張 政，王 倩，張 輝，魏 佳，丁娟麗，沈愛燕，吳 斌,3,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091）

一氧化氮間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄活性氧代謝的影響

張 政1，王 倩1，張 輝1，魏 佳2，丁娟麗1，沈愛燕1，吳 斌2,3,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091）

以木納格葡萄為材料，采用0、300、1 000 μL/L一氧化氮（NO）以間歇熏蒸的方式處理木納格葡萄，每7 d熏蒸1 次，共熏蒸8 次。測(cè)定了不同用量NO熏蒸處理后其活性氧代謝相關(guān)酶的變化趨勢(shì)。比較了NO處理對(duì)葡萄果皮以及果肉中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、丙二醛（MDA）含量、超氧陰離子自由基（O2-·）生成速率和過氧化氫（H2O2）含量變化的差異性，研究NO對(duì)葡萄抗氧化酶以及活性氧的影響方式。結(jié)果表明：300 μL/L NO處理能夠提高木納格葡萄果皮和果肉中SOD、POD、CAT和APX的活性，延緩MDA、O2-·和H2O2的積累，維持木納格葡萄果實(shí)中活性氧代謝的平衡，抑制膜質(zhì)過氧化的發(fā)生，延緩果實(shí)的衰老。

一氧化氮；間歇熏蒸；葡萄；活性氧

木納格葡萄（Vitis vinifera L. cv. ‘Munage’），別名克孜木納格，屬亞歐種（Vitis Feval），是優(yōu)良的晚熟鮮食葡萄品種，分布于新疆天山南部和塔里木盆地，以阿圖什品質(zhì)最優(yōu)。在商業(yè)上，SO2熏蒸是葡萄保鮮過程中常用的一種處理方法。但是，SO2的殘留量很難受到人為控制，SO2殘留物質(zhì)（亞硝酸鹽）的攝入會(huì)導(dǎo)致某些人出現(xiàn)過敏性反應(yīng)，這也是促使美國(guó)食品和藥物管理局將葡萄中的SO2殘留量限定為10 mg/kg的原因[1]。SO2作為葡萄最常用的保鮮劑，能延緩果實(shí)中抗氧化酶活性的降低，維持活性氧代謝平衡，提高果實(shí)的逆抗性，延緩果實(shí)衰老[2-3]。目前，葡萄保鮮多采用SO2保鮮片或保鮮紙一段式釋放的方式，但這種貯藏方式不利于維持葡萄后期的貯藏品質(zhì)，而間歇熏蒸可以改善商業(yè)保鮮紙藥效后期集中釋放的問題。

前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，NO具有提高伽師瓜[4]、番茄[5]和小白杏[6]等果實(shí)中抗氧化酶的活性、抑制膜脂過氧化、延緩果實(shí)成熟衰老的作用。采用NO作為葡萄保鮮劑，可以減少SO2葡萄保鮮劑的使用量，緩解葡萄貯藏過程中使用SO2出現(xiàn)的有害物質(zhì)殘留和漂白等問題。因此，本研究以木納格葡萄為試材，采用NO氣體間歇熏蒸的方式處理果實(shí)，研究NO用量以及氣體間歇熏蒸的方式對(duì)木納格葡萄采后活性氧代謝的調(diào)控作用，為改善木納格葡萄的貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)其貯藏期提供理論依據(jù)，同時(shí)也為提高鮮食葡萄采后食用安全性提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木納格葡萄于2015年10月17日采自新疆阿圖什，采后立即運(yùn)往新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，挑選大小均一、無機(jī)械損傷、無病蟲害的葡萄果實(shí)。初始硬度為（6.77±0.15）N，可溶性固形物含量達(dá)到（20.7±0.46）%。

磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸羥胺、過氧化氫（H2O2） 天津市福晨化學(xué)試劑廠；愈創(chuàng)木酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；核黃素 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；三氯乙酸 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫代巴比妥酸 上海展云化學(xué)有限公司；氮藍(lán)四唑 南京奧多福尼生物科技公司；甲硫氨酸 美國(guó)Sigma公司。以上試劑均為分析純。

NO氣體（氣體純度為99.99%） 廣州世源氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外分光光度計(jì) 日本島津有限公司；IKA?A11基本型研磨機(jī) 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；GY-4硬度計(jì) 北京市興光測(cè)色儀器公司；PAL-1數(shù)顯折射儀 日本Atago公司；Centrifge 5810 R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將試供材料隨機(jī)分組，每筐葡萄果實(shí)質(zhì)量7.00 kg，每個(gè)處理為6 筐，共計(jì)18 筐。將葡萄至于密閉環(huán)境中，分別采用前期篩選出的最適用量300 μL/L NO和處理的最高用量1 000 μL/L NO在有氧條件下熏蒸處理2 h（每隔7 d熏蒸一次，共熏蒸8 次）。處理結(jié)束后，筐外套入0.03 mm的聚乙烯（polyethylene，PE）袋并封口，置于（0±0.5）℃的條件下貯藏，以不采用NO間歇熏蒸處理為對(duì)照。定期拍照，每次取樣為2.5 kg，并對(duì)相關(guān)活性酶進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑還原法[7]；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[8]；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測(cè)定參考Aebi等[9]的方法；抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性測(cè)定參考Imahori等[10]的方法；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[11]；超氧陰離子自由基（O2-·）生成速率測(cè)定采用羥胺氧化法[12]；H2O2含量的測(cè)定采用四氯化鈦還原法[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Sigma Plot 12.0軟件作圖，SPSS 19.5進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析并利用Duncan法進(jìn)行均值比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適NO間歇熏蒸用量的篩選

表1 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄貯藏第62天品質(zhì)指標(biāo)的影響Table1 Effect of intermittent fumigation with NO on quality of ‘Munage’ grapes on day 62 of storage

如表1所示，前期工作中，采用不同用量的NO處理葡萄果實(shí)，在貯藏結(jié)束，即第62天時(shí)，發(fā)現(xiàn)300 μL/L NO間歇熏蒸處理能顯著維持木納格葡萄的硬度。與對(duì)照組和其他用量NO處理組相比，300 μL/L NO間歇熏蒸處理

有效延緩了木納格葡萄質(zhì)量損失率、腐爛率、落粒率以及果梗褐變指數(shù)的增長(zhǎng)，延長(zhǎng)了果實(shí)的貯藏期。

2.2 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄SOD活性的影響

圖1 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄果皮（A）與果肉（B）中SOD活性的影響Fig.1 Effect of intermittent fumigation with NO on SOD activity of ‘Munage’ grape peel and flesh

SOD是一種金屬蛋白酶，能有效清除細(xì)胞中的O2-·迅速轉(zhuǎn)化成H2O2和O2，保護(hù)參與氧代謝的細(xì)胞免受O2-·的傷害[14]。由圖1A可知，木納格葡萄果皮中SOD活性在貯藏期間呈下降的趨勢(shì)。在貯藏第12天，對(duì)照果的SOD活性急速下降，但300、1 000 μL/L NO處理果的SOD活性均維持在較高的水平。整個(gè)貯藏期間，300 μL/L NO處理果的SOD活性顯著高于1 000 μL/L NO處理果和對(duì)照果（P＜0.05）。直至貯藏第62天，對(duì)照果和1 000 μL/L NO處理果的SOD活性分別降低了13.35%和10.17%，而300 μL/L NO處理果的SOD活性僅降低了5.61%。

如圖1B所示，木納格葡萄果肉中SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。300 μL/L NO處理果的SOD活性在第22天達(dá)最大值0.50 U/g，而對(duì)照果的SOD活性在32 d才達(dá)最大值。雖然，300 μL/L NO處理使SOD活性高峰提前出現(xiàn)，但是300 μL/L NO處理果的SOD活性在32 d時(shí)仍顯著高于對(duì)照果（P＜0.05）。1 000 μL/L NO處理果的SOD活性在貯藏12 d后低于對(duì)照果。

2.3 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄POD活性的影響

POD廣泛存在于植物體內(nèi)，能催化NADH氧化形成O2-·產(chǎn)生H2O2，也能與CAT一樣參與分解H2O2的過程[15]。由圖2A可以看出，貯藏12 d時(shí)木納格葡萄果皮中的POD活性迅速下降。此時(shí)，300 μL/L和1 000 μL/L NO處理果的POD活性顯著大于對(duì)照果（P＜0.05），且300 μL/L NO處理要優(yōu)于1 000 μL/L NO處理。貯藏32 d后，300、1 000 μL/L NO處理果和對(duì)照果的POD活性沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖2B表明，在木納格葡萄貯藏的過程中，果肉的POD活性在貯藏前32 d一直維持在0.01 U/g以下，對(duì)照果和1 000 μL/L NO處理果的POD在42 d達(dá)到最大值后迅速降低，而300 μL/L NO處理果POD活性高峰推遲了10 d才出現(xiàn)。

2.4 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄CAT活性的影響

漢家秦地月，流影照明妃。一上玉關(guān)道，天涯去不歸。漢月還從東海出，明妃西嫁無來日。燕支長(zhǎng)寒雪作花，蛾眉憔悴沒胡沙。生乏黃金枉圖畫，死留青冢使人嗟。昭君拂玉鞍，上馬啼紅頰。今日漢宮人，明朝胡地妾。（李白《王昭君二首》）

圖3 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄果皮（A）與果肉（B）中CAT活性的影響Fig.3 Effect of intermittent fumigation with NO on CAT activity of ‘Munage’ grape peel and flesh

CAT是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶，對(duì)H2O2具有高度的特異性，能將H2O2分解為O2和H2O，從而降低過量的H2O2對(duì)植物造成的傷害[16]。由圖3A所示，隨著貯藏

時(shí)間的延長(zhǎng)，木納格葡萄果皮的CAT活性呈下降趨勢(shì)，300 μL/L和1 000 μL/L NO處理果的CAT活性變化趨勢(shì)與對(duì)照果一致。1 000 μL/L NO處理果和對(duì)照果的CAT活性在貯藏的前12 d急速下降，而300 μL/L NO處理顯著抑制了CAT活性的降低（P＜0.05）。整個(gè)貯藏過程中，300 μL/L NO處理果的CAT活性始終顯著高于1 000 μL/L NO處理果和對(duì)照果（P＜0.05）。

從圖3B可以看出，木納格葡萄果肉中CAT活性變化趨勢(shì)與果皮不同，呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)。貯藏前期，對(duì)照果的CAT活性與1 000 μL/L NO處理果CAT活性無顯著差異，且貯藏后期顯著低于300 μL/L和1 000 μL/L NO處理（P＜0.05）。雖然1 000 μL/L NO處理果CAT活性的最大值與300 μL/L NO處理CAT活性的最大值無顯著差異（P＞0.05），但300 μL/L NO處理顯著延緩了CAT活性高峰的出現(xiàn)。

2.5 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄APX活性的影響

圖4 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄果皮（A）與果肉（B）中APX活性的影響Fig.4 Effect of intermittent fumigation with NO on APX activity of ‘Munage’ grape peel and flesh

APX是ASA-GHS循環(huán)的核心組成部分，它可以清除植物體內(nèi)的H2O2，防止植物中葉綠素的降解和細(xì)胞組織的傷害[17]。圖4A表明，木納格葡萄采后貯藏期間，處理和對(duì)照果果皮的APX活性均成先上升后下降的趨勢(shì)。貯藏前期，處理果和對(duì)照果的APX活性之間無顯著差異。貯藏22 d后果皮的APX活性開始上升，此時(shí)300 μL/L NO處理顯著延緩了APX活性高峰的出現(xiàn)（P＜0.05），分別比對(duì)照和1 000 μL/L NO處理晚了10d和20d。

如圖4B所示，木納格葡萄果肉中的APX活性也成上升趨勢(shì)。在貯藏前22 d，對(duì)照果和300 μL/L NO處理果的APX活性無顯著差異，而1 000 μL/L NO處理果的APX活性顯著低于前者。與果皮中APX變化趨勢(shì)類似，300 μL/L NO處理同樣使APX的活性高峰向后推移。

2.6 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄MDA含量的影響

圖5 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄果皮（A）與果肉（B）中MDA含量的影響Fig.5 Effect of intermittent fumigation with NO on MDA content of ‘Munage’ grape peel and flesh

MDA含量體現(xiàn)了細(xì)胞膜脂過氧化的程度，膜脂過氧化程度越高，細(xì)胞所受到的氧化損傷就越嚴(yán)重[18]。圖5表明，在貯藏過程中，木納格葡萄果實(shí)的MDA含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)和果實(shí)的衰老不斷增加。NO處理顯著抑制了貯藏過程中葡萄果皮與果肉MDA含量的增長(zhǎng)，且300 μL/L NO處理顯著優(yōu)于1 000 μL/L NO處理（P＜0.05）。NO處理與對(duì)照果果皮的MDA含量從貯藏12 d后開始迅上升，直至貯藏結(jié)束，對(duì)照果、300 μL/L和1 000 μL/L NO處理果果皮MDA含量是貯藏初期的1.26、1.13 倍和1.20倍。果肉中MDA含量的變化趨勢(shì)與果皮類似，在采后貯藏期間，300 μL/L NO處理顯著抑制了MDA含量的增長(zhǎng)，減輕了果實(shí)的膜質(zhì)過氧化程度（P＜0.05）。

圖6 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄果皮（A）與果肉（B）中?產(chǎn)生速率的影響Fig.6 Effect of intermittent fumigation with NO on superoxide anion radical generation rate of ‘Munage’ grape peel and flesh

O2-·是一種對(duì)細(xì)胞具有氧化損傷作用的自由基，能經(jīng)SOD轉(zhuǎn)化成H2O2和O2[19]。由圖6可知，木納格葡萄果實(shí)中O2-·產(chǎn)生速率隨著果實(shí)貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，果肉中O2-·產(chǎn)生速率在貯藏52 d小幅下降，且不同用量NO處理的O2-·產(chǎn)生速率均顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。其中除22 d外，300 μL/L NO處理果果皮的O2-·產(chǎn)生速率顯著低于1 000 μL/L NO處理（P＜0.05）；對(duì)于果肉而言，在貯藏第52天，300 μL/L NO處理顯著低于1 000 μL/L NO處理，其他貯藏時(shí)間二者無顯著差異（P＞0.05）。

2.8 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄H2O2含量的影響

圖7 NO間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄果皮（A）與果肉（B）中H2O2含量的影響Fig.7 Effect of intermittent fumigation with NO on H2O2content of ‘Munage’ grape peel and flesh

過量積累的H2O2可以使細(xì)胞膜中的磷脂雙分子層受到氧化損傷，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)被破壞以及細(xì)胞的死亡[20]。從圖7可以看出，伴隨著木納格葡萄果實(shí)的衰老，其果實(shí)中H2O2的含量逐漸累積。與對(duì)照果相比，300 μL/L 和1 000 μL/L NO處理能顯著抑制果皮中H2O2的生成（P＜0.05），但是在貯藏后期1 000μL/L NO處理與對(duì)照果之間無顯著差異。果肉中的H2O2含量要低于果皮，僅為果皮的45.96%。在貯藏的42～52 d，300 μL/L和1 000 μL/L NO處理果果肉H2O2含量之間無顯著差異，但在整個(gè)貯藏過程中，300 μL/L和1 000 μL/L NO處理都能減少果肉中H2O2的累積，且300 μL/L NO處理效果較好。

3 討 論

外源NO可以顯著提高香蕉[21]、竹筍[22]和菠菜[23]等果蔬中SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性。在本實(shí)驗(yàn)中，300 μL/L NO處理推遲了木納格萄果皮中APX活性和果肉中POD、CAT、APX活性高峰的出現(xiàn)，并且木納格葡萄果皮中的SOD、CAT和果肉中的SOD活性均高于對(duì)照組。趙強(qiáng)等[24]在對(duì)無核葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SOD、POD和CAT保持較高的活性時(shí)，葡萄中的O2-·和H2O2的含量得到了有效的控制，有利于葡萄的長(zhǎng)期貯藏。NO不僅能誘導(dǎo)抗氧化酶活性的上升，還能與O2-·結(jié)合形成對(duì)植物細(xì)胞無毒害作用的ONOO-，減少O2-·含量[25]。本研究表明，300 μL/L NO處理延緩了木納格葡萄果皮和果肉中O2-·和H2O2的積累，這與上述研究結(jié)果一致。

膜脂過氧化作用是活性氧產(chǎn)生的重要來源，O2-·和H2O2含量的增加加速了膜脂過氧化的過程[26]。MDA含量體現(xiàn)了細(xì)胞膜脂過氧化的程度，膜脂過氧化程度越高，細(xì)胞所受到的氧化損傷就越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，NO處理有效減少了木納格葡萄果皮和果肉中MDA含量的累積，可能是由于NO通過提高活性氧清除酶的活性，減少O2-·和H2O2的產(chǎn)生，減輕了葡萄果實(shí)膜脂過氧化的程度。Shi Jingying等[27]研究表明NO處理可以顯著抑制鮮切板栗中POD和PPO的活性，將總酚的含量維持在一個(gè)較高的水平。趙金梅等[28]指出，獼猴桃的抗氧化能力與它的VC和總酚的含量密切相關(guān)。因此，NO也有可能通過誘導(dǎo)葡萄果實(shí)中VC以及酚類化合物這類抗氧化物質(zhì)含量的增加，從而減少M(fèi)DA含量。

綜上所述，300 μL/L NO間歇熏蒸處理可以提高木納格葡萄果皮和果肉中SOD、POD、CAT和APX的活性，增強(qiáng)了對(duì)O2-·和H2O2的清除能力，抑制了MDA含量的增長(zhǎng)，從而延緩了葡萄果實(shí)的衰老。NO間歇熏蒸在葡萄貯藏中的應(yīng)用可以減少SO2葡萄保鮮劑的使用，提高鮮食葡萄采后食用的安全性。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可考慮后期采用NO與SO2雙氣體組分對(duì)葡萄進(jìn)行間歇熏蒸處理，以期為葡萄貯藏保鮮提供高效安全的方法，同時(shí)為NO在果蔬采后中的應(yīng)用提供新思路。

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Effect of Intermittent Fumigation with Nitric Oxide on Reactive Oxygen Species Metabolism of ‘Munage’ TableGrapes

ZHANG Zheng1, WANG Qian1, ZHANG Hui1, WEI Jia2, DING Juanli1, SHEN Aiyan1, WU Bin2,3,*
(1. College of Food Science and Pharmacy, Xinjiang Agricultural University, ürümqi 830052, China; 2. Institute of Agro-Products Storage and Processing, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, ürümqi 830091, China; 3. Xinjiang Laboratory of Agro-Products Quality and Safety, ürümqi 830091, China)

The aim of this work was to investigate the impact of nitric oxide (NO) on the metabolism of reactive oxygen species (ROS). ‘Munage’ Tablegrapes were treated by intermittent fumigation once every seven days totally 8 times. The effects of NO on the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), and ascorbate peroxidase (APX) in grape peel and flesh were analyzed. The changes in the contents of malondialdehyde (MDA) and H2O2, as well as superoxide anion radical formation rate were also monitored. The results showed that SOD, POD, CAT and APX activities grape peel and flesh could be improved effectively and the accumulations of MDA, superoxide anion radical and H2O2were delayed by 300 μL/L NO intermittent fumigation treatment. The NO treatment could maintain the balance of active oxygen metabolism, inhibit membrane lipid peroxidation and delay grape senescence. This study contributed to a comprehensive understanding of the ROS metabolism in ‘Munage’ grape treated with NO and provided useful information for maintaining fruit quality.

nitric oxide; intermittent fumigation; grape; reactive oxygen species

10.7506/spkx1002-6630-201622038

TS225.3

A

1002-6630（2016）22-0249-06

張政, 王倩, 張輝, 等. 一氧化氮間歇熏蒸對(duì)木納格葡萄活性氧代謝的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 249-254. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622038. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Zheng, WANG Qian, ZHANG Hui, et al. Effect of intermittent fumigation with nitric oxide on reactive oxygen species metabolism of ‘Munage’ Tablegrapes[J]. Food Science, 2016, 37(22): 249-254. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622038. http://www.spkx.net.cn

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31560473）

張政（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：57541038@qq.com

*通信作者：吳斌（1973—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)楣卟珊蠓肿由飳W(xué)。E-mail：xjuwubin0320@sina.com