胡訓(xùn)霞 史春陽(yáng) 丁艷 張萍 葛永勝 劉玉金 王澤港 葛才林,*

(1揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225009；2江蘇潤(rùn)揚(yáng)種業(yè)有限公司， 江蘇 儀征 211400；*通訊聯(lián)系人， E-mail：clge@yzu.edu.cn; yzlyjseed@163.com)

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水稻根系中磷高效吸收和利用相關(guān)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答

胡訓(xùn)霞1史春陽(yáng)1丁艷1張萍1葛永勝1劉玉金2,*王澤港1葛才林1,*

(1揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225009；2江蘇潤(rùn)揚(yáng)種業(yè)有限公司， 江蘇 儀征 211400；*通訊聯(lián)系人， E-mail：clge@yzu.edu.cn; yzlyjseed@163.com)

HU Xunxia, SHI Chunyang, DING Yan， et al. Response of gene expression related to efficient phosphorus absorption and utilization to low-P stress in rice roots. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 567-576.

研究水稻耐低磷機(jī)制，對(duì)高效利用土壤磷的水稻品種改良具有重要意義。應(yīng)用基因芯片和qRT-PCR技術(shù)，分析了耐低磷水稻品種儀2434和低磷敏感品種通粳981根系中磷高效吸收和利用相關(guān)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答。水稻葉片磷含量的測(cè)定結(jié)果表明，低磷脅迫下儀2434的葉片磷含量較對(duì)照降幅小，這表明儀2434較通粳981具有更強(qiáng)的磷素吸收利用能力。基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明，在低磷脅迫下的儀2434根系中，PHR1、osa-miR399s和SPXs基因的表達(dá)誘導(dǎo)、激活磷饑餓信號(hào)途徑；APA、PAPs、MPE、PA、PEPC和VDAC1、C4-DT/MAT等基因的表達(dá)誘導(dǎo)，增強(qiáng)有機(jī)磷水解酶和有機(jī)酸的合成和分泌，促進(jìn)介質(zhì)中難溶性磷的活化；OsPT2、OsPT6基因的表達(dá)誘導(dǎo)，促進(jìn)儀2434根系對(duì)磷的高效吸收。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，儀2434根系中與磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷活化、磷高效吸收相關(guān)的8個(gè)代表性基因(PHR1、SPX、PAP、APA、PEPC、MFS、OsPT2、OsPT6)的表達(dá)水平均隨低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步增高的趨勢(shì)；經(jīng)低磷處理后，所檢測(cè)的8個(gè)基因在儀2434根系中的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于其在通粳981根系中的轉(zhuǎn)錄水平，PHR1、APA、OsPT2在通粳981根系中的表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯，且儀2434根系組織和根系分泌的酸性磷酸酶活性較通粳981增強(qiáng)更顯著，這可能是儀2434較通粳981對(duì)低磷脅迫有較高耐性的主要機(jī)制之一。

水稻； 低磷脅迫； 基因表達(dá)； 磷活化； 磷高效吸收

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素之一，在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。磷不僅參與許多重要物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸的生物合成過(guò)程，也參與能量代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，且磷素對(duì)提高植物的抗逆性也有重要作用[1]。同時(shí)，磷也是植物利用效率最低的營(yíng)養(yǎng)元素，盡管全球極大多數(shù)土壤中總磷含量高，但就土壤磷對(duì)植物的有效性而言，全球約有43%的耕地[2]、我國(guó)約有2/3的耕地[3]表現(xiàn)為土壤磷的“遺傳學(xué)缺乏”[4]。

為獲得農(nóng)產(chǎn)品的高產(chǎn)，需大量增施磷肥，常導(dǎo)致如下后果的產(chǎn)生：過(guò)快消耗并浪費(fèi)寶貴的磷礦資源，導(dǎo)致磷礦資源的耗竭[5]；導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問(wèn)題[6-7]；增高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，并導(dǎo)致土壤物理質(zhì)量退化[8]。為解決上述問(wèn)題，利用生物和非生物途徑，活化和充分利用土壤中原有的固定態(tài)磷，以降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)磷肥的依賴，減少磷肥施用量，已成為更經(jīng)濟(jì)和環(huán)保地解決作物磷營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題的最新發(fā)展趨勢(shì)。

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中水稻已形成多種機(jī)制以適應(yīng)低磷環(huán)境，如根系形態(tài)變化、土壤磷活化(根系有機(jī)酸和酶分泌)、磷高效吸收運(yùn)轉(zhuǎn)、體內(nèi)磷分配和平衡、代謝途徑改變以及調(diào)節(jié)其他元素的吸收等方面[9-11]。上述低磷適應(yīng)機(jī)制顯然與水稻體內(nèi)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答相關(guān)[12-13]。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)水稻材料的篩選結(jié)果，耐低磷水稻材料可分為兩大類型，即磷高效吸收利用型和根系形態(tài)重塑型。充分利用現(xiàn)有的磷高效吸收利用型水稻材料，分析磷高效吸收利用相關(guān)基因?qū)Φ土酌{迫的應(yīng)答和調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘土壤磷高效利用的關(guān)鍵基因，可為磷高效水稻新品種的選育提供材料和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)

供試水稻材料：本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的磷高效吸收利用型耐低磷水稻儀2434(YI2434)和低磷敏感型水稻通粳981(TJ981)[14]。種子由江蘇潤(rùn)揚(yáng)種業(yè)有限公司提供。

材料培養(yǎng)和處理：分別取飽滿水稻種子，浸入10%(V/V)雙氧水中滅菌30 min，之后用去離子水反復(fù)沖洗干凈。種子于25℃溫水中浸種，發(fā)芽后的幼苗用水稻完全培養(yǎng)液(按國(guó)際水稻研究所提供的配方配制，pH = 5.4)進(jìn)行培養(yǎng)。待水稻幼苗生長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的秧苗用泡沫板固定移栽于容量為1 L的塑料盆中，同時(shí)設(shè)全磷和低磷(磷含量分別為0.32 mmol/L和0.016 mmol/L)兩個(gè)處理。每盆10株，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，每天更換一次培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)液pH調(diào)為5.4。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，條件如下，溫度35℃，14 h光照/10 h黑暗。將水稻培養(yǎng)至所需處理天數(shù)后，取根尖樣品用去離子水沖洗，液氮速凍后保存于超低溫冰箱中備用。

1.2 水稻葉片磷含量的測(cè)定

取低磷處理不同時(shí)間的水稻幼苗葉片，置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，105℃殺青30 min，然后80℃烘干至恒量，用微型粉碎機(jī)將葉片干樣粉碎，過(guò)0.25 mm篩，稱取0.3000 g葉片粉末，用H2SO4-H2O2消煮至清亮色，磷含量的測(cè)定采用鉬銻抗比色法[15]。

1.3 基因芯片檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

以耐低磷品種儀2434為材料，在低磷處理15 d后，分別取對(duì)照和1/20低磷處理的水稻根系(處理和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，用去離子水沖洗，液氮速凍，送至北京博奧生物有限公司進(jìn)行Agilent mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。其基本操作過(guò)程如下：

用Trizol (Invitrogen, USA)提取根系總 RNA，并純化(NucleoSpin? RNA clean-up Kit , MACHEREY-NAGEL,Germany)；經(jīng)電泳質(zhì)檢合格后，合成第一鏈和第二鏈cDNA，并純化雙鏈cDNA；以cDNA 為模板，用T7 Enzyme Mix 合成cRNA后純化(RNA Clean-up Kit , MN)；取5 μg cRNA，用CbcScriptⅡ酶和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并純化(PCR NucleoSpinExtract II Kit, MN)；取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行KLENOW 酶標(biāo)記、純化；標(biāo)記產(chǎn)物溶于雜交液中于45℃下雜交過(guò)夜，并對(duì)芯片進(jìn)行清洗、甩干；芯片用Agilent G2565CA 微陣列掃描儀進(jìn)行掃描，得到雜交圖片；采用Feature Extraction圖像分析軟件進(jìn)行芯片圖像分析，將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；將原始數(shù)據(jù)輸入到GeneSpring GX軟件中，用percentile shift法對(duì)信號(hào)值進(jìn)行歸一化處理；對(duì)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行差異基因篩選。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物序列

Table 1. The primer sequences used for qRT-PCR verification.

GeneID基因ID功能注釋Functionannotation上游引物Forwardprimer下游引物ReverseprimerOs01g0239000PHR15'-CGCAAGGTGAAGGTGGACT-3'5'-CGATGTTGTGGCGAGTGAG-3'Os07g0614700SPX5'-CCCATCCAATGACCACC-3'5'-TTGAAAGCCAAAACACG-3'Os10g0116800PAP5'-ATCACTATGACTGGAGGGG-3'5'-TGTTTCTGCTGCTGATGTG-3'Os05g0192100APA5'-AGTAGCACAAAGCAGCAATA-3'5'-CGTTCAGCATCTCCGTC-3'Os01g0758300PEPC5'-TCCAAGCCGCCTTTAGAA-3'5'-ATCACGGTCTCCACCCATC-3'Os06g0324800MFS5'-CCCTACGATGGATACTGGC-3'5'-AGGATGAAGGTGGTGGTGTT-3'Os03g0150800QsPT25'-AGCAAGGTCGGGTGGAT-3'5'-GAAGGTGAGTGCGTAGAGC-3'Os08g0564000OsPT65'-GCCTGCTCTTCACCTTCC-3'5'-CCGACGACAACGACAAAA-3'

利用分子功能注釋系統(tǒng)(http://bioinfo.capitalbio. com/ mas3/)對(duì)基因芯片中檢測(cè)的差異表達(dá)基因進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)一步利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProtKB/Swiss-Prot(http:// www.uniprot.org/uniprot/)對(duì)差異表達(dá)基因的類型和生物學(xué)功能進(jìn)行查詢和核對(duì)。

1.4 磷活化與吸收相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

1.4.1 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)基因芯片分析結(jié)果，選取8個(gè)與磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷活化和高效吸收相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相關(guān)基因的mRNA序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)所需的引物(表1)，引物均在GENEWIZ公司合成。

1.4.2 水稻根系總RNA提取

低磷處理5、10、15、20 d后，分別取水稻根系，采用植物總RNA提取試劑盒(RNA prep pure plant kit，TIANGEN公司，北京)提取總RNA。

1.4.3 cDNA第一鏈合成

取適量所提取的總RNA，采用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(FastQuant RT Kit , TIANGEN公司，北京) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并將不同樣品所合成第一鏈cDNA的濃度統(tǒng)一調(diào)整為300 ng/μL，然后根據(jù)需要分裝，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)適合實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的引物。將上述cDNA作為模版，配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20μL：10 μL SYBR? Premix ExTaqTM II(2×)(寶生物工程有限公司，大連)、0.8 μL PCR 正向引物(10 μmol/L)、0.8μL PCR 反向引物(10μmol/L)、0.4μL ROX Reference DyeⅡ(50×)、2 μL cDNA 模板、6μL ddH2O，并以Ubiquitin5(UBQ5)[16]作為內(nèi)參基因，應(yīng)用ABI PRISM 7500 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序設(shè)定如下：95℃下預(yù)變性30 s；然后設(shè)定40個(gè)循環(huán)，95℃下變性5 s，55℃(根據(jù)不同引物選取合適的退火溫度)下退火30 s，72℃下延伸30 s。每個(gè)樣品重復(fù)4次。

1.5 水稻根系酸性磷酸酶活性的測(cè)定

1.5.1 根系組織酸性磷酸酶活性的測(cè)定

參考McLachlan[17]等方法并略加改動(dòng)。稱取5 g洗凈的水稻鮮根，加入8 mL 0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.8)冰浴研磨成勻漿后，12000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，加入2 mL 0.05 mol/L對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-NPP)，30℃下黑暗反應(yīng)30 min，然后加入2 mL 2 mol/L NaOH終止反應(yīng)。以無(wú)酶反應(yīng)為空白對(duì)照，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，同時(shí)作對(duì)硝基苯酚(p-NP)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根系組織酸性磷酸酶活性以單位時(shí)間內(nèi)單位重量鮮根水解p-NPP生成的p-NP的量來(lái)表示(mg·h-1g-1)。

1.5.2 根系分泌酸性磷酸酶活性的測(cè)定

參考Ni[18]等方法并略加改動(dòng)。取水稻幼苗2株，用去離子水沖洗干凈根系，置于含有100 mL 1 mmol/L對(duì)硝基酚磷酸二鈉(p-NPP)(pH=5.4)培養(yǎng)液的錐形瓶中，錐形瓶用黑色薄膜包裹，正常光照培養(yǎng)2 h后，吸取1 mL反應(yīng)液加入到5 mL 1 mol/L NaOH的試管中，搖勻。以無(wú)酶反應(yīng)為空白對(duì)照，450 nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)作對(duì)硝基苯酚(p-NP)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后剪取根系稱量鮮質(zhì)量，根系分泌酸性磷酸酶活性以單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量鮮根水解p-NPP生成的p-NP的量來(lái)表示(mg·h-1g-1)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分

采用Microsoft Excel 的單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對(duì)水稻葉片磷含量的影響

圖1結(jié)果表明，無(wú)論是低磷處理組還是對(duì)照組，兩供試水稻品種葉片磷含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)。低磷脅迫下，通粳981葉片磷含量隨時(shí)間的增幅要明顯小于儀2434，而且這種差異性隨著低磷脅迫處理天數(shù)的增加變得更顯著。與對(duì)照組相比，低磷脅迫下通粳981葉片磷含量較對(duì)照出現(xiàn)極顯著的下降，而儀2434磷含量較對(duì)照降幅小。這表明低磷條件下儀2434較通粳981具有更強(qiáng)的吸收利用磷素的能力，即儀2434較通粳981對(duì)低磷具有更強(qiáng)的耐性。

2.2 儀2434根系中低磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因的芯片分析

以耐低磷品種儀2434為材料的基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明，儀2434根系中對(duì)低磷脅迫的有效差異表達(dá)基因[FC (abs)≥2.0]共有3316 個(gè)，其中，誘導(dǎo)表達(dá)基因1329 個(gè)(FC≥2.0)，下調(diào)表達(dá)基因1987個(gè)(FC≤0.5)。根據(jù)基因的類型和可能功能，從誘導(dǎo)表達(dá)基因(P值≤ 0.05，同時(shí)FC≥2.0)中篩選與磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷活化與高效吸收相關(guān)的基因如表2所示。

圖1 低磷處理不同天數(shù)儀2434和通粳981葉片磷含量

Fig.1. The P content in leaves of YI 2434 and TJ 981 after low phosphorus treatment.

2.2.1 磷饑餓信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答

屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子的磷饑餓應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(PHR1)基因通過(guò)PHR1結(jié)合序列在植物磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，PHR1作為磷吸收、運(yùn)輸和磷營(yíng)養(yǎng)平衡的正調(diào)節(jié)子，受其調(diào)控表達(dá)的下游基因包括miR399s、PHO2(Phosphate2)、IPS1/At4(信號(hào)分子編碼基因)、SPXs(SPX結(jié)構(gòu)域含有蛋白)、PHT(高親和性磷載體)和PAPs(紫色酸性磷酸酶)等，且PHR1正調(diào)控miR399s、PHT1、SPXs等基因的表達(dá)[19]。

某些microRNAs參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的平衡，其中miR399在植物感知磷營(yíng)養(yǎng)缺乏中有重要作用，在維管組織(尤其是伴隨細(xì)胞和韌皮部)中，miR399的表達(dá)受到磷缺乏的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且在地上部被磷缺乏所誘導(dǎo)表達(dá)的miR399可長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)降叵虏扛抵?，調(diào)節(jié)其靶標(biāo)基因PHO2和磷載體蛋白(PTs)基因的表達(dá)和剪切加工[20]。

SPXs通過(guò)調(diào)節(jié)磷的韌皮部裝載、葉中磷的重新定位、液泡磷的進(jìn)出在植物體內(nèi)磷動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，也可通過(guò)SPX結(jié)構(gòu)域和其他蛋白發(fā)生相互作用；水稻中SPXs的表達(dá)受到磷饑餓的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，也受到磷饑餓信號(hào)途徑中PHRs和PHO2的調(diào)節(jié)[20]。

因此，磷缺乏可激活植物體內(nèi)的磷饑餓信號(hào)途徑，調(diào)控下游功能基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)根系對(duì)磷的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫顯著誘導(dǎo)儀2434根系中osa-miR399d、osa-miR399i、osa-miR399j和2個(gè)PHR1和多個(gè)SPXs基因的表達(dá)(表2)，激活儀2434根系中的磷饑餓信號(hào)途徑，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)其下游與磷吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)的功能基因表達(dá)的調(diào)控作用。

2.2.2 磷活化相關(guān)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答

酸性磷酸酶(APA)主要存在于根的表皮細(xì)胞或由根分泌到土壤中，根系分泌的酸性磷酸酶能將復(fù)雜的有機(jī)磷化合物水解為磷酸鹽，提高磷的生物有效性，在低磷條件下，磷高效型水稻材料可通過(guò)顯著提高根系A(chǔ)PA活性增強(qiáng)對(duì)磷脅迫環(huán)境的適應(yīng)性[21]；紫色酸性磷酸酶(PAPs)是金屬磷酸酯酶(MPEs)家族的一員，能催化磷酸酯或酸酐水解，釋放無(wú)機(jī)磷[22]，玉米低磷響應(yīng)基因ZmPAP18參與根外磷素的活化與吸收以及無(wú)機(jī)磷由根部向其他組織的轉(zhuǎn)運(yùn)[23]；植酸酶(PA)是一種特殊類型的酸性磷酸酶，可催化土壤或植物組織內(nèi)的植酸及其衍生物水解為磷酸鹽與肌醇，將枯草芽孢桿菌的植酸酶基因在煙草過(guò)表達(dá)，可以顯著增加根系分泌的植酸酶活性和植物體內(nèi)磷含量[24]。表2結(jié)果表明，低磷脅迫下儀2434根系中1個(gè)APA基因、6個(gè)PAP基因、2個(gè)PA基因、1個(gè)MPE基因的表達(dá)受到低磷脅迫的顯著(或極顯著)誘導(dǎo)，表明低磷脅迫增強(qiáng)儀2434根系中有機(jī)磷水解酶生物合成。

表2 低磷脅迫對(duì)儀2434根系中與磷饑餓信號(hào)、磷活化和高效吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響

Table 2. Effect of low-P stress on the expression of genes related to phosphorus starvation signals, phosphorus activation and high efficiency absorption.

功能注釋Functionannotation基因IDGeneIDLog2倍數(shù)Log2FCP值P-valuemiR399osa-miR399d3.398±0.3071.133×10-4osa-miR399i2.572±0.1738.032×10-5osa-miR399j3.184±0.1151.027×10-6磷饑餓調(diào)控蛋白Similartophosphatestarvationregulatorprotein(PHR1)Os01g02390001.953±0.7990.048磷饑餓調(diào)控蛋白Similartophosphatestarvationresponseregulator-likeproteinOs02g03256002.144±0.0804.665×10-4SPX結(jié)構(gòu)域OryzasativaSYG/PHO8/XPR1(SPX)domaingeneOs06g06036001.412±0.2719.934×10-4SPX結(jié)構(gòu)域SPXN-terminaldomaincontainingproteinOs07g06147004.475±0.2412.628×10-4Os10g03926002.218±0.2634.952×10-5Os02g02022002.374±0.2041.624×10-4磷酸鹽1SimilartoPHO1-likeproteinOs06g04936003.119±0.0472.594×10-4高親和力磷載體2Highaffinityphosphatetransporter2(OsPht2)Os03g01508001.395±0.4261.964×10-3磷載體6Oryzasativaphosphatetransporter6(OsPht6)Os08g05640006.488±0.5255.095×10-5磷載體6Similartophosphatetransporter6(OsPht6-like)Os04g01864001.297±0.1190.040紫色酸性磷酸酶Purpleacidphosphatase(PAP)Os12g05766004.514±0.4907.743×10-5紫色酸性磷酸酶Similartopurpleacidphosphatase(PAP)Os12g06371002.559±0.3426.757×10-3Os10g01168005.107±0.2196.184×10-5Os11g01517003.024±0.3763.155×10-3Os01g07766002.573±0.0779.358×10-5紫色酸性磷酸酶Purpleacidphosphatase-like(PAP-like)Os01g09418005.442±0.4491.612×10-5金屬磷酸酯酶Metallophosphoesterasedomainprotein(MPE)Os07g01060003.055±0.6032.646×10-4植酸酶SimilartoPhytase(PA)Os08g02801003.372±0.0251.659×10-5Os03g08482001.926±0.1241.610×10-5酸性磷酸酶Acidphosphatase(ClassB)(APA)Os05g01921001.353±0.0751.420×10-3磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶SimilartoPhosphoenolpyruvatecarboxylase(PEPC)Os01g07583001.791±0.8600.017Os01g01107002.147±0.6772.508×10-3C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C4-dicarboxylatetransporter/malicacidtransportprotein(C4-DT/MAT)Os01g02266002.537±1.1187.562×10-3電壓依賴陰離子通道1Voltage-dependentanionchanne1(VDAC1)Os01g05882001.276±0.2404.216×10-4協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)超家族Majorfacilitatorsuperfamilyprotein(MFS)Os06g03248004.217±1.2671.278×10-3Os08g04099004.113±0.4152.175×10-5Os08g01566003.465±0.1314.637×10-5

P-值為對(duì)生物學(xué)重復(fù)組進(jìn)行單因素方差分析的P值，P≤0.05顯著，P≤0.01極顯著；Log2FC代表處理與對(duì)照轉(zhuǎn)錄表達(dá)信號(hào)值歸一化后的差值。

P-value is the value of one-way ANOVA of biological replicates;P≤0.05 indicates significant difference andP≤0.01 indicates extremely significant difference. Log2FC stands for the difference between the control and treated group after the transcriptional data is normalized.

植物在適應(yīng)低磷脅迫時(shí)，根還會(huì)向土壤中分泌一些有機(jī)酸(檸檬酸鹽和蘋果酸等)，以溶解一些難溶的含磷化合物，以供植物的吸收和利用。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)可催化磷酸烯醇式丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，生成檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸[25]。植物根系有機(jī)酸分泌不僅涉及有機(jī)酸的合成，也涉及有機(jī)酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和經(jīng)陰離子通道向根際的分泌[26]。低磷脅迫能促使水稻根系有機(jī)酸的分泌，這在耐低磷品種中表現(xiàn)尤為明顯[9]。表2結(jié)果表明，儀2434根系中2個(gè)PEPC基因和1個(gè)電壓依賴陰離子通道1(VDAC1)基因的表達(dá)受低磷脅迫的顯著誘導(dǎo)，PEPC基因的誘導(dǎo)能促進(jìn)有機(jī)酸的合成，VDAC1基因的誘導(dǎo)可以促進(jìn)有機(jī)酸的分泌。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，儀2434根系中1個(gè)具有陰離子通道1活性的C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(C4-DT/MAT)的表達(dá)也受到低磷脅迫的顯著誘導(dǎo)，表明該基因在低磷脅迫下促進(jìn)蘋果酸、檸檬酸等的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌中也有重要作用。

綜上，作為耐低磷的水稻品種，儀2434根系在低磷脅迫下可通過(guò)基因表達(dá)的調(diào)控，增強(qiáng)有機(jī)磷水解酶和有機(jī)酸的合成和分泌，進(jìn)而促進(jìn)介質(zhì)中難溶性磷的活化。

2.2.3 磷載體相關(guān)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答

低磷脅迫誘導(dǎo)磷載體基因的表達(dá)，是植物在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下高效吸收磷素的最主要途徑。根據(jù)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位的不同，所有單子葉和雙子葉植物的磷載體基因分為四類：PHT1、PHT2、PHT3和PHT4、PHT1家族為高親和性磷載體，PHT1家族基因主要在植物根部特異性表達(dá)。在水稻中OsPT1、OsPT2、OsPT6、OsPT8屬于PHT1家族，過(guò)表達(dá)OsPT2能促進(jìn)磷素從根部到地上部分的運(yùn)輸，緩解磷缺乏癥狀，促進(jìn)磷缺乏條件下植物體內(nèi)磷的積累[27]；OsPT6在磷吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中均有重要作用[28]，OsPT6主要在根和葉中表達(dá)，在對(duì)磷缺乏的應(yīng)答中有重要作用[29]。本研究結(jié)果顯示，儀2434根系中OsPT2、OsPT6 等磷載體基因的表達(dá)受到低磷脅迫的顯著誘導(dǎo)(表2)。這表明，在低磷脅迫下的儀2434根系中能通過(guò)高親和性磷載體的上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)對(duì)低磷介質(zhì)中磷的高效吸收。

協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)超家族蛋白(MFS)是地球上兩大膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一，廣泛存在于所有生物體中，在溶質(zhì)單向轉(zhuǎn)運(yùn)、協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)、逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。MFS包含74個(gè)家族，每一個(gè)家族均與特定底物(包括離子、磷酸糖、藥物、神經(jīng)遞質(zhì)、核苷、氨基酸、多肽)的運(yùn)輸有關(guān)[30]。其中，磷載體屬于MFS超家族。本研究發(fā)現(xiàn)，儀2434根系中3個(gè)MFS基因的表達(dá)受到低磷脅迫的顯著誘導(dǎo)(表2)，至于這些MFS超家族基因的上調(diào)表達(dá)是否與磷運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)有待于更深入的研究。

2.3 水稻根系中誘導(dǎo)表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證基因芯片的檢測(cè)結(jié)果，并分析儀2434根系中誘導(dǎo)表達(dá)基因與其耐低磷特性的相關(guān)性，以耐低磷品種儀2434和低磷敏感品種通粳981為材料，從磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、紫色酸性磷酸酶、磷載體蛋白、有機(jī)酸合成和分泌相關(guān)這四類基因中選取8個(gè)代表性基因，應(yīng)用熒光定量PCR(qRT-PCR)分別檢測(cè)低磷處理5、10、15、20d后兩水稻品種根系中所選取基因的轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間的變化(圖2)。

qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，在經(jīng)低磷處理15 d的儀2434根系中供試的8個(gè)基因均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，且其上調(diào)表達(dá)倍數(shù)與基因芯片檢測(cè)結(jié)果基本一致，這表明，本研究關(guān)于基因芯片的檢測(cè)結(jié)果有極高的可靠性。

隨低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，儀2434根系中8個(gè)供試基因的表達(dá)水平均呈現(xiàn)逐步增高的趨勢(shì)；在低磷脅迫下，儀2434根系中PHR1(Os01g0239000)、SPXs(Os07g0614700)、APA(Os05g0192100)、PEPC(Os01g0758300)、MFS超家族(Os06g0324800)、OsPT6(Os08g0564000)等基因的表達(dá)水平就顯著高于對(duì)照2倍以上，表明儀2434根系中磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷活化、磷高效吸收相關(guān)基因的表達(dá)可對(duì)低磷脅迫作出快速應(yīng)答。

兩水稻品種相比，低磷脅迫下耐低磷品種儀2434根系中這8個(gè)基因的表達(dá)水平均顯著高于其在低磷敏感型品種通粳981根系中轉(zhuǎn)錄水平；不僅如此，在通粳981根系中PHR1、APA、OsPT2等基因隨低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯(相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照的2倍)，尤其是作為磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵基因的PHR1在通粳981根系中的表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯，可能致使受其正調(diào)控的下游基因未見明顯的表達(dá)上調(diào)，這可能是儀2434較通粳981對(duì)低磷脅迫有較高耐性的主要原因之一。

2.4 低磷脅迫下水稻根系酸性磷酸酶活性分析

2.4.1 低磷脅迫對(duì)水稻根系組織酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶(APA)是一種重要的水解有機(jī)態(tài)磷的誘導(dǎo)酶，其活性受到磷豐缺狀況的影響。磷饑餓能誘導(dǎo)植物體內(nèi)合成的和根系分泌的APA活性的增強(qiáng)[31-32]。圖3結(jié)果表明，兩個(gè)水稻品種在低磷脅迫下其根系組織APA活性均高于對(duì)照組，低磷敏感型水稻品種通粳981根系中APA活性較對(duì)照的增幅較小，而耐低磷型水稻儀2434受低磷脅迫后其根系酸性磷酸酶活性不僅極顯著高于對(duì)照，且其增幅明顯高于通粳981。APA活性的增高有利于根系中有機(jī)磷化合物的水解，提高植物體內(nèi)有機(jī)磷的重復(fù)利用率。這可能是儀2434具有較強(qiáng)耐低磷脅迫能力的原因之一。

A, B, C, D, E, F, G, H 分別表示PHR1 (Os01g0239000)、SPXs(Os07g0614700)、PAPs(Os10g0116800)、APA(Os05g0192100)、PEPC(Os01g0758300)、MFSs(Os06g0324800)、OsPT2 (Os03g0150800)、OsPT6 (Os08g0564000)基因。*、**分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

A, B, C, D, E, F, G, H represent the genes ofPHR1 (Os01g0239000)，SPXs(Os07g0614700)，PAPs(Os10g0116800)，APA(Os05g0192100)，PEPC(Os01g0758300)，MFSs(Os06g0324800)，OsPT2 (Os03g0150800)，OsPT6 (Os08g0564000)， respectively.*,**represent significant difference atP< 0.05 andP< 0.01， respectively.

圖2 儀2434(YI2434)和通粳981(TJ981)根系中與磷饑餓信號(hào)、磷活化和高效吸收相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間變化的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

Fig. 2. Transcription level of phosphorus starvation signals, phosphorus activation and high efficiency absorption related gene changes with low-P treated time in YI2434 and TJ981 roots by qRT-PCR.

*、**分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

*,**show significant difference atP< 0.05 andP< 0.01， respectively.

圖3 低磷脅迫15 d儀2434和通粳981根系酸性磷酸酶活性。

Fig. 3. The acid phosphatase activity in YI2434 and TJ981 at 15 days after low-P treatment.

2.4.2 低磷脅迫對(duì)水稻根系分泌酸性磷酸酶活性的影響

水稻根系分泌APA能夠活化介質(zhì)中的有機(jī)磷供其吸收利用，對(duì)于提高磷素的利用效率具有重要的作用。圖4結(jié)果表明，低磷脅迫能極顯著提高兩供試品種水稻根系分泌APA的活性，且低磷脅迫下耐低磷水稻儀2434根系所分泌APA活性較對(duì)照增高的程度明顯高于通粳981，這說(shuō)明儀2434可能通過(guò)高效活化介質(zhì)中難溶態(tài)有機(jī)磷來(lái)提高對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)能力。

3 討論

在低磷脅迫15d時(shí)，與通粳981相比，儀2434葉片磷含量降低幅度較小，表明儀2434根系能高效吸收低磷介質(zhì)中的磷素，表現(xiàn)出對(duì)低磷脅迫較高的耐性?；蛐酒臋z測(cè)結(jié)果顯示，在經(jīng)低磷處理15 d的儀2434根系中，PHR1、osa-miR399d、osa-miR399i、osa-miR399j和SPXs基因的誘導(dǎo)表達(dá)，激活了磷饑餓信號(hào)途徑，從而上調(diào)與磷活化(APA、PAPs、MPE、PA、PEPC、ADAC1和C4-DT/MAT等)、吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)(OsPT2、OsPT6)相關(guān)的下游功能基因的表達(dá)。這些基因的上調(diào)表達(dá)可以加快有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的活化，促進(jìn)根系對(duì)低磷介質(zhì)中磷的高效吸收利用。qRT-PCR試驗(yàn)中，供試的8個(gè)基因上調(diào)倍數(shù)與基因芯片檢測(cè)結(jié)果基本一致，表明基因芯片的檢測(cè)結(jié)果是可靠的。隨低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，儀2434根系中供試的8個(gè)基因表達(dá)水平均呈現(xiàn)逐步增高的趨勢(shì)，表明儀2434根系中磷饑餓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷活化、磷高效吸收利用相關(guān)基因的表達(dá)可對(duì)低磷脅迫作出快速應(yīng)答。兩個(gè)水稻品種相比，儀2434根系中8個(gè)供試基因在低磷脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于通粳981，PHR1、APA、OsPT2在通粳981根系中的表達(dá)誘導(dǎo)作用不明顯，且儀2434根系中酸性磷酸酶的活性也顯著高于通粳981，這表明低磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因可調(diào)控相應(yīng)蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)根際環(huán)境和植株體內(nèi)有機(jī)磷的水解，增強(qiáng)了儀2434根系對(duì)磷的高效吸收利用。綜上，磷饑餓信號(hào)途徑、磷活化、吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，活化了體內(nèi)外磷素，提高了機(jī)體內(nèi)磷的供應(yīng)水平。這可能是儀2434耐低磷的重要機(jī)制之一。

*、**分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

*,**shows significant difference atP< 0.05 andP< 0.01，respectively.

圖4 低磷脅迫15 d儀2434和通粳981根系分泌酸性磷酸酶活性

Fig. 4. Acid phosphatase activity secreted by roots in YI2434 and TJ981 at 15 days after low-P treatment.

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Response of Gene Expression Related to Efficient Phosphorus Absorption and Utilization to Low-P Stress in Rice Roots

HU Xun-xia1, SHI Chun-yang1, DING Yan1, ZHANG Ping1, GE Yong-sheng1, LIU Yu-jin2,*,WANG Ze-gang1, GE Cai-lin1,*

(1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009,China；2Jiangsu Runyang Seed Limited Company, Yizheng 211400, China；*Corresponding author, E-mail：clge@yzu.edu.cn; yzlyjseed@163.com)

It is important to elucidate the mechanism of low phosphorus tolerance in rice for the improvement of utilization efficiency of soil phosphorus. With two different rice varieties, low-P tolerant variety Yi 2434 and low-P sensitive variety Tongjing 981, the gene expression related to phosphorus absorption and utilization in rice seedling roots were determined by using gene chip and qRT-PCR technology. The phosphorus content showed that compared with the control group, the phosphorus content in the leaves of Yi 2434 decreased by a less percentage than that in Tongjing 981 under low-P stress, indicating that Yi 2434 had a high efficiency in phosphorus absorption from low phosphorus medium compared with Tongjing 981. The gene chip results showed that the expressions ofPHR1,osa-miR399sandSPXstriggered the phosphorus starvation signal pathway, and the induced gene expressions ofAPA,PAPs,MPE,PA,PEPCandVDAC1,C4-DT/MATenhanced the synthesis and secretion of organophosphorus hydrolase and organic acid, promoted the reactivation of insoluble phosphorus in media, and the induced gene expressions ofOsPT2 andOsPT6 accelerated the absorption of phosphorus in Yi 2434 roots under low-P stress. qRT-PCR results showed that the transcriptional levels of the eight key genes(PHR1,SPX,PAP,APA,PEPC,MFS,OsPT2,OsPT6 ) related to phosphorus starvation signal transduction, phosphorus activation and efficient absorption were continuously increased along with the low-P treatment in Yi 2434 roots. Furthermore, the transcriptional levels of these eight genes in Yi 2434 roots were significantly higher than those in Tongjing 981 roots under the low-P stress and the induced expression ofPHR1,APA,OsPT2 genes in Tongjing 981 roots was very low under low-P stress. Additionally, the activities of both acid phosphatase (APA) in the tissues of roots and secreted by roots in Yi 2434 increased more significantly than that in Tongjing 981, which is possibly one of the key pathway to confer Yi 2434 higher tolerance to the low-P stress than Tongjing 981.

rice; low phosphorus stress; gene expression; phosphorus activation; efficient phosphorus absorption

2016-02-02； 修改稿收到日期: 2016-04-28。

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201103007)。

S143.2; S511.01

A

1001-7216(2016)06-0567-10

胡訓(xùn)霞， 史春陽(yáng)，丁艷， 等. 水稻根系中磷高效吸收和利用相關(guān)基因表達(dá)對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(6)： 567-576.