陳龍飛 萬品俊 王渭霞，* 傅強(qiáng) 朱廷恒，*

(1浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院， 杭州310014； 2中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310006；*通訊聯(lián)系人， E-mail: weixwang74@126.com；thzhu@zjut.edu.cn)

?

褐飛虱NlTgo基因的克隆及功能研究

陳龍飛1萬品俊2王渭霞2，*傅強(qiáng)2朱廷恒1，*

(1浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院， 杭州310014；2中國(guó)水稻研究所 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 杭州 310006；*通訊聯(lián)系人， E-mail: weixwang74@126.com；thzhu@zjut.edu.cn)

CHEN Longfei, WAN Pinjun, WANG Weixia,et al. Molecular cloning and functional analysis ofNlTgoin the rice brown planthopper,Nilaparvatalugens(Hemiptera: Delphacidae). Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 653-660.

轉(zhuǎn)錄因子Tango(Tgo)在昆蟲神經(jīng)元發(fā)生、血細(xì)胞生成、性別決定、腸道發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用?？寺×撕诛w虱Tango基因(NlTgo)，應(yīng)用熒光定量PCR和RNAi探索了NlTgo在褐飛虱中的表達(dá)動(dòng)態(tài)和生物學(xué)功能。結(jié)果表明，NlTgo的開放閱讀框?yàn)?007 bp，推測(cè)編碼669個(gè)氨基酸殘基。多序列比對(duì)表明NlTgo與已知的Tgo高度同源，其中與人體虱(Pediculushumanuscorporis) Tgo的一致性達(dá)68%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，NlTgo與豌豆長(zhǎng)管蚜(Acyrthosiphonpisum)、始紅蝽(Pyrrhocorisapterus)和臭蟲(Cimexlectularius)的Tgo在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成一個(gè)類群。時(shí)空表達(dá)譜表明NlTgo在褐飛虱1齡、2齡時(shí)期高表達(dá)，在卵期表達(dá)量較低；在卵巢中表達(dá)量最高，在體壁的表達(dá)量較低。RNAi結(jié)果表明，注射dsNlTgo后4 d，NlTgo的表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著降低了77%，并導(dǎo)致若蟲不能正常蛻皮而死亡。其中，處理5 d后褐飛虱的存活率僅為23%，顯著低于注射dsGFP的對(duì)照組(98%)。結(jié)果顯示，NlTgo與褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，可作為防治褐飛虱的潛在靶標(biāo)。

褐飛虱； Tango； RNA干涉； 蛻皮； 害蟲防治

Tango屬于堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic/helix-loop-helix, bHLH)家族中bHLH-PAS亞家族蛋白，其廣泛存在于黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)等真核生物中[1]。Tango包含一個(gè)典型的bHLH功能域和兩個(gè)PAS功能域，其中bHLH功能域由大約60個(gè)氨基酸殘基組成[2]。bHLH功能域進(jìn)一步劃分為堿性區(qū)(basic region, BR)和α螺旋-環(huán)-α螺旋區(qū)(helix-loop-helix, HLH)，其中堿性區(qū)與DNA結(jié)合，HLH則促進(jìn)不同bHLH蛋白之間形成同源二聚體或異源二聚體[3]。Tango及其所屬的bHLH蛋白在進(jìn)化過程中功能較為保守，黑腹果蠅Tango與其哺乳動(dòng)物中同源物Arnt均與其他bHLH-PAS蛋白形成二聚體[4]，參與神經(jīng)元發(fā)生、肌細(xì)胞生成、血細(xì)胞生成、細(xì)胞分化和增殖、性別決定、環(huán)境毒素影響等一系列發(fā)育過程[5, 6]。其中，PAS亞家族主要參與中線與氣管的發(fā)育、晝夜節(jié)律、毒素降解等生理過程[7]。在黑腹果蠅中，Tango與Sim、Sima或Trh等bHLH蛋白形成二聚體，然后通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)中線元件(CNS midline element, CME)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。

褐飛虱[Nilaparvatalugens(St?l)]屬半翅目飛虱科，通過取食水稻韌皮部汁液和傳播水稻病毒侵害水稻[9, 10]。在中國(guó)，褐飛虱每年可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10～15萬t，間接造成數(shù)十億元的經(jīng)濟(jì)損失[11]。褐飛虱適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖量大。近年來以調(diào)控褐飛虱變態(tài)發(fā)育基因?yàn)榘袠?biāo)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)控制褐飛虱的發(fā)生成為可能[12, 13]。由此可見，克隆褐飛虱重要功能基因，明確其生物學(xué)功能，對(duì)褐飛虱的防治具有重要的指導(dǎo)意義[14]。

Tango等bHLH-PAS家族成員作為調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)中線和氣管發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在黑腹果蠅等昆蟲中的研究已取得了一系列的成果[15]，而在褐飛虱中尚未見相關(guān)研究。此外，近年來，以調(diào)控褐飛虱變態(tài)發(fā)育的基因?yàn)榘袠?biāo)，借助于RNA干擾手段成為害蟲控制的一種有效防控策略。因此，迫切需要發(fā)掘更多有效的靶標(biāo)基因。本研究克隆了褐飛虱Tango基因，分析了其結(jié)構(gòu)域特征及進(jìn)化關(guān)系，明確了其在褐飛虱中的時(shí)空表達(dá)動(dòng)態(tài)，并通過RNAi技術(shù)研究其在褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用，以期為褐飛虱的防治提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為中國(guó)水稻研究所培育的褐飛虱TN1種群，在水稻TN1上連續(xù)飼養(yǎng)170代以上。飼養(yǎng)濕度為(27±1)℃，相對(duì)濕度為80%～85%，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗。

1.2 總RNA的提取及第1鏈cDNA的合成

收集褐飛虱卵、1～5齡若蟲和短翅型雌雄蟲(初羽化后48 h內(nèi))，各個(gè)處理樣本量(卵質(zhì)量或蟲質(zhì)量)8 mg。此外，選取初羽化(48 h內(nèi))的短翅型雌成蟲，在解剖鏡下分離體壁、頭、卵巢、脂肪體、中腸和足等組織或器官(各組織或器官鮮質(zhì)量約2 mg)。以上樣品置于1.5 mL的Eppendorf管中經(jīng)液氮冷凍后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。參照總RNA分離試劑盒(Total RNA Isolation Kit，Invitrogen, USA)說明書，用Trizol法提取總RNA。取1 μg總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，日本Toyobo) 說明書合成第1鏈cDNA。合成的cDNA貯存于-20℃冰箱中備用。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 褐飛虱NlTgo的克隆

檢索褐飛虱基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，得到一條編碼Tgo的單拷貝基因NlTgo。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)，利用PCR進(jìn)行克隆驗(yàn)證，擴(kuò)增體系共25 μL，包括rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.125 μL，10×緩沖液 2.5 μL，dNTP( 2.5 mmol/L) 2.0 μL，引物(10 μmol /L)各1 μL，cDNA模板1 μL，雙蒸水17.375 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接于TOPO2.1載體(Invitrogen)上，轉(zhuǎn)化至DH5α的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選4個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA在ABI3730測(cè)序儀上進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 序列分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用Lasergene軟件推導(dǎo)目的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，根據(jù)NCBI的CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析其保守結(jié)構(gòu)域。利用ClustalW軟件[16]進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-Joining法)，自展(bootstrap)值為1000[17]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

以提取的各樣本的總RNA為模板，合成cDNA后用于qRT-PCR。反應(yīng)體系如下：熒光定量PCR檢測(cè)試劑(SYBR Green Real time PCR Master Mix， TOYOBO, Japan) 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)(表1)各0.6 μL，cDNA模板2 μL，雙蒸水6.8 μL。 qRT-PCR采用兩步法：94℃下預(yù)變性1 min；94℃下變性15 s，58℃下退火40 s，40次循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)[18]。以褐飛虱核糖體蛋白S18基因(rps18)作為內(nèi)參基因[19]，3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 dsRNA合成和生物測(cè)定

根據(jù)目的基因核苷酸序列設(shè)計(jì)合成雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)的引物(表1)。參考雙鏈RNA合成試劑盒(MEGA script RNAi，Ambion, Austin, TX) 說明書完成dsRNA的體外轉(zhuǎn)錄。分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 (Thermo) 檢測(cè)dsRNA的完整性和濃度。

表1 RT-PCR、qPCR和dsRNA合成引物

Table 1． Primers used for RT-PCR, qPCR and dsRNA synthesis.

引物名稱Primername正向引物(5'-3')Forwardsequence(5'-3')反向引物(5'-3')Reversesequence(5'-3')基因克隆Genecloning NlTgoGGCTGTTGCGCATATGAAGGATGTCGGACAACTCCTGCTG雙鏈RNA合成dsRNAsynthesis dsNlTgoT7-ACCGACGAGGTCGAGTACATT7-GTGTGTAGGTGGGTGACCTG dsGFPT7-AGATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTT7-AGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA定量PCRqPCR qNlTgoGGAGGAGGATGGTTCACACTGGTCCACAAACGTGAACTTG qNl18sCGCTACTACCGATTGAAGGAAACCTTGTTACGACTT

dsRNA的注射參考Wang等[20-21]的方法。選取4齡若蟲作為試蟲(約120頭)，在其胸部節(jié)間膜注射50 ng(約0.06 μL)的dsNlTai或dsGFP(對(duì)照組)。注射后的試蟲飼養(yǎng)于TN1水稻苗上，第2天移除死蟲(死亡率僅為1.67%)，并將剩下的活蟲分4個(gè)重復(fù)轉(zhuǎn)移到新的水稻苗上，逐日觀察試蟲的存活數(shù)、若蟲表型等發(fā)育情況。此外，根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)室注射經(jīng)驗(yàn)，在注射后第4天，每個(gè)處理組中選取20頭試蟲用于總RNA提取，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭若蟲，采用1.5中的qPCR測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)

本研究數(shù)據(jù)分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Data Processing System)[22]軟件，單因素方差分析(One-way ANOVA)采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性差異分析，文中所用數(shù)據(jù)皆為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并用不同的小寫字母代表不同組之間存在顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NlTgo的克隆及序列分析

通過RT-PCR克隆得到褐飛虱Tango基因，并將其命名為NlTgo。NlTgo的ORF為2007 bp，推測(cè)編碼668個(gè)氨基酸。NlTgo含有1個(gè)bHLH保守域和2個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域(圖1)。多序列比對(duì)表明NlTgo與人體虱(Pediculushumanuscorporis)Tgo的一致性最高，達(dá)68%；其次是赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)，達(dá)67%；最低是熱帶切葉蟻(Attacephalotes)，為58%。采用MEGA6.0軟件選取來自其他14個(gè)物種中的Tgo序列與褐飛虱中Tgo構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)果顯示，褐飛虱屬單獨(dú)一支，與豌豆長(zhǎng)管蚜(Acyrthosiphonpisum)、始紅蝽(Pyrrhocorisapterus)、臭蟲(Cimexlectularius)進(jìn)化關(guān)系較近。

2.2 NlTgo的時(shí)空表達(dá)模式

qPCR結(jié)果表明，NlTgo在褐飛虱發(fā)育的各階段均表達(dá)，并呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)性。其中，NlTgo在褐飛虱1齡、2齡表達(dá)較高，在3～5齡和成蟲期的表達(dá)量次之，在卵期表達(dá)量最低(圖3)。組織或器官表達(dá)譜表明NlTgo在褐飛虱卵巢中的表達(dá)量最高，在中腸、足、頭中的表達(dá)量次之，在脂肪體、體壁中表達(dá)量最低(圖4)。

2.3 dsNlTgo對(duì)褐飛虱目的基因及其生物學(xué)的影響

注射dsNlTgo后4 d，同對(duì)照組相比，處理組中試蟲的NlTgo表達(dá)量顯著下降了77%，且兩組間存在極顯著差異，表明dsNlTgo使NlTgo的表達(dá)量下降(圖5-A)。

與對(duì)照組相比，注射dsNlTgo后3 d，10%的褐飛虱死亡。此外，注射后4、5 d，處理組分別有40%、77%的若蟲死亡，存活率分別為60%、23%，均顯著低于對(duì)照組(分別為98%、98%)(P<0.05)(圖5-B)。注射后，若蟲發(fā)育至成蟲的歷期(2.8 d)與對(duì)照組(3.0 d)無顯著差異(P>0.05)。

注射dsNlTgo后5 d，若蟲在進(jìn)入5齡時(shí)發(fā)育受阻，中胸背板處舊表皮可以裂開但不能完全蛻去，依然粘附在蟲體體表，不能完全蛻下而死亡(死亡若蟲中98%表現(xiàn)蛻皮不正常)，而對(duì)照組則正常進(jìn)入5齡，可見蛻下的舊表皮(圖6)。

昆蟲名稱及Tango的GenBank登錄號(hào)：Ph-人體虱(XP_002430960.1)； Cl-溫帶臭蟲(XP_014259945.1)； Cm-四紋豆象(AFL70632.1)； Ld-馬鈴薯甲蟲(AKG92750.1)； Pa-始紅蝽(AGI17574.1)； Tc-赤擬谷盜(XP_008190739.1)； Ac-豌豆長(zhǎng)管蚜(XP_008180102.1)。

Insect species and GenBank accession numbers of Tango: Ph,Pediculushumanuscorporis(XP_002430960.1); Cl,Cimexlectularius(XP_014259945.1); Cm,Callosobruchusmaculatus(AFL70632.1); Ld,Leptinotarsadecemlineata(AKG92750.1); Pa,Pyrrhocorisapterus(AGI17574.1); Tc,Triboliumcastaneum(TC004710); Ac,Acyrthosiphonpisum(XP_008180102.1).

圖1 褐飛虱與其他物種Tgo氨基酸序列比對(duì)

Fig. 1. Alignment of amino acid residues of Tgo in Nilaparvata lugens and other insects.

昆蟲名稱及Tango的GenBank登錄號(hào)：Ph-人體虱(XP_002430960.1)； Cl-溫帶臭蟲(XP_014259945.1)； Cm-四紋豆象(AFL70632.1)； Ld-馬鈴薯甲蟲(AKG92750.1)； Pa-始紅蝽(AGI17574.1)； Tc-赤擬谷盜(XP_008190739.1)； Ac-豌豆長(zhǎng)管蚜(XP_008180102.1)； Dm-果蠅(FBgn0264075)； Nv-蠅蛹金小蜂(Nasvi2EG004242)； Bm-家蠶(BGIBMGA003472)； Hs-印度跳蟻(HSAL22140)； Ag-岡比亞按蚊(AGAP009748)； Am-西方蜜蜂(GB44259)； Aa-埃及伊蚊(AAEL010343)。

Insect species and GenBank accession numbers of Tango: Ph,Pediculushumanuscorporis(XP_002430960.1); Cl,Cimexlectularius(XP_014259945.1); Cm,Callosobruchusmaculatus(AFL70632.1); Ld,Leptinotarsadecemlineata(AKG92750.1); Pa,Pyrrhocorisapterus(AGI17574.1); Tc,Triboliumcastaneum(TC004710); Ac,Acyrthosiphonpisum(XP_008180102.1); Dm,Drosophilamelanogaster(FBgn0264075); Nv,Nasoniavitripennis(Nasvi2EG004242); Bm,Bombyxmori(BGIBMGA003472); Hs,Harpegnathossaltator(HSAL22140); Ag,Anophelesgambiae(AGAP009748); Am,Apismellifera(GB44259); Aa,Aedesaegypti(AAEL010343).

圖2 褐飛虱與其他昆蟲的Tango的進(jìn)化樹

Fig. 2. Phylogenetic relationship of Nilaparvata lugens Tgo and insect homologues.

樣本量n=3。不同小寫字母代表不同組之間存在顯著差異(P<0.05)。

Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level between different groups.n=3

圖3 褐飛虱不同發(fā)育階段NlTgo的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 3. Relative expression level of NlTgo in different development stages of Nilaparvata lugens.

樣本量n=3。不同小寫字母代表不同組之間存在顯著差異(P<0.05)。

Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level between different groups.n=3.

圖4 褐飛虱不同組織間NlTgo的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 4. Relative expression level of NlTgo in different tissues of Nilaparvata lugens.

樣本量(n=3)。不同小寫字母代表不同組之間存在顯著差異(P<0.05)。

n=3. Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level between different groups.

圖5 注射dsRNA后第4天NlTgo相對(duì)表達(dá)量的變化(A)和干擾NlTgo后對(duì)褐飛虱存活率的影響(B)

Fig. 5. Relative expression level of NlTgo at 4thday injection with dsRNA(A) and survival rate of Nilaparvata lugens after injection dsRNA of NlTgo(B).

紅色箭頭表示背板裂開的邊緣。

Red arrow shows the edges of the split notum.

圖6 干擾NlTgo后褐飛虱表型變化

Fig. 6. Phenotypic types of Nilaparvata lugens nymph after injection with dsNlTgo.

3 討論

本研究克隆的褐飛虱NlTgo屬于典型的bHLH-PAS亞家族[23]，其包含1個(gè)bHLH保守結(jié)構(gòu)域和2個(gè)PAS保守結(jié)構(gòu)域，其中PAS結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與其他PAS家族成員(如Sim和Trh)的結(jié)合，形成的二聚體共同調(diào)控生物體內(nèi)一系列的生命活動(dòng)[15]。NlTgo與已知的Tgo高度同源，表明Tgo在物種進(jìn)化過程中高度保守，預(yù)示其可能有相同的功能，與Probst等[24]的研究結(jié)果相似。從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系來看，褐飛虱Tgo與始紅蝽Tgo和臭蟲Tgo進(jìn)化關(guān)系較近。由此可見，本研究克隆的NlTgo所編碼的bHLH和PAS保守結(jié)構(gòu)域，可能作為功能蛋白參與二聚體形成等過程。

NlTgo在褐飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。NlTgo在褐飛虱各發(fā)育階段和各組織或器官中的表達(dá)模式表明，NlTgo在褐飛虱的各個(gè)生長(zhǎng)階段均表達(dá)，其中在第1、2齡表達(dá)量最高，在卵、第3～5齡和成蟲中表達(dá)較低，且呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)性，表明該基因的表達(dá)可能與褐飛虱的發(fā)育相關(guān)。此外，NlTgo在褐飛虱的各個(gè)組織或器官中均表達(dá)，其中NlTgo在卵巢的表達(dá)量最高，在中腸、足、頭、脂肪體、體壁等組織中表達(dá)量較低，這表明NlTgo也可能與雌蟲的產(chǎn)卵有關(guān)。

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后水平的沉默機(jī)制，是通過內(nèi)源或外源性雙鏈RNA(double-strands RNA，dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因沉默，繼而引起相應(yīng)的功能缺失的現(xiàn)象[25]。Subba發(fā)現(xiàn)在赤擬谷盜中沉默Tango會(huì)導(dǎo)致顯著的致死效應(yīng)，赤擬谷盜幼蟲在沉默后3 d開始有死蟲出現(xiàn)，并在7 d后全部死亡。這些死蟲體型變小，胸部褶皺，并變成深褐色[26]。在褐飛虱中，我們通過統(tǒng)計(jì)注射dsNlTgo后存活率、表型及轉(zhuǎn)錄水平的定量驗(yàn)證分析表明，NlTgo可以在褐飛虱中通過注射dsRNA的方法有效沉默。該基因沉默后5 d褐飛虱的存活率僅為23%，顯著低于對(duì)照組98%的存活率。顯微鏡下觀察死亡褐飛虱發(fā)現(xiàn)，注射dsNlTgo的若蟲98%的褐飛虱表現(xiàn)為舊表皮裂開但不能完整的蛻下，并死亡。保幼激素、蛻皮激素、胰島素等信號(hào)通路互相協(xié)調(diào)共同調(diào)控昆蟲的變態(tài)發(fā)育，這些信號(hào)通路的紊亂會(huì)不同程度造成昆蟲發(fā)育的受阻，我們推測(cè)NlTgo作為轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控這些信號(hào)通路中某一基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響褐飛虱的蛻皮發(fā)育。先前的研究表明，在果蠅中，Tango與一些組織特異性bHLH-PAS蛋白結(jié)合，隨后通過CME位點(diǎn)調(diào)控靶基因的表達(dá)[27]并參與毒素代謝過程[28]。此外，Trh/Tgo bHLH-PAS蛋白還共同參與果蠅和人的后腸的發(fā)育[29]。

本研究初步表明NlTgo基因與褐飛虱的蛻皮過程相關(guān)。該基因在褐飛虱中的作用尚屬首次報(bào)道，且在褐飛虱體內(nèi)本身的作用機(jī)制還不是很明確，因此，對(duì)褐飛虱NlTgo可能參與的通路與調(diào)控機(jī)制的深入研究將有助于篩選新的靶標(biāo)來防治褐飛虱。

[1] Atchley W R, Fitch W M. A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors.ProcNatlAcadSciUSA, 1997, 94(10): 5172-5176.

[2] Massari M E, Murre C. Helix-loop-helix proteins: Regulators of transcription in eucaryotic organisms.MolCellBiol, 2000, 20(2): 429-440.

[3] Kadesch T. Consequences of heteromeric interactions among helix-loop-helix proteins.CellGrowthDiffer, 1993, 4(1): 49-55.

[4] Reyes H, Reisz-Porszasz S, Hankinson O. Identification of the Ah receptor nuclear translocator protein (Arnt) as a component of the DNA binding form of the Ah receptor.Science, 1992, 256(5060): 1193-1195.

[5] Jan Y N, Jan L Y. HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis.Cell, 1993, 75(5): 827-830.

[6] Weintraub H. The MyoD family and myogenesis: Redundancy, networks, and thresholds.Cell, 1993, 75(7): 1241-1244.

[7] Crews S. Control of cell lineage-specific development and transcription by bHLH-PAS proteins.Genes&Dev, 1998, 12(5): 607-620.

[8] Sonnenfeld M, Ward M, Nystrom G, et al. The Drosophila tango gene encodes a bHLH-PAS protein that is orthologous to mammalian Arnt and controls CNS midline and tracheal development.Development, 1997, 124(22): 4571-4582.

[9] Ghaffar M B, Pritchard J, Ford-Lloyd B. Brown planthopper (N.lugensSt?l) feeding behaviour on rice germplasm as an indicator of resistance.PLoSOne, 2011, 6(7): e22137.

[10]李進(jìn)波, 萬丙良, 夏明元, 等. 抗褐飛虱水稻品種的培育及其抗性表現(xiàn). 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2011, 48(5): 1348-1353.

Li J B, Wan B L, Xia M Y, et al. Breeding of the brown planthopper resistant rice varieties.ChinBullEntomol, 2011, 48(5): 1348-1353. (in Chinese with English abstract)

[11]Cheng X, Zhu L, He G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper.MolPlant, 2013, 6(3): 621-634.

[12]Yu R, Xu X, Liang Y, et al. The insect ecdysone receptor is a good potential target for RNAi-based pest control.IntJBiolSci, 2014, 10(10): 1171-1180.

[13]Li K L, Wan P J, Wang W X, et al. Ran involved in the development and reproduction is a potential target for RNA-interference-based pest management inNilaparvatalugens.PlosOne, 2015, 10(11): e0142142.

[14]王彥華, 王鳴華. 近年來我國(guó)水稻褐飛虱暴發(fā)原因及治理對(duì)策. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2007, 25(2): 49-54.

Wang Y H, Wang M H. Factors affecting the outbreak and management tactics of brownplanthopper in China recent years.PestSci&Admin, 2007, 25(2): 49-54. (in Chinese)

[15]Long S K, Fulkerson E, Breese R, et al. A comparison of midline and tracheal gene regulation during drosophila development.PLoSOne, 2014, 9(1): e85518.

[16]Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0.Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947-2948.

[17]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.MolBiolEvol, 2011, 28(10): 2731-2739.

[18]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.RNA, 2001, 9(3): 299-308.

[19]Yuan M , Lu Y , Zhu X, et al. Selection and evaluation of potential reference genes for gene expression analysis in the brown planthopper,Nilaparvatalugens(Hemiptera: Delphacidae) using reverse-transcription quantitative PCR.PLoSOne, 2014, 9(1): e86503.

[20]Wang W X, Li K L, Chen Y, et al. Identification and function analysis of enolase geneNlEno1 fromNilaparvatalugens(Stal) (Hemiptera:Delphacidae).JInsectSci, 2015, 15(1): 66.

[21]Li K L, Wan P J, Wang W X, et al. Ran involved in the development and reproduction is a potential target for RNA-interference-based pest management inNilaparvatalugens.PLoSOne, 2015, 10(11): e0142142.

[22]Tang Q Y, Zhang C X. Data Processing System (DPS) software with experimental design, statistical analysis and data mining developed for use in entomological research.InsectSci, 2013, 20(2): 254-260.

[23] Peyrefitte S, Kahn D, Haenlin M. New members of the Drosophila Myc transcription factor subfamily revealed by a genome-wide examination for basic helix-loop-helix genes.MechDev, 2001, 104(1/2): 99-104.

[24]Probst M R, Fan C M, Tessier-Lavigne M. Two murine homologs of the Drosophila single-minded protein that interact with the mouse aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein.JBiolChem, 1997, 272(7): 4451-4457.

[25]Fire A, Xu S, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditiselegans.Nature, 1998, 391(6669): 806-811.

[26]Bitra K, Tan A, Dowling A, et al. Functional characterization of PAS and HES family bHLH transcription factors during the metamorphosis of the red flour beetle,Triboliumcastaneum.Gene, 2009, 448(1): 74-87.

[27]Ohshiro T, Saigo K. Transcriptional regulation of breathless FGF receptor gene by binding of TRACHEALESS/dARNT heterodimers to three central midline elements in Drosophila developing trachea.Development, 1997, 124(20): 3975-3986.

[28]Crews S T, Fan C M. Remembrance of things PAS: regulation of development by bHLH-PAS proteins.CurrOpinGenetDev, 1999, 9(5): 580-587.

[29]Choi Y J, Kwon E J, Park J S, et al. Transcriptional regulation of theDrosophilacaudalhomeobox gene by bHLH-PAS proteins.BiochimBiophysActa, 2007, 1769(1): 41-48.

Molecular Cloning and Functional Analysis ofNlTgoin the Rice Brown Planthopper,Nilaparvatalugens(Hemiptera: Delphacidae)

CHEN Long-fei1, WAN Pin-jun2, WANG Wei-xia2,*, FU Qiang2, ZHU Ting-heng1,*

(1College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;2China Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;*Corresponding author, E-mail: thzhu@zjut.edu.cn)

Transcriptional regulator Tango (Tgo) plays crucial roles in insect development, including neurogenesis, hematopoiesis, sex determination and gut development. In this study, a full-length cDNA ofTangowas cloned inNilaparvatalugens. qRT-PCR and RNA interference (RNAi) were further used to analyze the expression pattern and function role, respectively. Our results showed thatNlTgocontained a 2007-bp open reading frame (ORF), encoding 669 amino acid residues. Sequence alignment showed that NlTgo shared an identity of 68% withPediculushumanus. Phylogenetic analysis suggested that NlTgo was closely related to the Tango proteins fromAcyrthosiphonpisum,PyrrhocorisapterusandCimexlectularius. Expression profile revealed thatNlTgoexpression was higher in the first- and second-instar larvae than that in eggs. Furthermore, the expression level ofNlTgowas higher in ovary than that in integument. Knocking down ofNlTgo, in the 4th-instar nymph, was performed by double-stranded RNA (dsRNA) targetingNlTgo. It was found that the expression level ofNlTgo, 4 days after injection, was significantly decreased by 77%, compared with control. Furthermore, nymphs died due to the abnormal molting, and the survival rate was only 23%, significantly lower than control group (98%). The results suggest thatNlTgois involved in the development ofN.lugensand can serve as a potential target for controlling the brown planthopper.

Nilaparvatalugens; Tango; RNAi; molting; pest control

2016-03-01； 修改稿收到日期: 2016-04-21。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-1-18)； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201512)。

Q785; S435.112+.3

A

1001-7216(2016)06-0653-08

陳龍飛, 萬品俊, 王渭霞, 等. 褐飛虱NlTgo基因的克隆及功能研究. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(6)： 653-660.