房玉濤 劉桂芳 張 云

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京，100053)

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新活絡(luò)效靈丹對ApoE基因敲除早期動脈粥樣硬化小鼠TGF-β的影響

房玉濤 劉桂芳 張 云

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京，100053)

目的：觀察新活絡(luò)效靈丹對ApoE基因敲除小鼠AS早期斑塊的病理形態(tài)學(xué)改變及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)表達的影響，探討新活絡(luò)效靈丹抗AS早期斑塊的可能機制。方法：采用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠建立AS模型，將45只小鼠隨機分為模型組、西藥組、中藥組，另將C57BL/6J小鼠10只設(shè)為空白對照組。在造模的同時即給予藥物干預(yù)，空白對照組不予處理，模型組予以生理鹽水0.3 mL/d，中藥組給予新活絡(luò)效靈丹9.67 g/(kg·d),西藥組給予阿托伐他汀鈣片3.33 mg/(kg·d)，均每日灌胃1次，連續(xù)給藥13周。取主動脈根部，HE染色進行病理觀察，采用RT-PCR技術(shù)檢測各組TGF-βmRNA的表達水平。結(jié)果：模型組主動脈內(nèi)形成明顯的AS斑塊，并出現(xiàn)脂質(zhì)核心,泡沫細胞增多，大量的巨噬細胞的浸潤；西藥組管壁可見AS斑塊，斑塊面積明顯小于模型組；中藥組斑塊面積顯著減少，部分內(nèi)膜較為光滑。模型組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯低于空白對照組(P<0.01)；西藥組、中藥組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯高于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，而中藥組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平高于西藥組，但2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：新活絡(luò)效靈丹在一定程度上可通過上調(diào)保護性因子TGF-β以抑制免疫炎性反應(yīng)，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用,可能是其防治AS早期斑塊的形成機制之一。

新活絡(luò)效靈丹；ApoE基因敲除小鼠；動脈粥樣硬化；轉(zhuǎn)化生長因子-β

動脈粥樣硬化(Artherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要致病因素，具有進展性和全身性的特點。防治AS的關(guān)鍵在于早期干預(yù)，防止、延緩斑塊形成和穩(wěn)定斑塊。在AS發(fā)生和發(fā)展過程中，炎性反應(yīng)始終起著重要作用[1-2]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor Beta，TGF-β)具有抗炎和對抗脂質(zhì)損害的作用,可延緩AS的發(fā)展，是保護心血管系統(tǒng)重要的細胞因子之一[3-4]。本研究通過高脂飲食構(gòu)建ApoE基因敲除小鼠AS模型，觀察新活絡(luò)效靈丹對ApoE基因敲除小鼠AS的早期斑塊面積的影響，并采用PCR技術(shù)，檢測主動脈內(nèi)TGF-β表達水平，從而探討其防治AS斑塊形成的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡ApoE基因敲除小鼠(C57BL/6J)45只，均為雄性，體重17～21 g，飼以高脂飼料；清潔級C57BL/6J小鼠10只，6～8周齡，均為雄性，體重17～21 g，普通飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為2級，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，光照時間：7:00—19:00。以上動物購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，許可證號：SCXK(京)2011-0012。

1.2 實驗藥物及制備 新活絡(luò)效靈丹(顆粒劑型)：丹參30 g、三七4 g、乳香12 g、沒藥12 g，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科制備，顆粒劑為四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)。阿托伐他汀鈣片由大連輝瑞制藥有限公司提供，20 mg/片(批號：031711k)。

1.3 主要試劑和儀器 Trizol試劑，購自Invitrogen公司，批號：14105；Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司，批號：00044977；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國應(yīng)用生物公司，批號：1108401；7900HT型熒光定量PCR儀，購自美國應(yīng)用生物公司；光學(xué)顯微鏡，BX-41型，日本OLYMPUS公司；引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，引物序列：上游5′-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3′，下游：5′-TTTCTCATAGATGGCGTTGTTG-3′,擴增物長度：217 bp。蘇木素伊紅(HE)染液由廣安門醫(yī)院病理實驗室提供。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，采用隨機數(shù)字表法將45只ApoE基因敲除小鼠分為模型組15只、中藥組15只、西藥組15只。3組均喂以高脂飼料飼料(78.85%基礎(chǔ)飼料+0.15%膽固醇+21%脂肪混合而成)13周。另設(shè)C57BL/6J小鼠10只為空白對照組，給予正常飼料喂養(yǎng)。

1.4.2 各組小鼠給藥方法 造模同時即進行藥物干預(yù)，根據(jù)成人臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體重折算系數(shù)10折算成小鼠用量，中藥組給予新活絡(luò)效靈丹顆粒劑9.67 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予阿托伐他汀鈣片3.33 mg/(kg·d)灌胃。西藥組和中藥組藥劑均以蒸餾水溶解后，按照體重比灌胃；模型組每天給予0.3 mL的生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥13周?？瞻讓φ战M小鼠不予處理。

1.5 觀察指標與方法 給藥13周后取材，取材前夜禁食水。處死全部小鼠，無菌條件下取出主動脈根部，部分組織常規(guī)石蠟包埋切片，部分組織放在凍存管內(nèi)液氮驟冷保存。1)自主動脈根部連心肌部分橫斷面做連續(xù)切片，切片厚度5 μm[5]。對切片分別行HE染色，在鏡下觀察主動脈病理組織形態(tài)。2)RT-PCR法檢測小鼠主動脈中TGF-β mRNA表達，參照試劑盒說明進行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠主動脈組織HE染色結(jié)果 空白對照組(A):主動脈內(nèi)膜光滑連續(xù)，內(nèi)皮細胞排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞；模型組(B)：主動脈內(nèi)形成明顯的AS斑塊，并可出現(xiàn)脂質(zhì)核心，膽固醇和膽固醇酯沉積，泡沫細胞增多，大量的巨噬細胞的浸潤；西藥組(C)：管壁可見AS斑塊，斑塊面積明顯小于模型組；中藥組(D)：斑塊面積顯著減少，部分內(nèi)膜較為光滑。見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈根部組織病理圖(HE染色，×15倍)

2.2 各組小鼠主動脈TGF-βmRNA表達比較 表1顯示，模型組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯低于空白對照組(P<0.01);西藥組、中藥組小鼠主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平明顯高于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，而中藥組小鼠腹主動脈組織中TGF-βmRNA表達水平高于西藥組，但2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠主動脈組織中TGF-β mRNA

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

目前已有很多研究證據(jù)表明，AS是一種血管的慢性炎性反應(yīng)病變。炎性反應(yīng)可以啟動斑塊內(nèi)炎性細胞分泌多種細胞因子，通過多種途徑影響斑塊穩(wěn)定。抑制血管的炎性反應(yīng)已成為除他汀之外的另一重要的抗AS手段。

TGF-β是一類功能廣泛、作用復(fù)雜的生長因子，參與炎性反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)、細胞生長和分化、細胞外基質(zhì)合成等許多生物學(xué)過程[6]。研究表明，TGF-β具有抗炎和對抗脂質(zhì)損害的作用,可延緩AS的發(fā)展，是保護心血管系統(tǒng)重要的細胞因子之一[7-8]。近來發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定性心絞痛的患者呈現(xiàn)TGF-β水平下降的趨勢，低水平的TGF-β表達很可能與AS的進展密切相關(guān)[9-10]。

血瘀證貫穿AS整個病變過程的觀點已經(jīng)得到眾多醫(yī)者認同，臨床采用活血化瘀為主治療AS，療效得到確定。挖掘組方簡潔、療效確切、機制明確、價格低廉、易于久服的抗AS活血化瘀方劑有著非常重要的現(xiàn)實意義。

活絡(luò)效靈丹為近代名醫(yī)張錫純所創(chuàng)，首見于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，近年，運用該方加減在心血管疾病領(lǐng)域的作用日益受到重視和關(guān)注[11]。我們根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，將活絡(luò)效靈丹加減，化裁創(chuàng)制出新活絡(luò)效靈丹(乳香、沒藥、三七、丹參)，治療AS取得較好療效。乳香、沒藥為樹脂類活血化瘀中藥，兩者均具有活血化瘀、消腫止痛生肌之效，現(xiàn)代藥理研究表明：乳香具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性，抗炎作用可能與其對炎性反應(yīng)細胞因子的調(diào)控和對蛋白激酶通路的影響有關(guān)[12]。沒藥具有強效抑制急慢性炎性反應(yīng)的作用，其活性成分能降低炎性反應(yīng)遞質(zhì)過氧化物酶的活性[13]。方中以三七易當歸，活血止血、生血補氣，以糾乳香、沒藥久服耗氣之弊，使祛瘀而不傷正，易于長久服用?，F(xiàn)代藥理研究表明[14]，三七能通過抑制血小板聚集、促進纖溶而達到抗血栓的效應(yīng)。其有效成分三七總皂苷提高心肌對缺氧環(huán)境的耐受力，同時擴張血管、改善血供。丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)之功。現(xiàn)代藥理研究表明[15]，丹參可擴張冠狀動脈、降低心肌耗氧量、防止心肌缺血和心肌梗死，所含丹參酮可抑制炎性反應(yīng)細胞活化、降低炎性反應(yīng)細胞因子、趨化因子表達。四藥相伍，共奏補氣活血、化瘀通經(jīng)之效，臨床治療AS療效顯著，但是其作用機制尚不明確。

本研究顯示，與模型組比較，中醫(yī)組和西藥組AS斑塊面積明顯縮小，證實新活絡(luò)效靈丹具有防止AS早期斑塊形成的作用，中藥組AS小鼠主動脈組織TGF-B mRNA表達明顯升高，與西藥組比較無明顯差異，提示新活絡(luò)效靈丹具有提高AS小鼠主動脈組織TGF-βmRNA的表達的作用，可能是防治AS早期斑塊形成的機制之一。

[1]Ross R.Atherosclerosis—an inflammatory disease[J].New England journal of medicine,1999,340(2):115-126.

[2]張運.關(guān)于動脈粥樣硬化(AS)的新治療靶點[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(6):1-3.

[3]McCaffrey T A.TGF-βs and TGF-β receptors in atherosclerosis[J].Cytokine and growth factor reviews，2000,11(1):103-114.

[4]McCaffrey T A,Du B，F(xiàn)u C，et al.The expression of TGF-β receptors in human atherosclerosis：evidence for acquired resistance to apoptosis due to receptor imbalance[J].Journal of molecular and cellular cardiology,1999,31(9):1627-1642.

[5]Suzuki H,Kurihara Y,Takeya M,et al.A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection[J].Nature,1997，386:292-296.

[6]Clark DA,Coker R.Transforming growth factor-beta(TGF-beta)[J].Int J Biochem Cell Biol,1998,30(3):293-298.

[7]王婉秋,孫侃,靳瑾,等.糖尿病性動脈粥樣硬化大鼠血漿VEGF及TGF-β1表達水平的改變和辛伐他汀的保護作用[J].中國動脈硬化雜志,2014,22(9):929-933.

[8]郝春艷,段虎斌,劉學(xué)軍,等.口服HSP60對動脈粥樣硬化大鼠血清TGF-β和調(diào)節(jié)性T細胞含量的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2013,11(11):1355-1356.

[9]李玉,張言鎮(zhèn),周艷菊,等.血清TGF-β1和CTGF水平與急性冠脈綜合征的關(guān)系[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011,27(7):968-970.

[10]裴芳,黃驥,黃婕,等.重慶地區(qū)漢族人群冠心病TGF-β1基因啟動子區(qū)-509C/T多態(tài)性檢測及其意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,15(1):1-3.

[11]鄧茹月,房玉濤.活絡(luò)效靈丹治療心血管疾病的研究進展[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,36(3):142-144.

[12]常允平,韓英梅,張俊艷.乳香的化學(xué)成分和藥理活性研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2012,27(1)：52-59.

[13]Hanus L,Rezanka T,Dembitskv VM,et al.Myrrh-Com-miphora chemistry[J].2005,149(1):23.

[14]樸春花.三七的藥理作用研究進展概述[J].中國醫(yī)藥指南,2011,13(9):209-210.

[15]楊志霞,林謙,馬利.丹參對心血管疾病藥理作用的文獻研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012,7(2):93-97.

(2016-08-22收稿 責任編輯：洪志強)

Effect of New Huoluo Xiaoling Dan on the TGF-β in ApoE Knock-out Mice with Early Atherosclerosis

Fang Yutao, Liu Guifang，Zhang Yun

(Guang′anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalsciences,Beijing100053,China)

Objective:To observe the effect of New Huoluo Xiaoling Dan (NHLXLD)on aorta pathological changes in ApoE Knock-out mice and the expressions of Transforming Growth Factor beta (TGF-β),and to explore possible mechanism of anti-AS．Methods:AS model was induced by high lipid diet in ApoE knock-out mice.Forty five ApoE knock-out mice were equally randomized into 3 groups， including control group(CG),western medicine group (WMG) and traditional Chinese medicine group(TCMG).Ten C57BL /6J mice were also prepared as blank group (BG).During modeling,BG received no intervention;CG took normal saline 0.3 mL daily;TCMG was treated by NHLXLD 9.67 g/kg.d,and WMG was administered avarstatin 3.33 mg/kg.d.The treatment lasted for 13 weeks with gastric lavage once everyday.Then the aortic roots were taken for HE stain and the mRNA levels of TGF-βof each group were assayed．Results:Atherosclerotic plaques were observed obviously in the aorta of CG mice with overwhelming formation of foam cells, lipid core and a large number of macrophages infiltration．There were visible AS plaques on WMG aortic wall;plaque area was significantly lower than the CG;plaque area in TCMG was significantly reduced with the more smooth aortic endometrium. The TGF-β mRNA expressions of CG were lower than BG(P<0.01);The TGF-β mRNA expressions of WMG and TCMG were higher than CG(P<0.05 orP<0.01).While the TGF-β mRNA expressions of TCMG were higher than WMG, but the difference was not statistically significant (P>0.05).Conclusion:NHLXLD suppressed immune inflammatory response in a certain extent by increasing protective factor TGF-β on anti-AS.It might be one of the possible mechanisms preventing the formation of AS plaque．

New Huoluo Xiaoling Dan; ApoE Knock-out Mice;Atherosclerosis; TGF-β

中國博士后科學(xué)基金(編號：20080440498)；國家自然科學(xué)基金青年項目(編號：81302964/H2708)

R972.6

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.10.044