韓雪 李雯 李明錦 朱慧慧 劉會玲

·臨床研究·

宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達

韓雪 李雯 李明錦 朱慧慧 劉會玲

目的：觀察宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達。方法：選取甘肅省人民醫(yī)院婦科2014年4月至2015年4月的宮頸癌術(shù)前患者22例，宮頸癌術(shù)后患者24例和健康者29例（對照組）。通過流式細(xì)胞儀檢測患者外周血中的Treg細(xì)胞，通過對Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4+、CD25+及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+的標(biāo)記以及對宮頸癌患者外周血中Treg細(xì)胞的分布情況進行分析。結(jié)果：宮頸癌術(shù)前、宮頸癌術(shù)后及健康人患者血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比分別為(4.012±0.784)%、（1.915±0.508）%、(0.643±0.375)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增加可能影響機體對腫瘤的免疫效應(yīng)，發(fā)生免疫逃逸而致瘤。

宮頸癌；Treg；免疫反應(yīng)

宮頸癌是最常見的惡性腫瘤，其死亡率在婦科腫瘤中位居第二[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2008年全球新增約50萬宮頸癌病例，其中發(fā)展中國家約1.9%、發(fā)達國家約有0.9%的女性患宮頸癌[2]。Treg細(xì)胞被認(rèn)為是一群具有抑制其他免疫細(xì)胞功能的負(fù)調(diào)控細(xì)胞，是惡性腫瘤及免疫疾病中外周免疫耐受的關(guān)鍵細(xì)胞，可以通過下調(diào)機體的免疫應(yīng)答來降低宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。本研究通過流式細(xì)胞儀對宮頸癌患者外周血中Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4+、CD25+及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+的標(biāo)記，來分析宮頸癌外周血中的Treg細(xì)胞的數(shù)量，探討Treg細(xì)胞在宮頸癌患者外周血中的表達狀態(tài)及臨床意義，為宮頸癌免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取宮頸癌術(shù)前患者22例，宮頸癌術(shù)后患者24例，所有病例均為甘肅省人民醫(yī)院婦科住院病例，為2014年4月至2015年4月的新發(fā)病例。健康對照組29例，是甘肅省人民醫(yī)院體檢中心同期進行體檢的健康志愿者。年齡35～65歲，平均年齡為50歲；三組人群中都征求了患者的同意，且近半年內(nèi)未接受過任何免疫治療，并排除自身免疫性疾病、嚴(yán)重的系統(tǒng)性、感染性疾病和妊娠等，三組患者之間資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組年齡比較

1.2 主要儀器與試劑批號為E10610-1635的anti-hu?manCD4FITC；批號為E10284-1633 的anti-humanCD25APC；批號為E09963-1633的anti-humanFoxp3PE）；批號為E00029-1671的Foxp3轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液；批號為4104911的FCM裂解液（用于裂解紅細(xì)胞）；批號為4111109的流式細(xì)胞儀染色緩沖液。以上均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀：BDFACSCal?ibur（美國BD公司）；12mm×75mm的圓底流式上樣管、2ml 離心管；TGL-16 臺式高速冷凍離心機；漩渦儀：GZ-Ⅰ多用振蕩器（北京冰箱電機廠）；微量移液器（1000μl、100μl、10μl）；冰浴盒。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件分析和整理數(shù)據(jù)，CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞的數(shù)量占所有外周血淋巴細(xì)胞的比例用（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

宮頸癌術(shù)前患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（4.012±0.784）%；宮頸癌術(shù)后患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（1.915±0.508）%；健康組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（0.643±0.375）%，三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CD4+/T細(xì)胞比例三組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1、圖2。

表2 各組外周血CD4+/T細(xì)胞與CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細(xì)胞比例

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Treg細(xì)胞，LYM：淋巴細(xì)胞

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞

3 討論

近年來，宮頸癌的發(fā)病率越來越高，預(yù)防和防治宮頸癌刻不容緩。目前臨床上尚未嘗試用細(xì)胞免疫治療的方法來抑制腫瘤。許多小鼠腫瘤模型的研究證實，無論是在體內(nèi)還是體外免疫，下調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)目或抑制其功能有助于打破免疫抑制，促進CD8+T細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞[4]。

Treg細(xì)胞就是通常所稱的CD4+CD25+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，它有兩種分化方式，一種是在外周，幼稚型Treg細(xì)胞受抗原刺激，由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生Foxp3，形成了CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。另一種是在胸腺，由未成熟的T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟，CD4+細(xì)胞通過Foxp3分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，稱為自然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞[5]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的主要調(diào)控因子。Foxp3不僅對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的活化有影響，而且對Treg細(xì)胞的發(fā)育和抑制也起一定作用[6,7]。Treg細(xì)胞可以通過多種途徑來抑制機體免疫，例如：破壞細(xì)胞代謝、依賴抑制性、調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞功能、細(xì)胞因子以及溶解細(xì)胞途徑[8]。Treg細(xì)胞還可以通過對機體免疫應(yīng)答的抑制，使機體對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。宮頸癌眾多發(fā)病機制之一是癌細(xì)胞的免疫逃逸[9]。免疫逃逸可以使?jié)摲跈C體內(nèi)的HPV長時間不被發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞上調(diào)分泌免疫抑制因子TGF-β,IL-10、IL-35等，下調(diào)Th1、Th2細(xì)胞，抑制機體免疫[8]，此過程與Foxp3基因關(guān)系密切，F(xiàn)oxp3影響Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能。研究表明，Treg細(xì)胞在宮頸癌患者中數(shù)量較多，Treg細(xì)胞數(shù)量與宮頸癌的分期及腫瘤大小密切相關(guān)，宮頸癌分期越高，腫瘤體積越大，Treg細(xì)胞的數(shù)量就越高[10]。

本研究通過流式細(xì)胞儀檢測宮頸癌術(shù)前、宮頸癌術(shù)后及健康人患者血中的Treg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在宮頸癌患者血中顯著升高。通過對Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4+、CD25+及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+的染色標(biāo)記以及對宮頸癌患者外周血中Treg細(xì)胞的分布情況進行分析，結(jié)果顯示，宮頸癌術(shù)前、宮頸癌術(shù)后及健康人患者血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比分別為(4.012± 0.784)%、（1.915±0.508）%和(0.643±0.375)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。由此說明CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增加可能影響機體對腫瘤的免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸而致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，Treg細(xì)胞數(shù)量與宮頸癌患者病情進展程度、預(yù)后以及生存率有關(guān)。近幾年研究也表明，免疫治療可能成為抑制腫瘤進而治療腫瘤的導(dǎo)向。因此，研究Treg數(shù)量在腫瘤性疾病中增高的原因、尋找抑制或清除Treg細(xì)胞的有效方法來降低Treg細(xì)胞數(shù)量，調(diào)節(jié)機體腫瘤微環(huán)境的變化，將為以后腫瘤性疾病的研究及自身免疫性疾病的治療提供新的方向。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of can?cer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12):2893-2917.

[3]Enarsson K,Lundin BS,Johnsson E,et al.CD4+CD25high regulatory T cells reduce T cell transendothelial migration in cancer patients[J]. Eur J Immunol,2007,37(1):282-291.

[4]Karimi S,Chattopadhyay S,Chakraborty NG.Manipulation of regulato?ry T cells and antigen-specific cytotoxic T lymphocyte-based tumour immunotherapy[J].Immunology,2015,144(2):186-196.

[5]Sakaguchi S,Yamaguchi T,Nomura T,et al.Regulatory T cells and im?mune tolerance[J].Cell,2008,133(5):775-787.

[6]Tosolini M,Kirilovsky A,Mlecnik B,et al.Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells(Th1,th2,treg,th17) in patients with colorectal cancer[J].Cancer Res,2011,71(4):1263-1271.

[7]Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY.Foxp3 programs the develop?ment and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol, 2003,4(4):330-336.

[8]Vignali D.How many mechanisms do regulatory T cells need?[J].Eur J Immunol,2008,38(4):908-911.

[9]Vici P,Mariani L,Pizzuti L,et al.Immunologic treatments for precan?cerous lesions and uterine cervical cancer[J].J Exp Clin Cancer Res, 2014,33:29.

[10]Zeng C,Yao Y,Jie W,et al.Up-regulation of Foxp3 participates in progression of cervical cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2013, 62(3):481-487.

A

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