盧超銀，沈雨莎，張燁，倪燁欽，印媛君

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053

L-蘋果酸及蘋果對睡眠剝奪小鼠記憶的影響

盧超銀1，沈雨莎1，張燁1，倪燁欽1，印媛君2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，浙江杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州310053

目的探討不同濃度L-蘋果酸以及蘋果對睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。方法15只小鼠隨機分為對照組（ICR+生理鹽水組）和實驗組（ICR+高、中、低濃度L-蘋果酸組，ICR+蘋果組）。用Morris水迷宮測出睡眠剝奪前后小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶。結(jié)果ICR+高濃度L-蘋果酸組學(xué)習(xí)記憶并沒有明顯改善；ICR+中、低濃度L-蘋果酸組學(xué)習(xí)記憶明顯改善；ICR+蘋果汁組學(xué)習(xí)記憶得到明顯改善，且效果優(yōu)于ICR+中、低濃度L-蘋果酸組。結(jié)論適當(dāng)濃度的L-蘋果酸和蘋果都能夠起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用，但是蘋果改善學(xué)習(xí)記憶的機制是否僅同L-蘋果酸相關(guān)還需要進一步的研究。

睡眠剝奪；L-蘋果酸；蘋果；學(xué)習(xí)記憶

睡眠是維持人類許多生理功能穩(wěn)態(tài)所必需的，睡眠對記憶的形成、存儲等都具有重要的作用[1-3]。睡眠剝奪是指人因環(huán)境的需要喪失了所需睡眠量的狀態(tài)[4]。隨著現(xiàn)代社會的高速發(fā)展，生活節(jié)奏的日益加快，人們持續(xù)性工作的狀態(tài)愈來愈普遍，繼而導(dǎo)致了剝奪的睡眠量增加。睡眠剝奪或者睡眠抑制可引起學(xué)習(xí)記憶的損害，這一點已有廣泛的研究證實[3,5-8]。鄧龍祥等人的研究中[10]指出蘋果中的L-蘋果酸能改善睡眠剝奪的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。但是不同濃度的蘋果酸對小鼠睡眠剝奪后空間學(xué)習(xí)記憶具體影響的不同并未有進一步的研究。且成熟的蘋果中含有一定量的L-蘋果酸，蘋果對小鼠是否也同樣能夠起到改善睡眠剝奪后學(xué)習(xí)記憶的作用也未見研究。該實驗擬通過研究L-蘋果酸以及蘋果對睡眠剝奪后大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，以對上述內(nèi)容做進一步的探究。

1　資料和方法

1.1實驗動物和分組

選用健康成年ICR小鼠17只，體重(20±2)g(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)。經(jīng)Morris水迷宮訓(xùn)練之后，篩選出成績相近的小鼠15只，隨機分為5組，每組3只。對照組：ICR+生理鹽水組；實驗組：ICR+高濃度（0.7 mg/mL）L-蘋果酸組，ICR+中濃度（0.35 mg/mL）L-蘋果酸組，ICR+低濃度（0.175 mg/mL）L-蘋果酸組，ICR +蘋果汁組（蘋果汁為直接榨取蘋果而來，未添加其他物品）。

1.2藥品與儀器

Morris水迷宮(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供)，L-蘋果酸(藥品源自常茂生物化學(xué)工程有限公司，純度為99.86%)，灌胃針等。

1.3睡眠剝奪模型的建立

實驗人員于Morris水迷宮訓(xùn)練后一天的8:00至次日8:00這段時間內(nèi)監(jiān)測小鼠的活動情況，阻止小鼠入睡，以達到對小鼠進行睡眠剝奪的目的。

1.4給藥

從睡眠剝奪期間開始給藥，睡眠剝奪期間于下午17：00對實驗組和對照組同時按0.4mL的劑量灌胃。睡眠剝奪之后，依然按分組于每天下午17：00進行灌胃，劑量同睡眠剝奪期間一樣，1次/d，連續(xù)進行5 d。

1.5學(xué)習(xí)記憶的測試

用Morris水迷宮法進行小鼠學(xué)習(xí)記憶的測試。睡眠剝奪前對小鼠進行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練。訓(xùn)練時，將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，采集控制儀自動記錄小鼠的路線。小鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s，然后進行下一次的訓(xùn)練。每只小鼠從四個入水點分別放入水池為一輪訓(xùn)練，訓(xùn)練4輪，共訓(xùn)練16次。訓(xùn)練成功的標(biāo)志是小鼠已經(jīng)形成一定的尋找平臺的路線。淘汰訓(xùn)練未成功的小鼠，本實驗15只小鼠訓(xùn)練成功，淘汰2只。對小鼠進行連續(xù)5 d灌胃后進行水迷宮測量一次。測量時，將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入，反應(yīng)時(s)取平均數(shù)，作為測試成績，若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺，則以60 s計。

1.6統(tǒng)計方法

2　結(jié)果

將實驗組和對照組小鼠在水迷宮中的反應(yīng)時數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果如表1。

3　討論

已有研究表明，睡眠對記憶的形成、儲存等都有密切關(guān)系[1-3]，而睡眠剝奪會對記憶造成一定損害。鑒于睡眠剝奪對記憶的影響已有大量的實驗證明，所以本實驗在設(shè)計時，未設(shè)置正常對照組，即肯定了睡眠剝奪對學(xué)習(xí)記憶的不良作用。該實驗中Morris水迷宮法進行小鼠學(xué)習(xí)記憶的測試顯示，睡眠剝奪后，高濃度L-蘋果酸灌胃組的小鼠在蘋果酸灌胃后學(xué)習(xí)記憶能力并沒有得到明顯的改善；中、低濃度L-蘋果酸灌胃組的小鼠在蘋果酸灌胃后學(xué)習(xí)記憶能力得到了明顯的改善；蘋果汁灌胃組的小鼠在蘋果汁灌胃后學(xué)習(xí)記憶能力得到了明顯的改善，且改善效果優(yōu)于中、低濃度蘋果酸灌胃組。從總體的實驗結(jié)果來看，適當(dāng)?shù)奶O果酸濃度的確能夠起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用，同時蘋果也的確有一定的改善學(xué)習(xí)記憶的作用。但是蘋果是否僅通過L-蘋果酸來改善學(xué)習(xí)記憶，即蘋果中是否還存在其他可以改善學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)還需要進行進一步的研究。

睡眠剝奪可打亂人體的生物鐘，干擾腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量及分布，誘導(dǎo)某些異?；虻奶禺愋员磉_，使腦內(nèi)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)偏離平衡，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。海馬—邊緣系統(tǒng)中有豐富的膽堿能纖維分布，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。睡眠剝奪后的SD大鼠學(xué)習(xí)能力明顯下降，海馬乙酰膽堿含量明顯降低[9]。有研究表明L-蘋果酸對睡眠剝奪小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯的改善作用，可以通過改善腦組織的能量代謝，調(diào)整腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)幫助學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)[10-11]。但L-蘋果酸通過影響海馬乙酰膽堿來達到改善學(xué)習(xí)記憶能力作用的具體機制還有待進一步證實和研究。

表1　睡眠剝奪前后各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶測定的結(jié)果[（±s），s]

表1　睡眠剝奪前后各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶測定的結(jié)果[（±s），s]

項目睡眠剝奪前睡眠剝奪后P值生理鹽水0 . 7 m g / m L L -蘋果酸組0 . 3 5 m g / m L L -蘋果酸組0 . 1 7 5 m g / m L L -蘋果酸組蘋果汁組5 6 . 9 5 ± 5 . 3 2 5 7 . 1 5 ± 8 . 9 9 0 . 9 7 5 4 9 . 3 8 ± 9 . 9 8 5 2 . 1 8 ± 7 . 1 7 0 . 7 1 4 4 8 . 8 5 ± 6 . 1 6 3 6 . 3 ± 1 6 . 4 2 0 . 2 8 4 5 1 . 7 7 ± 7 . 6 2 4 7 . 1 3 ± 2 3 . 1 7 0 . 7 5 8 5 0 . 1 8 ± 9 . 0 5 3 2 . 8 2 ± 3 . 6 1 0 . 0 3 7

實驗中高濃度的蘋果酸并沒有起到明顯的改善學(xué)習(xí)記憶的作用，可能是由于小鼠個體對蘋果酸敏感度的差異，蘋果酸無法作用于相應(yīng)靶點來達到改善學(xué)習(xí)記憶的作用引起，也可能是由其他原因造成，該實驗并未對此進行深入的研究。實驗中，由于采用的樣本含量較小，存在著統(tǒng)計學(xué)誤差，建議對實驗進行進一步的完善，擴大樣本的含量，來為該實驗的實驗結(jié)果提供更可靠的數(shù)據(jù)支持。L-蘋果酸及蘋果對于睡眠剝奪后學(xué)習(xí)記憶功能的影響對于夜間作業(yè)人員的保健具有重要意義，提供了一條新的思路。

[1]Yoo SS，Hu PT，Gujar N，et al.A deficit in the ability to form new human memories without sleep[J].Nat Neurosci，2007，10（3）：385-392.

[2]Mueller AD，Pollock MS，Lieblich SE，et al.Sleep deprivation can inhibit adult hippocampal neurogenesis Independent of adrenal stress hormones[J].Am J PhysiolRegulIntegr Comp Physiol，2008，294（5）：R1693-R1703.

[3]劉艷，吳衛(wèi)平.慢性睡眠限制對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014,35（6）：620-622.

[4]宋國萍,張侃,苗丹明.睡眠剝奪后清醒程度和困倦程度變化[J].中國臨床心理學(xué)雜志，2004,12(3):290-292.

[5]Walsh CM，Booth V，Poe GR.Spatial and reversal learning in the Morris water maze are largely resistant to six hours of REM sleep deprivation following training[J].Learn Mem，2011，18（7）：422-434.

[6]Hagewoud R，Bultsma LJ，Barf RP，et al.Sleep deprivation impairs contextual fear conditioning and attenuates subsequent behavioural，endocrine and neuronal responses[J].J Sleep Res，2011，20（2）259-266.

[7]楊遙，劉靜，徐江濤．睡眠剝奪對認知功能的影響研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2013，13（4）：791-794．

[8]趙忠新，張紅菊．重視睡眠剝奪導(dǎo)致認知功能障礙機制的腦功能成像研究[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2013，13（5）：359-362．

[9]劉彤,徐淑梅.睡眠剝奪對大鼠學(xué)習(xí)能力和海馬乙酰膽堿含量的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2007(3)：12-13.

[10]鄧龍祥，陳況，葉處陽.L-蘋果酸對睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2012(20):12-13.

[11]Morris R．Development of a water maze procedure for studying spacial learning in the rat[J].Neurosci Methods，1984，11: 47.

Effect of L-malic Acids and Apples on the Sleep Deprivation of Memory of Mice

LU Chao-yin1,SHEN Yu-sha1,ZHANG Ye1,NI Ye-qin1,YIN Yuan-jun2
1.Second Clinical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China；2.College of Basic Medicine,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou,Zhejiang Province,310053 China

Objective To study the effect of different concentrations of l-malic acids and apples on the sleep deprivation of memory of mice.Methods 15 mice were randomly divided into the control group(ICR+normal saline group)and the experiment group(ICR+high,middle and low concentrations of l-malic acid group,ICR+apple group),and the spatial learning and memory of mice before and after the sleep deprivation was tested by the Morris water maze.Results The learning memory of ICR+high concentration of l-malic acid group was not obviously improved,and the learning memory of ICR+middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group was obviously improved,and the learning memory effect of ICR+apple juice group was better than that of middle concentration of l-malic acid group and ICR+low concentration of l-malic acid group.Conclusion The appropriate concentration of l-malic acids and apple can have an effect of improving the learning memory,but whether the improvement mechanism of apples on learning memory is only related to the l-malic acid needs the further study.

Sleep deprivation;L-malic acid;Apple;Learning memory

R96

A

1672-5654（2016）11（b）-0016-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.32.016

2016-08-11）

盧超銀（1995.7-），女，浙江臨海人，本科在讀，研究方向：行為醫(yī)學(xué)。

印媛君（1971.11-），女，浙江浦江人，碩士研究生，副教授，研究方向：心肌缺血，郵箱：hzyyjun@126.com。