結果的可信度。

1.4 尺寸排阻法

由于外泌體的尺寸通常為30～100 nm,因此尺寸排阻法也非常適用于外泌體的分離與純化。Cheruvanky等[30]利用超濾法從尿液中成功純化得到外泌體,樣品預處理過程簡單且無需特殊設備。Lim等[31]利用截留不同相對分子質量的濾膜(1 000、500、300和100 kDa)實現(xiàn)了人間充質干細胞培養(yǎng)液中外泌體的分離,為后續(xù)的生物學分析提供了良好基礎。但該方法需要利用特殊的裝置,限制了其應用。Bioo Scientific公司也開發(fā)了基于超濾膜的ExoMirTM商品化設備,可用于外泌體的分離和純化(http://www.biooscientific.com)。該設備有2～3層濾膜,利用離心力分別截留細胞及直徑較大的囊泡物質,以獲得不同尺寸的囊泡。結合RNA提取試劑,可以獲得活性RNA類物質且具有較高的回收率,特別適合于mRNA以及miRNA的分析。Izon Science公司推出了qEVTM凝膠滲透色譜柱,用于外泌體的分離和純化(http://www.izon.com)。外泌體的粒徑較蛋白質和脂類物質大,能夠快速通過分離柱;而蛋白質和脂類物質與填料間的相互作用力較大,通過色譜柱的速度較慢,從而實現(xiàn)外泌體與雜質的高效分離,以得到純度較高的外泌體。該技術操作簡單、使用方便、富集效率高。然而,該色譜柱對于上樣量有嚴格的要求,一般在0.5 mL以內,否則會降低外泌體的分離效率。此外,由于蛋白質和脂類的嚴重污染,該色譜柱無法多次重復使用(<3次),限制了該產品的應用。

1.5 親和富集法

外泌體表面帶有特殊的膜蛋白質,如CD63、CD81、CD82、CD9、ALIX、Annexin、EpCAM和Rab5等,利用抗體與這些蛋白質間的特異性相互作用,可以實現(xiàn)外泌體的親和富集。抗體通常被固載于磁性顆粒[32]、色譜固定相[33]和微流控裝置[34]等基質上,以實現(xiàn)對外泌體的特異性富集。最近,Wako公司開發(fā)了基于膜表面磷脂酰絲氨酸(PS)的親和純化試劑盒MagCaptureTM,利用中性pH的金屬螯合試劑進行競爭性洗脫,可獲得較高純度的外泌體,并適用于后續(xù)的生物學分析。然而,這些基質的非特異性吸附會導致獲得的外泌體中存在干擾蛋白質。此外,親和富集法存在成本高、使用和保存條件苛刻等問題。

2 外泌體的蛋白質組學分析

近些年,基于色譜-質譜聯(lián)用的蛋白質組學技術為生物學的發(fā)展提供了強有力的技術支持。在外泌體蛋白質分析領域,定量蛋白質組學技術的發(fā)展推動著外泌體蛋白質組學研究的不斷進步,以及外泌體中新功能蛋白質的不斷發(fā)現(xiàn)。外泌體存在于各種體液當中,可作為細胞間信息傳遞的載體在細胞交流中發(fā)揮著重要作用,特別是在疾病標志物篩查領域具有重要的作用。據報道,不同體液中外泌體的組成具有高度的特異性[35,36],通過分離和純化體液中的外泌體,可以精準地獲得外泌體中的蛋白質信息。

分析尿液中的外泌體可以獲得豐富的尿液外泌體蛋白質信息,有助于泌尿系統(tǒng)疾病的早期診斷。2014年,Ward等[37]利用無標記定量蛋白質組學技術研究了常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)中PKD1突變(由PC1編碼)患者和健康志愿者的尿液外泌體蛋白質組,定量得到9個具有顯著性表達的蛋白質,其中TMEM2在實驗組低表達,且在發(fā)現(xiàn)隊列中PC1/TMEM2的比值與高度調整后總腎容積(ht-TKV)呈負相關。結果顯示,PC1/TMEM2的定量比值可用于監(jiān)測和診斷多囊性腎病。2015年,Llorente等[38]通過考察多例健康志愿者和前列腺癌患者的尿液外泌體蛋白質組,定量得到246個表達發(fā)生顯著變化的蛋白質,其中221個蛋白質在前列腺癌患者的尿液外泌體中高表達。通過進一步篩選,發(fā)現(xiàn)2個高靈敏的個體生物標志物TM256和LAMTOR1,同時應用TM256和LAMTOR1可提高前列腺癌的檢測靈敏性,表明尿液外泌體在前列腺癌診斷方面具有較大潛力。

近年來,血清外泌體作為疾病標志物的重要來源,也獲得了普遍關注[39-42]。2015年,來自MD安德森癌癥中心的Kalluri等[39]利用定量蛋白質組學技術篩選出GPC1這類在乳腺癌和胰腺癌中高表達的膜錨定蛋白質,并利用免疫印跡技術和流式細胞術等方法對GPC1外泌體的來源和定位進行了驗證。同時,他們發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌患者的血清外泌體中GPC1的豐度顯著高于正常人群,并證明了可以通過鑒定血清外泌體中的GPC1來診斷早期胰腺癌。不同于循環(huán)腫瘤細胞(CTC)研究中需要大量的新鮮血液,該技術甚至可以利用30年前保存的血液樣品進行分析;相比于血液中胰腺癌的生物標志物CA 19-9, GPC1和循環(huán)外泌體的組合被證明是一種更為可靠的篩查工具。

除了在疾病標志物篩查這一主要應用領域,蛋白質組學技術也逐漸被應用于外泌體蛋白質組的翻譯后修飾分析[43,44]、基于選擇反應監(jiān)控(SRM/MRM)的特定外泌體蛋白質分析[45,46]中,以進一步挖掘相關疾病的分子機理。

2014年,Renkonen等[43]首次對尿液外泌體中的N-糖蛋白質組進行了系統(tǒng)分析,共鑒定到來源于51個N-糖基化位點的126條N-糖肽,并獲得了對應的糖鏈組成信息。結果表明,外泌體的糖蛋白質組具有較高豐度的巖藻糖(50%的復合型糖鏈具有巖藻糖),可能與癌癥的發(fā)生和炎性反應密切相關。2016年,Wang和He等[47]對人結腸癌SW620細胞系外泌體中的磷酸化蛋白質進行了詳細的蛋白質組研究,鑒定得到313個磷酸化蛋白質和1 091個磷酸化位點,包括202個新鑒定的磷酸化位點。進一步研究發(fā)現(xiàn),外泌體磷酸化蛋白質顯著分布于染色體11q12.1～13.5區(qū)域,酪氨酸磷酸化蛋白質豐度較高(6.4%),并與肝配蛋白信號通路介導的細胞骨架重構功能相關。

2015年,來自康奈爾大學的Lyden等[48]在Nature上發(fā)表了針對外泌體的研究論文,加深了人們對腫瘤轉移的認識。他們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞會在轉移前先行釋放外泌體,外泌體到達預期轉移器官后會被相應的細胞攝取,從而改變這些靶細胞的狀態(tài),營造適宜轉移和腫瘤生長的微環(huán)境。利用定量蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)外泌體表面的整合素類蛋白質在轉移過程中發(fā)揮著重要的作用,并決定著靶器官的特異性,例如整合素α6β4和α6β1與肺部的轉移有關,整合素αvβ5則與肝臟的轉移相關。上述發(fā)現(xiàn)進一步印證了癌癥的“種子”和“土壤”學說,為抑制腫瘤的器官性轉移提供了新思路。

3 結論和展望

隨著研究的深入,外泌體的新功能不斷被揭示,對人們加深機體生理、病理等過程的認識至關重要。目前已知的外泌體分離純化方法中,尚沒有一種策略能夠實現(xiàn)外泌體的高純度、高回收率富集。本研究組[29]開發(fā)的PEG二次沉淀方法雖然可以實現(xiàn)外泌體的高效富集,卻不可避免地引入了血清蛋白質。后續(xù)實驗將引入細胞蛋白同位素標簽以提高外泌體蛋白質歸屬的準確性。此外,外泌體具有磷脂雙分子層,這區(qū)別于所有干擾蛋白質的特點,開發(fā)與磷脂雙分子層具有特異性親和力的富集材料,可能是提高外泌體純度和富集效率的有效方案。

蛋白質組學技術作為表征外泌體蛋白質組的強大工具,為其定性、定量分析提供了堅實的基礎,也為后續(xù)的生物學探索指明了道路。然而,外泌體的蛋白質組分析尚存在幾點不足:1)難以確定外泌體蛋白質的來源,如無法區(qū)分鑒定得到的蛋白質來源于血清蛋白質還是血清外泌體;2)難以獲得某些組織分泌的外泌體,如腦、肝臟等組織;3)外泌體樣品預處理的分析時間長、通量低,不能滿足臨床體液樣品的高通量檢測;4)由于外泌體的封閉性,難以開展外泌體蛋白質的后續(xù)功能研究。因此,后續(xù)工作中應進一步拓展外泌體的分析范圍、挖掘外泌體蛋白質的翻譯后修飾和潛在功能、提高外泌體蛋白質組的分析靈敏度和分析通量。

近期,本研究組也發(fā)展了相關方法以提高微量樣品中外泌體蛋白質組分析的靈敏度,同時開發(fā)了針對臨床體液樣本(如血液、尿液)中外泌體的高通量蛋白質組學分析方法。另外,由于外泌體中miRNA的作用逐漸被人們所認識,相關的交叉研究也是未來研究的焦點。

總體來說,蛋白質組學和相關學科的進步,會加深人們對外泌體的全面認識,特別是高靈敏度、高通量的蛋白質組分析,將會為全面詮釋外泌體蛋白質的結構和功能發(fā)揮重要作用。

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Recent advances on exosomes isolation methods and proteomic analysis

WENG Yejing1,2, SUI Zhigang1, ZHANG Lihua1*, ZHANG Yukui1

(1.CASKeyLaboratoryofSeparationSciencesforAnalyticalChemistry,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China;2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Exosomes are membrane-bound vesicles secreted by cells with the diameter of 30-100 nm and the density of 1.10-1.18 kg/L. Exosomes exist widely in almost all kinds of biofluids and contain a series of biologically important molecules, such as lipids, proteins, mRNAs, miRNAs and ncRNAs. Emerging evidence shows that exosomes could establish an intercellular information transfer system, thereby affecting the physiological status of cells and involving in various pathological processes. Herein, the recent advances on exosome isolation and purification methods are reviewed. In the meantime, the proteomic analysis of exosomes is briefly introduced. Finally, the future of exosome proteomic research is discussed.

exosomes; isolation and purification; proteomic; quantitative analysis; review

10.3724/SP.J.1123.2016.08036

2016-08-30

國家自然科學基金(21305140);國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2012YQ120044-8).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21305140); National Important Project on Science Instrument (No. 2012YQ120044-8).

O658

A

1000-8713(2016)12-1131-06

鄒漢法研究員紀念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0411)84379720,E-mail:lihuazhang@dicp.ac.cn.