張韋，王守燕，徐祥

濱州市中心血站，山東濱州256602

A101/B301基因家系分析

張韋，王守燕，徐祥

濱州市中心血站，山東濱州256602

目的研究ABO血型表型與基因型不符的家系，分析產(chǎn)生該現(xiàn)象原因。方法采用試管法對(duì)微板法篩查出的正反定型不符血樣做進(jìn)一步血型血清學(xué)分析進(jìn)行亞型確認(rèn)。對(duì)亞型樣本進(jìn)行血清學(xué)分析和DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用軟件比對(duì)分析后確定其基因型。結(jié)果從9 278份AB型無(wú)償獻(xiàn)血者血樣中檢出AB亞型血樣6例（檢出率為6.5/萬(wàn)），其中AelB1例、AB34例、B(A)表型1例。1例AB3亞型個(gè)體，紅細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗-B血清凝集為1+混合視野，若按血清表現(xiàn)型可歸為ABend；但是經(jīng)基因測(cè)序其基因均為A101/B301，且父代和子代也均為典型B3亞型。結(jié)論ABO亞型確認(rèn)應(yīng)采用血型血清學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)相結(jié)合的檢測(cè)方法；B亞型基因與正常的A基因結(jié)合在一起表現(xiàn)為α-1,3D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性的降低，使B抗原表達(dá)量減弱。

ABO亞型；基因型；家系

ABO亞型是ABO血型抗原較弱的亞型或變異型，它具有明確的血清學(xué)特點(diǎn),并且具備遺傳基礎(chǔ)。ABO亞型產(chǎn)生的主要原因是基因第6外顯子或第7外顯子發(fā)生了點(diǎn)突變，降低或改變了糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，導(dǎo)致抗原變異或弱表達(dá)，致使血型血清學(xué)表現(xiàn)為紅細(xì)胞上抗原減弱、混合視野、血清中出現(xiàn)不規(guī)則抗體或抗體活性減弱，從而給血型鑒定工作和臨床輸血帶來(lái)了困擾[1-4]。血型血清學(xué)反應(yīng)相同的抗原，可以有不同血型基因表達(dá)，如血清學(xué)表型同為A3型或Ax型的ABO血型亞型，其ABO基因可能不同，稱(chēng)之基因異質(zhì)性[5]。盡管ABO亞型出現(xiàn)的頻率不高，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，但是臨床意義很大，值得我們?nèi)ド罹?。筆者在獻(xiàn)血者血型鑒定中發(fā)現(xiàn)1例血型血清學(xué)ABend亞型，而基因分型為AB3的獻(xiàn)血者，血型血清學(xué)表型與血型基因型不一致，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

9 278份AB血型樣本均來(lái)源于山東省濱州市2014—2015年無(wú)償獻(xiàn)血者,經(jīng)獻(xiàn)血者知情同意后，EDTA抗凝管采集靜脈血5mL用于檢測(cè),去除重復(fù)樣本，獻(xiàn)血者身體健康檢查按照2011年由中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)聯(lián)合發(fā)布的《獻(xiàn)血者健康檢查要求》GB18467-2011操作。

1.2試劑與儀器

單克隆抗-A、抗B試劑（批號(hào)20121018）；抗-H試劑（批號(hào)20130408）；ABO反定型用紅細(xì)胞（批號(hào)20135 337）；血液基因組DNA抽提試劑盒（批號(hào)：M1218）Premix Tap（批號(hào)：A1301A）BigDye terminator V3.1Sequencing(批號(hào)：9700型PCR擴(kuò)增儀和3730型DNA測(cè)序儀；TL-16R平板離心機(jī)。

1.3血型血清學(xué)檢測(cè)

按照2006年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司頒布的《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版:246-269操作[6]。

1.4ABO基因第6、7外顯子直接測(cè)序和單體型序列分析

具體操作步驟參照文獻(xiàn)[7-8]。測(cè)序引物參照Olsson等設(shè)計(jì)的2對(duì)引物，分別對(duì)Exon6和Exon7進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序引物見(jiàn)表1。

表1　第6、7外顯子直接測(cè)序引物

2　結(jié)果

2.1血型血清學(xué)結(jié)果

從2014—2015年濱州市9 278份AB型無(wú)償獻(xiàn)血者血樣中，檢出AB亞型血樣6例，AB亞型在AB型人群中的檢出率為6.5/萬(wàn)，6例AB亞型標(biāo)本分別為AelB1例、AB34例、B(A)表型1例。AB3亞型獻(xiàn)血者中的1位先癥者，男，40歲，2014年1月獻(xiàn)血200mL，復(fù)檢血型時(shí)發(fā)現(xiàn)正定型AB型，反定型A型。紅細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗-B血清凝集為1+混合視野，經(jīng)血清學(xué)初步檢測(cè)懷疑為ABend型。經(jīng)獻(xiàn)血者和其家庭成員知情同意后，用EDTA抗凝管采集其妻子、兒子、父親、姐姐、外甥女采集靜脈血5mL用于檢測(cè)。血型血清學(xué)檢測(cè)中，先癥者和其姐姐紅細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)抗-B血清凝集均為1+混合視野，血漿中含抗-B抗體，血清學(xué)表型為ABend型，先癥者父親、兒子和外甥女均為典型B3亞型。這個(gè)家庭的血型遺傳不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，需做進(jìn)一步分析和檢測(cè)。家系成員血型血清學(xué)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2ABO基因直接測(cè)序分析

先癥者父親、兒子和外甥女第6和第7外顯子直接測(cè)序結(jié)果顯示：261位delG、297位A/G、526位C/G、657位C/T、703位G/A、796位C/A、803G位/C、930位G/A、1054位C/T、1096 G/A雜合，其基因型為B301/ O01；先癥者和姐姐第6和第7外顯子直接測(cè)序結(jié)果與B101標(biāo)準(zhǔn)序列相比，出現(xiàn)297A/G、476C/T、526C/G、657C/ T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1054位C/T、1096G/A雜合，有關(guān)序列信息，根據(jù)標(biāo)本多態(tài)性位點(diǎn)情況，指定其基因型為B301/A102。B301基因與B101序列比較，在1054位出現(xiàn)C>T單堿基突變。

2.3ABO基因克隆測(cè)序分析

先癥者樣本克隆測(cè)序結(jié)果顯示，1條單倍體為B301突變發(fā)生在1054位C>T,導(dǎo)致氨基酸第352位氨基酸由精氨酸（Arg）轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼幔═rp；）另一條單倍體為A102?；驕y(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1，家系遺傳特征見(jiàn)圖2。

圖1　先證者基因測(cè)序結(jié)果

圖2　家系圖譜

3　討論

混合視野凝集是B3亞型紅細(xì)胞的明顯特征，顯微鏡下觀察，B3細(xì)胞與抗-B或抗AB血清孵育后出現(xiàn)一些被絕大部分游離的非凝集紅細(xì)胞包圍的數(shù)個(gè)紅細(xì)胞形成的凝集塊。若將凝集細(xì)胞去除，剩余的游離細(xì)胞再與抗-B血清反應(yīng)，仍然出現(xiàn)混合視野凝集[9-12]。先癥者和姐姐紅細(xì)胞與抗-B凝集達(dá)不到3+混合視野，且還有較弱的抗-B抗體,若按血清表現(xiàn)型可歸為ABend，基因型為A101/B301，經(jīng)家系調(diào)查其父代和子代均為含有B301基因單體的B3亞型，故可確定其血型為AB3亞型。據(jù)報(bào)道，亞型人A1B3血漿中大多含有抗-B抗體[13-15]，致使正反定型不一致現(xiàn)象。日常的檢測(cè)中一般都使用單克隆抗體血清檢測(cè)，因單克隆抗體效價(jià)都很高，增加了與細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，如本家系中的3例B3亞型標(biāo)本，先證者父親、兒子、外甥女與單克隆血清反應(yīng)均≥4+，與人源血清反應(yīng)明顯減弱。

表2　血型血清學(xué)反應(yīng)格局

本家系測(cè)序結(jié)果表明，先證者與其姐姐的1054C>T突變來(lái)自他們的父親，他們的孩子又遺傳了該突變，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。這一突變與B101序列比較，在1054位出現(xiàn)C>T,引起多肽鏈第352位精氨酸Arg被色氨酸Trp取代。色氨酸為非極性a氨基酸,而堿性的精氨酸是含有胍基的極性a氨基酸，生理?xiàng)l件下帶正電荷。氨基酸替換打破了電荷平衡，造成了a-1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性部分喪失，使B抗原合成量減少。

ABO亞型的確認(rèn)不能單單從血清學(xué)或分子生物學(xué)改變上來(lái)判定，血型血清學(xué)表現(xiàn)一致的ABO亞型個(gè)體，其ABO亞型基因結(jié)構(gòu)可能不同，ABO亞型基因相同的ABO亞型個(gè)體，血型血清學(xué)表現(xiàn)可能會(huì)不一致。本家系檢出的2例AB3亞型個(gè)體，如果單單只做血型血清學(xué)試驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)歸為ABend亞型；但是他們的基因都是A101/B303，而且父代和子代均為典型B3亞型。臺(tái)灣人Li L等曾報(bào)道父代Ax血型，子代與B基因結(jié)合在一起AxB加強(qiáng)為A3B[16]。由此筆者推斷，個(gè)體基因的兩條單倍體在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中相互影響，A亞型基因與正常的B基因結(jié)合在一起表現(xiàn)為α-1,3-N-氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性的增強(qiáng)，A抗原表達(dá)量增加；B亞型基因與正常的A基因結(jié)合在一起表現(xiàn)為α-1,3-D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性的降低，B抗原表達(dá)量減弱。

該研究標(biāo)本量較少致使調(diào)查結(jié)果有些局限，如果能發(fā)展簡(jiǎn)單易操作的基因分型技術(shù)，使大多數(shù)血型工作者都能掌握該技術(shù)，可以搜集大量表型正常的標(biāo)本一起做研究，就能更加確切的分析該地區(qū)ABO基因的遺傳多態(tài)性，更精準(zhǔn)地為臨床患者進(jìn)行血液配型工作，增加臨床輸血的安全性和有效性。

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Analysis of A101/B301 Gene Family

ZHANGWei,WANG Shou-yan,XU Xiang
The Blood Center of Binzhou City,Binzhou,Shandong Province,256602 China

Objective To research the gene family of ABO phenotype failing to match the genetype and analyze its cause. Methods The positive typing and reverse typing?unconformity blood samples screened out by microplate test were given the further blood group serology analysis for subgroup confirmation by the test tube method,and the subgroup samples were given the serological analysis and DNA sequencing,and the genetype was confirmed after analysis.Results 6 cases of AB subtype blood samples were tested from 9 278 cases of unpaid blood donors whose blood type was AB,and the detection rate was 65 per thousand,including 1 case whose blood type was AelB,4 cases whose blood type were AB3,and 1 case with B (A)phenotype,and 1 case with AB3 subtype,but all genes were A101/B301 after the gene sequencing,and the sire?generation and filial generation were the typical B3 subtype.Conclusion ABO subtype confirmation should adopt the blood group serology,molecular biology and genetics,and the manifestation of subtype B gene and normal A gene is α-1,and the decrease of 3D-galactose transferase activity weakens the B antigen expression level.

ABO subtype;Genetype;Gene family

R457.1

A

1672-5654（2016）11（b）-0063-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.063

2016-08-15）

張韋（1976-），女，山東濱州人，在職碩士在讀，主管技師，主要從事輸血質(zhì)量控制和輸血研究工作。