曠 慧，李亮亮，呂長山，王金玲,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

RP-HPLC法測定東北地區(qū)6 種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸組成

曠 慧1，李亮亮1，呂長山2，王金玲1,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

建立一種反相高效液相色譜法分離和測定6 種紅樹莓果實(shí)中草酸、酒石酸、檸檬酸、DL-蘋果酸和乳酸5 種有機(jī)酸的方法。色譜條件為：采用SinoChrom DS-BP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L KH2PO4溶液（pH 2.60，97∶3，V/V），流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm。結(jié)果表明：在此條件下5 種有機(jī)酸都被有效地分離，各種有機(jī)酸的質(zhì)量濃度與峰面積在測定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在0.999 3～0.999 9之間；精密度實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.20%～1.53%（n=5）范圍內(nèi)；回收率為98.83%～105.42%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%～1.00%。測得6 種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸以檸檬酸為主，含量為1 058.41～1 825.45 mg/100 g，草酸、乳酸、DL-蘋果酸含量較低，未檢測到酒石酸。該方法簡單、高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸的分離測定。

紅樹莓；有機(jī)酸；反相高效液相色譜法

樹莓（Rubus ideaus L.）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus spp.）植物。紅樹莓果實(shí)酸甜可口，富含有機(jī)酸[1]。有機(jī)酸是存在于果蔬中的一類天然化合物，是影響果蔬風(fēng)味的一種主要物質(zhì)，有機(jī)酸種類及含量決定其口感與品質(zhì)[2]。有機(jī)酸還能刺激體內(nèi)消化液的分泌，促進(jìn)食物的消化，是維持人體酸堿平衡的重要物質(zhì)[3]。目前國內(nèi)外對紅樹莓有機(jī)酸分析的報(bào)道很少，研究不同品種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸種類及含量，對紅樹莓品種的篩選、品質(zhì)的改善和產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。

有機(jī)酸的測定方法有分光光度法、色譜法（氣相色譜法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、離子色譜法、薄層色譜法）、電泳法、酶法等[4-9]。HPLC法因其簡單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)成為測定有機(jī)酸常用的方法，已經(jīng)廣泛用于蘋果、梨、葡萄、沙棘、番茄等果蔬中有機(jī)酸種類分析和含量測定[10-14]，這為紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸的分析測定提供了參考。本實(shí)驗(yàn)建立一種反相-HPLC（reversed phase-HPLC，RP-HPLC）法對6 種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸進(jìn)行分離測定，分析了紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸的種類和含量及種間差異，并與藍(lán)莓中有機(jī)酸的種類和含量進(jìn)行對比，為紅樹莓有機(jī)酸的定性定量分析提供一種有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓品種：‘野生’（Wild red raspberry）、‘寶石紅’（U.S. Raspberry）、‘哈瑞太茲’（Heritage）、‘歐洲紅’（European red raspberry）、‘菲爾杜德’（Fertod Zamatos）、‘秋?！ˋutumn Bliss），均為栽培品種。藍(lán)莓品種：‘北陸’（Hokuriku）。6 種紅樹莓和藍(lán)莓均采自黑龍江省尚志市，成熟度一致，速凍處理后運(yùn)回東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室凍藏。

草酸、酒石酸、檸檬酸、DL-蘋果酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（均為分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸（分析純） 天津市化學(xué)試劑三廠；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾（中國）有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀 美國安捷倫公司；0.45 μm微孔濾膜天津市奧特賽恩斯儀器有限公司；FA-2004型電子天平上海天平儀器廠；超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型pH酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

SinoChrom DS-BPC18色譜柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L KH2PO4溶液（pH 2.60，97∶3，V/V）；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm。

1.3.2 樣品處理

紅樹莓解凍后研磨成勻漿，稱取10.000 g勻漿液加入50 mL蒸餾水超聲（溫度25 ℃，功率300 W）提取30 min，冷卻后離心（4 000 r/min，15 min），收集上清液，殘?jiān)貜?fù)超聲提取15 min后離心，合并上清液，用純凈水定容于100 mL容量瓶中[15]。提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，用于RP-HPLC分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密稱取0.100 0 g草酸、0.200 0 g酒石酸、0.200 0 g乳酸、0.400 0 g蘋果酸、0.400 0 g檸檬酸，用純凈水溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，得到混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)母液。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行梯度稀釋，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后用于RP-HPLC分析。進(jìn)樣量10 μL，以峰面積（X）對各種有機(jī)酸質(zhì)量濃度（Y）求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Word、Excel、SPSS 11.5軟件進(jìn)行處理與分析。結(jié)果以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

2.1.1 流動(dòng)相配比

選擇以甲醇和0.01 mol/L KH2PO4溶液為流動(dòng)相。固定流速為0.6 mL/min，流動(dòng)相pH 2.60，柱溫30 ℃，分別以甲醇-0.01mol/L KH2PO4溶液配比為99∶1、98∶2、97∶3、96∶4、95∶5（V/V）對有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和紅樹莓樣品溶液進(jìn)行測定。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇-0.01mol/L KH2PO4溶液比例在99∶1～95∶5范圍內(nèi)時(shí)，5 種有機(jī)酸分離度越來越好，但出峰時(shí)間不斷延長；當(dāng)甲醇-0.01mol/L KH2PO4溶液比例大于97∶3時(shí)，雖然5 種有機(jī)酸能有效地被分離，但出峰時(shí)間較長，同時(shí)KH2PO4溶液比例增大容易對色譜柱造成損害。故綜合考慮，確定甲醇-0.01mol/L KH2PO4溶液配比為97∶3（V/V），此時(shí)樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各種有機(jī)酸能夠有效分離，峰形也較好。

2.1.2 流動(dòng)相pH值

固定流動(dòng)相甲醇-0.01 mol/L KH2PO4溶液配比為97∶3 （V/V），流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃，考察流動(dòng)相不同pH值（2.50、2.60、2.70、2.80、2.90）對有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品和紅樹莓樣品中有機(jī)酸分離效果的影響。結(jié)果表明：隨著pH值增大，出峰時(shí)間提前，分離度降低；當(dāng)pH值小于2.6時(shí)，出峰時(shí)間較長；當(dāng)pH值大于2.6時(shí)，草酸和酒石酸未能完全分開；在pH 2.6時(shí)，樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液

中各種有機(jī)酸都能達(dá)到基線分離，峰形更好。故確定流動(dòng)相pH值為2.6。

2.2 流速的選擇

固定流動(dòng)相甲醇-0.01 mol/L KH2PO4溶液配比為97∶3 （V/V），pH 2.60，柱溫30 ℃，考察流速分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min時(shí)對有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品和紅樹莓樣品中有機(jī)酸分離效果的影響。結(jié)果表明：隨著流速增大，出峰時(shí)間提前，但分離效果越差，當(dāng)流速大于0.6 mL/min時(shí)，草酸和酒石酸分離效果差。同時(shí)隨著流速增大，柱壓升高，較高的柱壓會(huì)損害儀器和色譜柱[4]。因此綜合考慮出峰時(shí)間、分離效果和柱壓，選擇流速為0.6 mL/min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以一定質(zhì)量濃度梯度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以峰面積（X）對5 種有機(jī)酸質(zhì)量濃度（Y）求回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 有機(jī)酸測定的回歸方程Table1 Regression equations for determination of organic acids

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以‘秋?！贩N果實(shí)樣品溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣5 次，根據(jù)所得峰面積計(jì)算各有機(jī)酸精密度，如表2所示。草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、DL-蘋果酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.20%～1.53%范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的精密度。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table2 Results of precision test (n= 5)

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精確量取‘哈瑞太茲’紅樹莓樣品溶液5.00 mL，加入5.00 mL有機(jī)酸混合標(biāo)樣（草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、DL-蘋果酸質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、2.00、4.00、4.00 mg/mL）。連續(xù)進(jìn)樣5 次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率。如表3所示，草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、DL-蘋果酸的平均加標(biāo)回收率為98.83%～105.42%，RSD 為0.06%～1.00%，均符合分析方法的要求。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of recovery test

2.6 樣品分析

在優(yōu)化的條件下對6 種紅樹莓樣品及藍(lán)莓進(jìn)行RPHPLC分析，如圖1所示。

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)樣（A）、‘野生’紅樹莓果實(shí)樣品（B）和藍(lán)莓果實(shí)樣品（C）RP-HPLC圖Fig.1 RP-HPLC chromatograms of organic acid standards (A), organic acids extracted from wild red raspberry fruit (B) and organic acids extracted from blueberry fruit (C)

2.7 樣品的測定

從表4可知，6 種紅樹莓中各種有機(jī)酸平均含量表現(xiàn)為：檸檬酸＞乳酸＞DL-蘋果酸＞草酸，未檢測到酒石酸。檸檬酸含量最高，為1 058.41～1 825.45 mg/100 g，平均含量是菠蘿中檸檬酸含量的2.33 倍[16]。5 種紅樹莓中乳酸含量為78.80～306.79 mg/100 g，但在‘哈瑞太茲’中未檢測到乳酸。DL-蘋果酸和草酸在紅樹莓果實(shí)中含量較低，含量分別為17.47～135.28 mg/100 g和

39.27～103.84 mg/100 g。國內(nèi)外也有類似的報(bào)道。韓加等[17]發(fā)現(xiàn)新疆樹莓果實(shí)中有機(jī)酸主要以檸檬酸為主（15.62%），也含有乙酸（1.16%）、蘋果酸（0.29%）和酒酸（0.14%）。Cekic等[18]發(fā)現(xiàn)土耳其北部地區(qū)的10 種紅樹莓中主要有機(jī)酸為檸檬酸，平均含量為1 310 mg/100 g，蘋果酸含量較少（數(shù)據(jù)未給出）。藍(lán)莓中有機(jī)酸以檸檬酸為主（1 062.29 mg/100 g），草酸、DL-蘋果酸和酒石酸含量都很低，未檢測到乳酸，且藍(lán)莓中有機(jī)酸含量顯著低于紅樹莓。

表4 6 種紅樹莓果實(shí)中各種有機(jī)酸含量Table4 The contents of organic acids in 6 varieties of red raspberry fruits

6 種紅樹莓中檸檬酸、乳酸、DL-蘋果酸和草酸含量均存在顯著差異，其中‘寶石紅’和‘哈瑞太茲’中檸檬酸含量較高，‘歐洲紅’中乳酸和草酸含量比其他品種含量高，‘菲爾杜德’和‘野生’紅樹莓中DL-蘋果酸含量比其他品種含量要高，‘野生’紅樹莓中乳酸和草酸含量比其他品種低，表明6 種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸種類和含量有一定差異，其主要與紅樹莓品種的內(nèi)在遺傳特性有關(guān)[19-20]。

3 討 論

有機(jī)酸易溶于水，為提高提取效率，本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法，考察了超聲提取時(shí)間對有機(jī)酸提取效率的影響。設(shè)定提取時(shí)間分別為15、30、45 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨提取時(shí)間延長，有機(jī)酸含量增加，但提取時(shí)間超過30 min后，有機(jī)酸含量沒有顯著增加，因此選擇最佳的提取時(shí)間為30 min。

檸檬酸酸味大，酸味突出，DL-蘋果酸與檸檬酸相比，具有酸度強(qiáng)、味道柔和、滯留時(shí)間長等特點(diǎn)，是新一代的食品酸味劑，被生物界和營養(yǎng)界譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”[21-22]?！茽柖诺隆汀吧t樹莓中DL-蘋果酸占總酸的比例分別為7.23%、6.50%，其較高含量的DL-蘋果酸可能使這2 種紅樹莓果實(shí)的酸味呈現(xiàn)更加柔和的特點(diǎn)。草酸易與腸道中的Ca2+結(jié)合形成不溶性的草酸鈣，干擾人體對Ca2+的吸收，因此草酸含量的高低與果實(shí)的品質(zhì)密切相關(guān)[23]；‘歐洲紅’中草酸含量最高，為（103.84±0.54） mg/100 g，較高含量的草酸可能會(huì)降低‘歐洲紅’紅樹莓的營養(yǎng)價(jià)值和果實(shí)品質(zhì)。

‘菲爾杜德’和‘寶石紅’紅樹莓中檸檬酸占總酸的比例較大，分別為47.63%、40.66%，同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明這2 種紅樹莓中可滴定酸含量也較高，分別為（1.87±0.01）%、（1.75±0.01）%。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)紅樹莓中檸檬酸含量與可滴定酸含量在0.05水平上具有相關(guān)性（r=0.533）。研究發(fā)現(xiàn)‘哈瑞太茲’和‘寶石紅’紅樹莓中總固形物含量/可滴定酸、總糖/可滴定酸顯著高于其他品種（分別為8.30、5.54和8.14、5.18），同時(shí)檸檬酸占總酸的比例也較低，分別為21.24%、13.00%，表明這2 種紅樹莓口感更好，更適合鮮食[21]。

本實(shí)驗(yàn)中，‘哈瑞太茲’紅樹莓中未檢測到乳酸，而其他5 個(gè)紅樹莓品種中都含有乳酸，可能原因是‘哈瑞太茲’紅樹莓中乳酸含量很低，低于該線性范圍（0.10～2.00 mg/mL）；也可能是該紅樹莓品種中乳酸與其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、金屬離子等結(jié)合形成絡(luò)合物，干擾了機(jī)器對乳酸分子的識別；或者該紅樹莓品種中乳酸分子在本實(shí)驗(yàn)的提取條件下未能充分游離出來[24-25]。在本實(shí)驗(yàn)的分離條件下，混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中草酸和酒石酸尚未完全分離，這可能是在紅樹莓中尚未檢測到酒石酸的原因之一。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種RP-HPLC法測定6 種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸含量，該方法準(zhǔn)確、靈敏、高效。結(jié)果表明，紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸以檸檬酸為主，含有少量的DL-蘋果酸、乳酸、草酸，不含酒石酸。紅樹莓果實(shí)中其他有機(jī)酸（如奎寧酸、琥珀酸、乙酸等）含量有待進(jìn)一步分析。

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Determination of Organic Acids in Six Varieties of Red Raspberry Fruits Grown in Northeast China by RP-HPLC Method

KUANG Hui1, LI Liangliang1, Lü Changshan2, WANG Jinling1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. School of Applied Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

A reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method was established to determine the contents of organic acids including oxalic acid, tartaric acid, citric acid, DL-malic acid and lactic acid in six varieties of red raspberry fruits from Northeast China. The optimized chromatographic conditions were determined as follows: a SinoChrom DS-BP C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) was chosen to separate organic acids, and the mobile phase was composed of methanol-0.01 mol/L KH2PO4aqueous solution (pH 2.60, 97:3, V/V) at a fow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃ and the eluate was monitored at 210 nm. The results indicated that the fve organic acids were separated successfully and a strong linear relationship appeared between the concentrations of organic acids and the peak areas under the above optimized conditions with correlation coeffcients between 0.999 3 and 0.999 9. The relative standard deviations (RSDs) of precision ranged from 0.20% to 1.53% and the average recovery rates were between 98.83% and 105.42% with RSD ranging from 0.06% to 1.00%. Citric acid was the predominant organic acid in red raspberry fruits, ranging from 1 058.41 to 1 825.45 mg/100 g. Trace amounts of oxalic acid, lactic acid and DL-malic acid were also detected but tartaric acid was not detected in red raspberry fruits. Overall, the presented method could be applied for separating and detecting different organic acids in red raspberry fruits effectively, accurately and repeatedly.

red raspberry; organic acids; reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC)

10.7506/spkx1002-6630-201622018

S663.2；TS201.1

A

1002-6630（2016）22-0126-05

曠慧, 李亮亮, 呂長山, 等. RP-HPLC法測定東北地區(qū)6 種紅樹莓果實(shí)中有機(jī)酸組成[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 126-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622018. http://www.spkx.net.cn

KUANG Hui, LI Liangliang, Lü Changshan, et al. Determination of organic acids in six varieties of red raspberry fruits grown in Northeast China by RP-HPLC method[J]. Food Science, 2016, 37(22): 126-130. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622018. http://www.spkx.net.cn

2016-05-14

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2572014CA14）

曠慧（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参镌椿钚晕镔|(zhì)。E-mail：belonghui2008@163.com

*通信作者：王金玲（1975—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参镌椿钚晕镔|(zhì)。E-mail：wangjinling08@163.com