許靜靜, 劉 幸, 周 虎*

(1. 中國科學(xué)院上海藥物研究所分析化學(xué)研究室, 上海 201203;2. 上海市食品藥品檢驗(yàn)所化學(xué)藥品室, 上海 201203)

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翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法的研究進(jìn)展

許靜靜1,2, 劉 幸1, 周 虎1*

(1. 中國科學(xué)院上海藥物研究所分析化學(xué)研究室, 上海 201203;2. 上海市食品藥品檢驗(yàn)所化學(xué)藥品室, 上海 201203)

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生理活動的重要途徑。該文總結(jié)了近年來PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的分離方法,包括反相(RP)色譜法、離子交換(IEX)色譜法、親水相互作用色譜(HILIC)法、多孔石墨化碳(PGC)色譜法、毛細(xì)管電泳(CE)法及分子篩色譜(SEC)法等。這些新方法為磷酸化、乙酰化、糖基化等PTM肽段或蛋白質(zhì)的鑒定提供了更高的分離度和靈敏度。此外,該文也介紹了蛋白質(zhì)領(lǐng)域其他重要分離方法的研究進(jìn)展,這些方法可能被進(jìn)一步應(yīng)用于PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中。

翻譯后修飾;蛋白質(zhì)組學(xué);反相色譜;離子交換色譜;親水相互作用色譜;多孔石墨化碳色譜;毛細(xì)管電泳

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)是細(xì)胞實(shí)現(xiàn)快速、可逆調(diào)控蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵途徑。哺乳動物中超過50%的蛋白質(zhì)需經(jīng)PTMs才能實(shí)現(xiàn)其特定的生理功能[1]。目前,Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫已收錄超過450種PTMs蛋白質(zhì)的類型[2],其中最主要的PTMs包括磷酸化、賴氨酸乙?；⒎核鼗?、糖基化、蛋白酶水解、甲基化等。PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)的研究流程與經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)相似,但由于PTMs的蛋白質(zhì)相對豐度較低,在細(xì)胞內(nèi)處于動態(tài)變化中,并且修飾基團(tuán)與氨基酸殘基間的共價(jià)鍵較易斷裂,所以PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需要更加有效的分析技術(shù)。PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)研究一般包括樣品前處理、肽段分級、含修飾基團(tuán)肽段的富集、質(zhì)譜分析、生物信息學(xué)分析等步驟。在過去幾年里,許多新的離線/在線肽段/蛋白質(zhì)分離方法被提出,為PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)提供了有力的技術(shù)支持。本文主要對近幾年P(guān)TMs蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法的新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法

1.1 高pH反相色譜在磷酸化肽段分離中的應(yīng)用

Gilar等[3]首次將高pH反相-高效液相色譜(RP-HPLC)用于肽段分級,建立了用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的二維RP-RP-HPLC-MS/MS法,并獲得了很好的正交性。第一維C18反相色譜流動相的pH為10、第二維的pH為2.6。高pH RP-HPLC法與傳統(tǒng)的強(qiáng)陽離子交換(SCX)-HPLC法相比,具有分辨率高、質(zhì)譜兼容性好的優(yōu)點(diǎn)。Song等[4]在此研究的基礎(chǔ)上,改變了第一維分級組分的混合方法,把分離時(shí)間均分成前后兩段,將時(shí)間間隔相同的兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)的組分混合,提高了二維RP-RP-HPLC-MS/MS法的正交性,鑒定得到磷酸化肽段的數(shù)目提高了30%。經(jīng)RP-HPLC-線性離子阱質(zhì)譜分析,在人肝磷酸化蛋白質(zhì)組中檢測到約8 000個(gè)磷酸化位點(diǎn)。Wang等[5]將二維RP-RP-LC-MS/MS法與傳統(tǒng)SCX-RP-LC-MS/MS法比較,發(fā)現(xiàn)RP-RP-LC-MS/MS法鑒定到的肽段和蛋白質(zhì)數(shù)目分別是SCX-RP-LC-MS/MS法的1.8倍和1.6倍。

1.2 含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)肽段的分離方法

靜電斥力-親水作用色譜(ERLIC)法采用弱陰離子交換固定相,通過降低流動相中有機(jī)溶劑比例和pH值進(jìn)行洗脫,肽段根據(jù)其等電點(diǎn)(pI)和極性高低順序依次被洗脫。洗脫初始階段,流動相中有機(jī)溶劑的比例較高,肽段的保留主要依賴親水相互作用,隨著有機(jī)溶劑比例的降低,靜電相互作用逐漸成為主導(dǎo)[6]。在磷酸化修飾分析中,將ERLIC、親水相互作用色譜(HILIC)及SCX色譜分別與二氧化鈦(TiO2)富集法結(jié)合,并比較這3種方法的鑒定結(jié)果。SCX-TiO2法鑒定到的磷酸化肽段最多,而對于含有3個(gè)以上磷酸化位點(diǎn)肽段的鑒定,ERLIC-TiO2法最佳[7]。

含有3個(gè)以上磷酸化位點(diǎn)的肽段具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn),所帶負(fù)電荷多、正電荷少,采用ERLIC法富集時(shí),其保留較強(qiáng)；而采用SCX色譜法富集時(shí)，其難以保留,所以鑒定得到的多為僅含有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段，兩種方法具有互補(bǔ)性。Zarei等[8]將SCX色譜法和ERLIC法相結(jié)合對磷酸化肽段進(jìn)行檢測,在相同時(shí)間內(nèi)鑒定到更多的磷酸化位點(diǎn)和肽段。與單獨(dú)使用SCX色譜法相比,SCX-ERLIC-MS/MS法和ERLIC-SCX-MS/MS法鑒定得到含有3個(gè)以上磷酸化位點(diǎn)的肽段的數(shù)目增加了50%和40%,鑒定得到的含有1～2個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段數(shù)目也更多。

將超高效液相色譜(UPLC)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的分析可以提高色譜分辨率、檢測靈敏度及分析速度。然而Fleitz等[9]發(fā)現(xiàn)采用UPLC法分析磷酸化肽段(尤其是含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段)時(shí)比采用HPLC法更容易“丟失”。磷酸化肽段-金屬離子復(fù)合物的形成是造成磷酸化肽段分析困難的重要原因之一。Fleitz等[9]建立了經(jīng)EDTA處理的二維反相和納流超高效液相色譜(RP-RP-nanoUPLC)系統(tǒng),提高了多磷酸化位點(diǎn)肽段的鑒定率。他們發(fā)現(xiàn)采用RP-nanoUPLC-MS/MS法檢測含有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)肽段時(shí),即使用EDTA-Na2溶液對色譜柱或樣品進(jìn)行預(yù)處理,仍無法檢測出該標(biāo)準(zhǔn)肽段。以α-酪蛋白(α-casein)和β-酪蛋白(β-casein)酶解產(chǎn)物為例,比較EDTA-RP-nanoUPLC-MS/MS、RP-RP-nanoUPLC-MS/MS和EDTA-RP-RP-nanoUPLC-MS/MS 3種方法對磷酸化肽段的鑒定能力,前兩種方法未鑒定到任何含有3～4個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段,而EDTA-RP-RP-nanoUPLC-MS/MS法在α-casein中測得13種含單一磷酸化位點(diǎn)、6種含兩個(gè)磷酸位點(diǎn)和3種含3個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段,在β-casein中測得19種含單磷酸化位點(diǎn)、8種含兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)、4種含3個(gè)磷酸化位點(diǎn)及3種含4個(gè)磷酸化位點(diǎn)的肽段。采用該方法對500 μg包皮纖維原細(xì)胞總蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,測得1 087種磷酸化蛋白質(zhì)、1 944種磷酸化肽段、2 164種可信磷酸化位點(diǎn),79%的磷酸化肽段中含單一磷酸化位點(diǎn)、20%含兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)、約1%含3～4個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中78個(gè)位點(diǎn)為人蛋白質(zhì)中首次發(fā)現(xiàn)的全新磷酸化位點(diǎn)。該方法在磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定中十分有效,尤其提高了含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的鑒定率。該方法已成為該實(shí)驗(yàn)室磷酸化分析的標(biāo)準(zhǔn)方法,并且成功應(yīng)用于人單核細(xì)胞膜定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析和酪氨酸受體酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組的項(xiàng)目研究中。

Batth等[10]對離線RP-RP-LC-MS/MS方法進(jìn)行優(yōu)化,樣品經(jīng)第一維高pH反相色譜分級后,采用兩次TiO2富集,然后進(jìn)行納流液相色譜-串聯(lián)四級桿靜電場軌道阱質(zhì)譜(nanoLC-Q-Orbitrap/MS, Q-Exactive)檢測。以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH-3T3)磷酸化蛋白質(zhì)組為例,得到了30 000多種磷酸化肽段,超過傳統(tǒng)SCX-RP-LC-MS/MS法檢測結(jié)果的2倍。其中,兩次TiO2富集提高了多磷酸化位點(diǎn)肽段的鑒定率。

1.3 含多個(gè)堿性氨基酸磷酸化肽段的分離方法

SCX色譜法是經(jīng)典的肽段分級方法,胰酶酶解肽段在低pH條件下上樣,采用鹽梯度或pH梯度進(jìn)行洗脫。在進(jìn)行磷酸化肽段分級時(shí),含有堿性氨基酸殘基的磷酸化肽段難以有效分離。Gauci等[11]對SCX色譜法進(jìn)行優(yōu)化后,能夠?qū)我涣姿峄揎椇投嗔姿峄揎椀碾亩畏蛛x。為將含有多個(gè)堿性氨基酸殘基的磷酸化肽段與非磷酸化肽段分離,Hennrich等[12]建立了不同pH條件(pH 3和pH 1)洗脫的SCX-SCX-LC-MS/MS法。為證明該方法的可行性,他們首先在pH 1條件下,驗(yàn)證了各種肽段能夠穩(wěn)定存在;同時(shí)對該系統(tǒng)在pH 1條件下的分離能力進(jìn)行了考察,該方法使用了能耐受強(qiáng)酸性條件的商品化LC儀和SCX色譜柱,其分離能力幾乎不受pH值的影響,其半峰高處的全峰寬(FWHM)約為0.6 min。在該方法中,第一維分離的pH值為3,此時(shí),磷酸基團(tuán)解離為負(fù)離子形式,由于肽段的保留主要與肽段所帶的凈正電荷相關(guān),所以洗脫順序依次為含有多個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)的肽段、N-乙?；亩?、單磷酸化修飾的肽段和含有多個(gè)堿性氨基酸的肽段。取第一維色譜分離得到的含有多個(gè)堿性氨基酸的肽段混合物,進(jìn)行第二維分離。第二維色譜采用pH 1的洗脫液,此時(shí),由于磷酸基團(tuán)不解離,呈電中性,所以含有磷酸化修飾的肽段所帶凈正電荷提高;而不含磷酸化修飾的肽段先被洗脫,磷酸化肽段后被洗脫。他們將該SCX-SCX-LC法和RP-nanoLC-MS/MS法聯(lián)合用于分析人宮頸癌細(xì)胞(Hela)提取蛋白,得到31 000種非磷酸化肽段和10 000多種含2個(gè)及以上堿性氨基酸的磷酸化肽段。等量肽段在pH 3條件下經(jīng)一維SCX色譜法分離后,直接采用RP-nanoLC-MS/MS法檢測,僅得到18 500種肽段和不足550種的磷酸化肽段。可以看出,其檢測結(jié)果提高了約20倍。將此方法與其他傳統(tǒng)的SCX色譜法結(jié)合[11,13,14]可以較全面地對磷酸化肽段進(jìn)行檢測。

1.4 相對分子質(zhì)量較低的磷酸化肽段的分離方法

毛細(xì)管電泳(CE)法分辨率較高,但由于載樣量小、鞘液稀釋等問題導(dǎo)致靈敏度較低,與ESI-MS/MS聯(lián)用時(shí)易受到限制。近年來許多提高CE載樣量和靈敏度的新技術(shù)被提出,其中采用多孔無鞘接口與ESI-MS/MS聯(lián)用的方法已成功應(yīng)用于肽段和蛋白質(zhì)的鑒定[15]。Faserl等[16]將多孔無鞘接口與Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀連接,采用外殼帶正電的毛細(xì)管柱和低pH背景溶液(BGE),考察了該方法的系統(tǒng)適應(yīng)性。研究表明該系統(tǒng)性能主要取決于毛細(xì)管噴頭與質(zhì)譜入口間的距離、噴霧電壓、樣品溶液的濃度及電滲流(EOF)強(qiáng)度。通過優(yōu)化這些參數(shù),可以提高方法的信噪比和靈敏度。以H1組蛋白為樣品,他們對CE-ESI-MS/MS法與LC-ESI-MS/MS法的檢測能力進(jìn)行了比較。在相同上樣量的情況下,采用CE-ESI-MS/MS法時(shí),色譜分辨率更高、質(zhì)譜信號更強(qiáng),鑒定得到的肽段更多(多60%),尤其對于相對分子質(zhì)量較低的肽段(小于1 400 Da),其序列覆蓋率也獲得提高。此外,CE-ESI-MS/MS法的分析時(shí)間僅為LC-ESI-MS/MS法的1/4。

Sarg等[17]首次采用多孔無鞘CE-ESI-MS/MS技術(shù)對組蛋白PTMs進(jìn)行研究。與nanoLC-ESI-MS/MS法相比,CE-ESI-MS/MS法具有更高的靈敏度,可以鑒定得到更多的磷酸化肽段和磷酸化位點(diǎn)。CE法不存在死體積和共流出離子抑制作用的限制,可以通過降低流速提高其靈敏度。此外,兩種方法均鑒定得到一些獨(dú)有的磷酸化肽段,二者鑒定結(jié)果具有較好的互補(bǔ)性。CE-ESI-MS/MS技術(shù)在鑒定相對分子質(zhì)量較低的磷酸化肽段時(shí)具有優(yōu)勢,而相對分子質(zhì)量較高的磷酸化肽段,更易被LC-ESI-MS/MS法鑒定。然而,他們發(fā)現(xiàn)組蛋白中的甲基化、泛素化等PTMs并沒有被CE-ESI-MS/MS鑒定到,這一問題尚待解決。通過進(jìn)一步優(yōu)化,CE-ESI-MS/MS法可以成為LC-ESI-MS/MS法的互補(bǔ)方法,用于多種PTMs的研究。

Faserl等[18]將細(xì)胞培養(yǎng)條件下的氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)與超低流速(<10 nL/min)CE-MS/MS法結(jié)合,建立了新的超高靈敏度定量蛋白質(zhì)組學(xué)的分析方法。該方法在CE-MS/MS檢測前采用RP-LC法對肽段進(jìn)行分級,使用電中性毛細(xì)管外殼,并通過降低流速提高CE的分離效率。將該方法用于酵母細(xì)胞定量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中,獲得了28 538個(gè)定量肽段和3 272個(gè)定量蛋白質(zhì)。通過對CE-MS/MS鑒定得到的1 371個(gè)磷酸化肽段進(jìn)行定量分析,得到49個(gè)在2個(gè)細(xì)胞株中被差異調(diào)控的磷酸化肽段。除了磷酸化修飾,還鑒定到乙酰化修飾、氧化修飾、去酰胺修飾等共8 106個(gè)PTMs肽段。這種高靈敏度的定量方法可在PTMs研究中發(fā)揮重要作用。

2 乙?；鞍踪|(zhì)組學(xué)分離方法

85%的蛋白質(zhì)在翻譯或翻譯后發(fā)生N端乙?；揎?這是最普遍的蛋白質(zhì)修飾之一[19]。N端乙?；揎椀姆蛛x富集方法,一般可分為反向選擇和正向選擇兩類。反向選擇是基于N端自由氨基與其他試劑反應(yīng)而被去除,相對惰性的α-N-乙?；亩慰梢詮姆磻?yīng)液中被分離富集[20,21]。正向選擇是利用α-N-乙?；亩蔚腘端氨基不發(fā)生質(zhì)子化,與N端為自由氨基的肽段相比,所帶凈正電荷少1,從而可以在SCX色譜的流過液中直接得到分離和富集[22]。Chen等[23]采用SCX固相萃取的方法分離富集α-N-乙?；亩?通過二甲基化標(biāo)記自由氨基,擴(kuò)大了α-N-乙酰化肽段與自由氨基肽段在SCX色譜上的保留時(shí)間差異。該方法與其他方法相比,操作簡便、快速,與同位素標(biāo)記定量、二維LC-MS/MS法結(jié)合可以用于N端乙酰化蛋白質(zhì)的定量分析。

含有賴氨酸乙酰化修飾的肽段的富集主要采用特異性抗體進(jìn)行親和純化[24,25]。富集得到的賴氨酸乙酰化修飾肽段經(jīng)過nanoLC-MS/MS檢測,或經(jīng)高pH反相色譜等分級后,再進(jìn)行nanoLC-MS/MS檢測。

3 糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法

Zhao等[26]將PGC色譜與傳統(tǒng)低pH反相色譜結(jié)合,用于蛋白質(zhì)組學(xué)和N-糖蛋白的定性和定量分析。他們在小腦顆粒神經(jīng)元中鑒定得到11 984種肽段序列和2 678種非冗余蛋白質(zhì),這是目前得到的最大規(guī)模小腦顆粒神經(jīng)元的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。他們通過優(yōu)化PGC色譜的pH,改善了對疏水性肽段的鑒定條件。在PGC色譜柱和反相色譜柱之間增加一個(gè)即插即用的PGC模塊,可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對親水性和疏水性肽段的有效檢測。將PGC-RP-LC-MS/MS法用于食蟹猴血漿糖蛋白的分析,得到了130種N-糖基化血漿蛋白、705種N-糖肽和254個(gè)糖基化位點(diǎn)。與RP-RP-LC-MS/MS法相比,采用PGC-RP-LC-MS/MS法可以鑒定到更多的親水性肽段。他們建立的PGC-RP-LC-MS/MS法可成為蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的有效技術(shù)。

HILIC固定相表面存在親水層,采用含高比例有機(jī)相的流動相上樣,水梯度洗脫,用于極性或親水性化合物的分離,是重要的糖蛋白及糖肽富集方法[27-29]。Dedvisitsakul等[30]采用鍵合兩性離子基團(tuán)的親水相互作用色譜(ZIC-HILIC)法測定糖肽,用棉絮與固相萃取結(jié)合,提高了載樣量;超速離心式反應(yīng)器與ERLIC法結(jié)合,提高了鑒定率[31,32]。

4 其他方法

4.1 “自頂向下”蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法

“自頂向下(Top-down)”蛋白質(zhì)組學(xué)可以從蛋白質(zhì)的整體角度為PTMs研究提供信息[33-35]。在Top-down蛋白質(zhì)組學(xué)中,首先要將相對分子質(zhì)量較高和較低的蛋白質(zhì)分離。分子篩色譜法根據(jù)蛋白質(zhì)的大小或動態(tài)水體積對其進(jìn)行分離。傳統(tǒng)分子篩色譜法存在分離度較低、分離后樣品被大量稀釋等問題,限制了其在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用。Chen等[36]采用UPLC系統(tǒng),填料粒徑為1.7 μm、孔徑分別為12.5 nm和20.0 nm的分子篩色譜柱,使用與質(zhì)譜兼容的揮發(fā)性溶劑,建立了分離度高、分析速度快的分子篩色譜法,該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對6～669 kg/mol范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的快速分離。該方法在翻譯后蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用有待進(jìn)一步開發(fā)。

Han等[37]將在線無鞘CE-ESI-MS/MS(Orbitrap Elite)法用于Top-down蛋白質(zhì)組學(xué)中,并對強(qiáng)烈炙熱球菌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,得到134種蛋白質(zhì)和291種蛋白質(zhì)變體,其中包括乙?；揎?、二硫鍵修飾、氧化修飾和糖基化修飾等多種PTMs蛋白質(zhì)。為CE法在Top-down PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

Vorontsov等[38]將“自下而上(Bottom-up)”蛋白質(zhì)組學(xué)與Top-down蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合,用于冰島硫化葉菌蛋白質(zhì)組的分析,鑒定得到豐富的賴氨酸甲基化和N段乙?；揎楇亩?。為兩種方法結(jié)合并用于PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

4.2 低豐度蛋白質(zhì)分離方法

為進(jìn)一步提高RP-RP-LC-MS/MS法的靈敏度,Zhou等[39]采用高pH的RP-LC(pH 10)、高pH的強(qiáng)陰離子交換色譜(SAX)(pH 10)、低pH的RP-LC(pH 3)的自動化在線三維LC-MS/MS法對復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行分離。以大腸桿菌總蛋白胰酶的酶解產(chǎn)物為例,與RP-RP-LC-MS/MS法比較,RP-SAX-RP-LC-MS/MS法鑒定得到的肽段和蛋白質(zhì)的數(shù)目提高了44%和31%。將RP-SAX-RP色譜與離子阱質(zhì)譜(LCQ)串聯(lián),對40 μg釀酒酵母總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,可檢測到表達(dá)水平為每個(gè)細(xì)胞50拷貝的蛋白質(zhì),其檢測下限約為0.5×10-17mol。將RP-SAX-RP與LTQ-Orbitrap MS串聯(lián),對5 μg酵母總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,測得4 000多種蛋白質(zhì),檢測下限可以達(dá)到0.65×10-17mol。該方法對低豐度蛋白質(zhì)檢測提供了有力的技術(shù)支持。Law等[40]將RP-RP色譜法和SCX-RP色譜法相結(jié)合,建立了三維RP-SCX-RP-LC-MS/MS法,該方法在鑒定親水性極強(qiáng)的肽段時(shí)具有一定優(yōu)勢。將該方法用于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12總蛋白質(zhì)的分析,鑒定得到97 309種肽段和6 345種蛋白質(zhì)。與RP-RP-LC-MS/MS法相比,可獲得較高的蛋白質(zhì)鑒定率和序列覆蓋率,但分析時(shí)間較長。由于該方法避開了同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)標(biāo)記試劑的干擾,提高了iTRAQ定量方法的準(zhǔn)確性。

Quan等[41]同時(shí)將SAX和SCX色譜結(jié)合到RP-RP-LC-MS/MS法中,建立了在線全自動多維RP-SA(C)X-RP-LC-MS/MS的分離方法。肽段經(jīng)第一維高pH反相色譜分離后,依次經(jīng)過SAX和SCX色譜分離,最后經(jīng)低pH反相色譜分離后,進(jìn)入質(zhì)譜檢測。將該方法用于復(fù)雜樣品蛋白質(zhì)組學(xué)分析,可獲得更高的蛋白質(zhì)鑒定率和序列覆蓋率,同時(shí)提高了酸性、親水性以及疏水性肽段的鑒定率。以食蟹猴腦皮質(zhì)組織為例,RP-SA(C)X-RP-LC-MS/MS法檢測到127種內(nèi)源性酪氨酸硝基化肽段和137種存在于整合蛋白質(zhì)中含跨膜結(jié)構(gòu)域的肽段。此外,該方法可以提高定量方法的可信度。

膜蛋白質(zhì)疏水性強(qiáng)、豐度低,采用LC-MS/MS法對膜蛋白質(zhì)進(jìn)行分析時(shí),一般需要大量的原始樣品。因此對只有少量臨床樣本的膜蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析時(shí)需要更加靈敏的分析技術(shù)。Dimayacyac-Esleta等[42]在StageTip中采用高pH反相色譜法對肽段進(jìn)行第一維分離,考察該方法對膜蛋白質(zhì)組的鑒定能力及靈敏度。10 μg膜蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物經(jīng)高pH反相StageTip法分級后,經(jīng)RP-nanoLC -靜電軌道阱質(zhì)譜檢測,可以得到約5 000種蛋白質(zhì),其中膜蛋白約3 000種,分級僅需要15 min,說明采用該方法對膜蛋白進(jìn)行鑒定具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。與SAX StageTip及SCX StageTip法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)高pH反相StageTip法鑒定得到的含有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的肽段數(shù)目是前兩種方法的2倍。他們采用該方法對10 μg Hela細(xì)胞膜蛋白酶解肽段進(jìn)行檢測,得到約630種質(zhì)膜整合蛋白質(zhì),這幾乎是目前鑒定得到的所有質(zhì)膜整合蛋白質(zhì)數(shù)目的1/2。人類蛋白質(zhì)組藍(lán)圖中仍然缺失的蛋白質(zhì)中約30%為膜蛋白質(zhì),Kitata等[43]采用高pH反相StageTip法尋找與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的缺失膜蛋白質(zhì)。在測得7 702種蛋白質(zhì)中(約66%為膜蛋白質(zhì))發(fā)現(xiàn)178種缺失蛋白質(zhì)(74種為膜蛋白質(zhì))。進(jìn)一步采用多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜模式對合成肽段進(jìn)行檢測,驗(yàn)證了8種缺失蛋白質(zhì),其中7種包含跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。在高pH反相StageTip法的基礎(chǔ)上,用于膜蛋白質(zhì)PTMs檢測的新方法有待進(jìn)一步開發(fā)。

4.3 偏堿性和偏酸性肽段分離方法

傳統(tǒng)SCX色譜法采用鹽梯度洗脫,流動相與質(zhì)譜兼容性較差,一般不與質(zhì)譜直接在線聯(lián)用,筆者所在實(shí)驗(yàn)室采用揮發(fā)性酸(丙二酸、甲酸)和揮發(fā)性堿(氨水)調(diào)節(jié)流動相pH,以50%(v/v)乙腈水溶液為流動相,建立了在線直接聯(lián)用、連續(xù)pH梯度洗脫的SCX-LC-MS/MS法,并應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和復(fù)雜蛋白質(zhì)的樣品分析[44]。與RP-LC-MS/MS法具有較好的互補(bǔ)性,通過結(jié)合,可以提高蛋白質(zhì)鑒定的序列覆蓋率;該方法傾向于鑒定更高比例的堿性肽段,在鑒定含組氨酸肽段時(shí)具有明顯優(yōu)勢。在該方法的基礎(chǔ)上,用于組氨酸磷酸化修飾肽段檢測的新方法有待進(jìn)一步開發(fā)。

Horie等[45]采用長2 m、經(jīng)尿素官能團(tuán)修飾的硅膠親水相互作用毛細(xì)管整體柱與質(zhì)譜直接在線聯(lián)用,對Hela細(xì)胞總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行HILIC-LC-MS/MS分析,與采用硅膠-C18毛細(xì)管整體柱比較,可鑒定得到數(shù)目相當(dāng)?shù)碾亩魏偷鞍踪|(zhì)。此外,HILIC-LC-MS/MS法獲得肽段的色譜峰強(qiáng)度約是RP-LC-MS/MS法的5倍,這可能是因?yàn)槠淞鲃酉嘀幸译娴谋壤^高,離子化效率較高。HILIC-LC-MS/MS法檢測到的偏堿性肽段也更多。該方法可以作為傳統(tǒng)反相色譜的補(bǔ)充工具,用于提高蛋白質(zhì)鑒定的序列覆蓋率和研究偏堿性肽段的PTMs。

一般磷酸化肽段富集方法需要大量的蛋白質(zhì)樣品,這限制了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在樣品量稀少時(shí)的臨床研究。Loroch等[46]采用ERLIC法對磷酸化肽段進(jìn)行分級,只需少量蛋白質(zhì)樣品即可獲得足量磷酸化肽段。根據(jù)分級時(shí)的洗脫順序,選擇不同的固相萃取方法(SCX或RP)進(jìn)一步純化后,經(jīng)LC-MS/MS檢測。采用該方法對0.1 mg Hela細(xì)胞總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,分析時(shí)間為45 h,重復(fù)2次,可得到8 998個(gè)不同的非冗余磷酸化位點(diǎn),每次實(shí)驗(yàn)均可得到7 500多種非冗余磷酸化位點(diǎn),共檢測到3 013種磷酸化蛋白質(zhì)。該方法檢測蛋白質(zhì)的動態(tài)范圍為幾拷貝至幾千萬拷貝。與基于親和相互作用的Ti4+方法相比,該方法在富集較長和偏酸性的磷酸化肽段時(shí)更具優(yōu)勢,利用該方法鑒定得到了327種C端磷酸化肽段。

Hao等[47]建立了多維RP-ERLIC-LC-MS/MS鑒定去氨基化肽段的分析方法。de Jong等[48]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,建立了直接在線聯(lián)用的nanoERLIC-LC-MS/MS法。該方法采用75%(v/v)乙腈溶液作為起始流動相,增大了上樣時(shí)肽段的溶解度,從而提高了肽段的鑒定率;與傳統(tǒng)RP-MS法進(jìn)行比較,該方法鑒定得到的肽段數(shù)目增加了57%,親水性肽段或酸性肽段在ERLIC色譜中保留更好,該方法在鑒定較長肽段時(shí)具有優(yōu)勢。ERLIC-LC-MS/MS法可作為傳統(tǒng)RP-LC-MS/MS法的替代方法,用于糖基化修飾和磷酸化修飾的研究。

4.4 離子交換色譜法的創(chuàng)新

在蛋白質(zhì)組學(xué)肽段分級中,SCX色譜法是被廣泛使用的傳統(tǒng)方法,而SAX色譜法則較少被應(yīng)用。Ritorto等[49]通過測試疏水性不同的SAX色譜柱,發(fā)現(xiàn)了一款肽段分離性能較好的SAX色譜柱,該色譜柱以超大孔樹脂為基質(zhì)、親水性的烷醇季銨離子為固定相。他們將其稱為hSAX (hydrophilic SAX)。

表 1 翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分離新方法

RP: reversed-phase; SCX: strong cation exchang; ERLIC: electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography; PGC: porous graphitic carbon; ZIC-HILIC: zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography.

采用hSAX色譜法對RAW264.7巨噬細(xì)胞的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分級,然后經(jīng)低pH RP-LC-MS/MS檢測,最終得到9 469種蛋白質(zhì)和126 318種肽段。與高pH反相色譜串聯(lián)低pH RP-LC-MS/MS法相比,hSAX-RP-LC-MS/MS法鑒定得到的蛋白質(zhì)數(shù)目和肽段數(shù)目分別增加了10%和28%。這種hSAX色譜為多維LC法提供了新的選擇,通過進(jìn)一步研究,該方法或可應(yīng)用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的分析中。

在20世紀(jì)80年代,Rassi和Horvath等[50]提出將強(qiáng)陽離子和弱陰離子交換(anion and cation exchange, ACE)填料混合,建立了分離酸性及堿性蛋白質(zhì)的方法。但當(dāng)時(shí)“道南平衡理論”[51]并未出現(xiàn),無法合理解釋其保留機(jī)制,以致其發(fā)展緩滯。Motoyama等[51]將ACE色譜用于多維LC中的第一維肽段分級,與SCX色譜法相比,使用的鹽溶液濃度更低,而肽段回收率為其2倍。Mommen等[52]通過研究發(fā)現(xiàn),ACE色譜法中肽段的保留主要與弱陰離子交換(WAX)填料和SCX填料的比例及流動相的離子強(qiáng)度有關(guān)。他們將不同比例的兩種填料混合,并分析了鑒定得到肽段的pI值等性質(zhì),為根據(jù)肽段性質(zhì)選擇填料的混合比例提供了參考。他們采用甲酸和二甲基亞砜溶液作為流動相,連續(xù)pH梯度洗脫,得到了與醋酸銨鹽梯度洗脫方法相當(dāng)?shù)蔫b定水平。此外,由于流動相不含鹽,該方法可以與25 μm內(nèi)徑的反相毛細(xì)管色譜柱聯(lián)用,鑒定水平可提高2～3倍。pH梯度洗脫的ACE-RP-LC-MS/MS法靈敏度高,或可成為樣品量極少時(shí)的有效分析方法。結(jié)合ACE色譜法,用于磷酸化等PTMs肽段分離的新方法有待開發(fā)。表1總結(jié)了PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)分離的一些新方法及其具有的優(yōu)勢。

5 結(jié)論與展望

近年來,許多新的針對PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)的具有高分離能力和高靈敏度的分析方法得到了快速發(fā)展,實(shí)現(xiàn)了真核細(xì)胞中幾千至幾萬種PTMs位點(diǎn)的鑒定和新修飾位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。本文對近幾年用于PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)的新分離方法進(jìn)行了綜述,并對各種方法創(chuàng)新的應(yīng)用和優(yōu)勢進(jìn)行了分析。此外,本文對蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域其他重要的分離方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹,希望通過改進(jìn)和創(chuàng)新,這些方法能夠成為翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)支撐。

新的PTMs肽段的特異性富集方法、PTMs蛋白質(zhì)的絕對定量方法、靶向PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)分析方法的發(fā)展將大大促進(jìn)PTMs蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,為系統(tǒng)生物學(xué)研究翻開新的一頁。

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Recent advances in separation methods for post-translational modification proteomics

XU Jingjing1,2, LIU Xing1, ZHOU Hu1*

(1.DepartmentofAnalyticalChemistry,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China;2.ChemicalDrugsDepartment,ShanghaiInstituteofFoodandDrugControl,Shanghai201203,China)

Post-translational modifications (PTMs) are the key control of many cellular processes. Current progresses of separation methods for PTMs proteomics, including reversed phase (RP) chromatography, ion exchange (IEX) chromatography, hydrophilic interaction chromatography (HILIC), porous graphitic carbon (PGC) chromatography, capillary electrophoresis (CE) and size-exclusion chromatography (SEC) are reviewed. The methods for the identification of PTMs have higher resolution and sensitivity. In addition, some other important separation methods for proteomics study are introduced, and they may be applied in the study of PTMs with further optimization in the future.

post-translational modifications (PTMs); proteomics; reversed phase (RP) chromatography; ion exchange (IEX) chromatography; hydrophilic interaction chromatography (HILIC); porous graphitic carbon (PGC) chromatography; capillary electrophoresis (CE)

10.3724/SP.J.1123.2016.08047

2016-08-31

國家自然科學(xué)基金(21375138);中國科學(xué)院“百人計(jì)劃”;國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31500110);江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究課題(JKLPRD201404)。.

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 21375138); “One Hundred Talented People” of the Chinese Academy of Sciences; Youth Science Fund Project of National Natural Science Foundation of China (No. 31500110); Jiangsu Province Key Laboratory of Children’s Respiratory Diseases (Traditional Chinese Medicine) Open Research Topic (No. JKLPRD201404).

O658

A

1000-8713(2016)12-1199-07

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(上)·專論與綜述

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:zhouhu@simm.ac.cn.