李 俊，劉永翔，王 輝，劉 嘉，劉 輝，闞建全*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006）

高效液相色譜法定量測定果蔬中甲醛含量

李 俊1,2，劉永翔2，王 輝1,2，劉 嘉1,2，劉 輝2，闞建全1,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006）

通過五氟苯肼與甲醛進(jìn)行衍生，建立高效液相色譜法定量測定果蔬中甲醛含量的分析方法。樣品在溫度為60 ℃超聲波條件下直接提取衍生30 min，離心純化后高效液相色譜檢測，外標(biāo)法定量。優(yōu)化的色譜條件為：XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-水（70∶30，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長258 nm。結(jié)果表明，該方法的定量檢測限可達(dá)到0.114 mg/kg，在0.114～57 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，當(dāng)甲醛添加量分別為1.14、8.55、17.10 mg/kg時，平均回收率為81.4%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～5.0% （n=6）。該方法樣品前處理簡便、穩(wěn)定性好、檢測限低，適合果蔬中甲醛含量的快速檢測。

果蔬；甲醛；高效液相色譜；五氟苯肼

甲醛，俗稱蟻醛，分子式為HCHO，在常溫條件下是一種無色具有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體[1]。甲醛是原生質(zhì)毒物，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，吸入高濃度甲醛后，會出現(xiàn)呼吸道的嚴(yán)重刺激，引發(fā)支氣管哮喘，孕婦長期吸入甲醛可導(dǎo)致新生嬰兒畸形甚至死亡，男子長期吸入甲醛可導(dǎo)致精子畸形和死亡，甲醛還有遺傳毒性和致癌性[2-4]。甲醛具有防腐、延長保質(zhì)期、增加持水性、韌性等功效[5]，在一些樹脂成型的包裝材料（如三聚氰胺、脲醛樹脂、酚醛樹脂等）中，存在一定量的游離甲醛，做為食品貯運(yùn)的容器長期使用，或者受到酸、堿的侵蝕，就易老化

分解，造成甲醛溶出，對食品造成污染[6-7]。

甲醛在果蔬組織中主要以游離狀態(tài)存在于組織液中，有極少部分會以結(jié)合態(tài)形式存在，要檢測果蔬中的甲醛含量，首先要把甲醛從果蔬組織中提取出來才行[8-9]。目前，在甲醛檢測中應(yīng)用較多的提取方法是水蒸氣蒸餾法和直接蒸餾法，蒸餾法的優(yōu)點(diǎn)是獲得的甲醛提取液樣品中雜質(zhì)較少，干擾較小，但蒸餾過程中經(jīng)高溫加熱會導(dǎo)致食品中的某些成分發(fā)生如美拉德反應(yīng)、氧化分解、Strecker降解反應(yīng)、糖類的脫水和熱解反應(yīng)等化學(xué)反應(yīng)[10-11]，可能會生成甲醛和其他揮發(fā)性物質(zhì)，同時本身的甲醛因加熱蒸餾也會損失，從而使甲醛含量發(fā)生變化，不能真實(shí)反映樣品中的甲醛含量，而且蒸餾裝置復(fù)雜、費(fèi)時、效率低下，不適合批量樣品的處理[12-13]。超聲波提取法是現(xiàn)在提取技術(shù)中應(yīng)用比較多的提取方法，具有操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，但是否適合果蔬中甲醛的提取，國內(nèi)外還鮮見研究報道。

目前測定食品中甲醛含量的方法主要有分光光度法[14-15]、高效液相色譜法[16]、氣相色譜法[17-18]等。甲醛檢測常用的方法是首先使甲醛與衍生劑X在一定條件下反應(yīng)生成一種穩(wěn)定的甲醛-X衍生物后進(jìn)行檢測，不同的衍生劑反應(yīng)條件不一，與甲醛結(jié)合生成的衍生物性狀也不同，因此不同衍生劑適用的檢測方法也不一樣[19-20]。現(xiàn)有甲醛檢測標(biāo)準(zhǔn)方法中常用的衍生劑有乙酰丙酮和2,4-二硝基苯肼，前者主要用于分光光度法檢測時衍生，后者主要用于色譜法檢測時衍生，由于果蔬樣品大多含有不同顏色，超聲波提取法所得樣品溶液對乙酰丙酮分光光度法檢測造成一定的干擾，而2,4-二硝基苯肼與甲醛的衍生物在水中溶解度低，穩(wěn)定性差，通過有機(jī)溶劑萃取溶解可以提高其穩(wěn)定性，但操作繁瑣，處理過程中會造成甲醛損耗[21-23]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過超聲波提取結(jié)合五氟苯肼與甲醛衍生[24]，建立了一種新的更適用于果蔬中甲醛檢測的高效液相色譜法，并且與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)SNT 1547—2011《進(jìn)出口食品中甲醛的測定：液相色譜法》2,4-二硝基苯肼液相色譜法進(jìn)行對比，確定一種穩(wěn)定性好、簡便高效的果蔬中甲醛含量的定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果、橘子、白菜、蘿卜、辣椒、西蘭花、姜 重慶市購。

五氟苯肼標(biāo)準(zhǔn)品（37.0%～40.0%甲醛溶液，用碘量法[25]標(biāo)定其精確質(zhì)量濃度為1.14 mg/mL，配制甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度為114 μg/mL） 美國Sigma公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜儀、Eelipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Agilent公司；DK-8D型三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004型分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；722-P型紫外-可見分光光度計 上?，F(xiàn)代儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

取200 μL 114 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 3.0 mg/mL五氟苯肼衍生劑，用蒸餾水定容至10 mL，在溫度60 ℃條件下水浴加熱30 min，然后在高效液相色譜儀上用二極管陣列檢測器做全波長掃描，確定最佳吸收波長。選取乙腈和水作為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，使流動相比例分別為乙腈-水（60∶40、70∶30、75∶25、80∶20、90∶10，V/V）來確定最佳流動相比例。同時根據(jù)最佳流動相比例調(diào)節(jié)柱溫分別為30、35、40 ℃來確定最佳柱溫。

1.3.2 衍生反應(yīng)條件的單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 反應(yīng)溫度對衍生反應(yīng)的影響

取6 個10 mL容量瓶，分別加入200 μL 114 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入1.0 mL 3.0 mg/mL五氟苯肼衍生劑，用蒸餾水定容至10 mL，在水浴溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃的條件下衍生30 min，取出后在流水中快速冷卻，取少許溶液過0.22 μm混合相濾膜，高效液相色譜檢測。重復(fù)3 次。

1.3.2.2 反應(yīng)時間對衍生反應(yīng)的影響

取6 個10 mL容量瓶，分別加入200 μL 114 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入1.0 mL 3.0 mg/mL五氟苯肼衍生劑，用蒸餾水定容至10 mL，在水浴溫度60 ℃的條件下分別反應(yīng)10、20、30、40、50 min，然后按照1.3.2.1節(jié)方法處理。

1.3.2.3 五氟苯肼衍生劑加入量對衍生反應(yīng)的影響

取10 個10 mL容量瓶，分作A、B兩組，每組5 個，A、B兩組分別加入200、500 μL 114 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液，然后每組中依次加入0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑，用蒸餾水定容至10 mL，在水浴溫度為60 ℃的條件下反應(yīng)30 min，然后按照1.3.2.1節(jié)方法處理。

1.3.3 衍生反應(yīng)條件的正交試驗(yàn)

表1 衍生反應(yīng)條件的正交試驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array design for the optimization of derivative reaction conditions

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對衍生反應(yīng)有影響的3 個因素：衍生劑加入量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，分別測定每組的峰面積。

1.3.4 超聲波提取法中甲醛提取劑用量的確定

準(zhǔn)確稱取打碎后的白菜樣品10.00 g，置于100 mL具塞離心管中，每份樣品中分別加入2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑，分別補(bǔ)足蒸餾水至20、30、40、50、60、70、80 mL，設(shè)定超聲波功率100 W、提取溫度60 ℃、提取時間30 min，然后在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，過0.22 μm混合相濾膜，液相色譜檢測。重復(fù)3 次。并做空白對照。

1.3.5 超聲波提取法其他提取條件的單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 超聲波提取時間對果蔬中甲醛提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取打碎后的西蘭花、白蘿卜、白菜樣品各10.00 g，置于100 mL具塞離心管中，依次加入35 mL蒸餾水，5.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑，在超聲波功率100 W、提取溫度50 ℃條件下分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，然后依次加入2.5 mL 21.9%的乙酸鋅溶液，2.5 mL 106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液，在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移入50 mL容量瓶中，用少量蒸餾水（約5 mL）清洗殘渣1 次，在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，合并上清液并用蒸餾水定容至50 mL，即為樣品待測液。取少許溶液過0.22 μm混合相濾膜，液相色譜檢測。重復(fù)3 次。

1.3.5.2 超聲波提取功率對果蔬中甲醛提取效果的影響

設(shè)定超聲波功率分別為50、60、70、80、90、100 W，在溫度50 ℃條件下超聲提取30 min，其他處理同1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.3 超聲波提取溫度對果蔬中甲醛提取效果的影響

設(shè)定水浴溫度分別為40、50、60、70、80、90、100 ℃，在超聲波功率100 W條件下超聲提取30 min，其他處理同同1.3.5.1節(jié)。

1.3.5.4 超聲波提取次數(shù)對果蔬中甲醛提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取打碎后的西蘭花、白蘿卜、白菜樣品各3 份，每份10.00 g，共9 份，分為A、B、C 3 組，A、B、C 3 組均置于100 mL具塞離心管中，依次加入35 mL蒸餾水，5.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑，設(shè)定超聲波功率100 W、溫度50 ℃條件下超聲提取30 min，然后依次加入2.5 mL 21.9%的乙酸鋅溶液，2.5 mL 106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液，在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移入50 mL容量瓶中，用少量蒸餾水（約5 mL）清洗殘渣1 次，在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，合并上清液并用蒸餾水定容至50 mL，A組提取液最終定容體積為50 mL。將經(jīng)一次提取的B、C兩組剩余殘渣按上述步驟再超聲提取一次，合并提取液，B組提取液最終定容體積為100 mL。將經(jīng)二次提取的C組剩余殘渣按上述步驟再超聲提取一次，合并提取液，C組提取液最終定容體積為150 mL，然后同1.3.5.1節(jié)處理。根據(jù)每組提取液最終定容體積計算提取出的甲醛含量。

1.3.6 超聲波提取法其他提取條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對超聲波提取有較大影響的3 個因素：提取時間、超聲波功率、提取溫度，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。選擇西蘭花作為樣品。

表2 超聲波提取條件的正交試驗(yàn)因素水平Table2 Factors and levels used in orthogonal array design for the optimization of ultrasound extraction conditions

1.3.7 顏色干擾試驗(yàn)和衍生物顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

通過將少量莧菜紅、肼黃、靛藍(lán)3 種顏色分別加入2.28 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品中和白蘿卜樣品中，測定其峰面積變化，確定果蔬樣品顏色對甲醛檢測過程是否產(chǎn)生干擾。

準(zhǔn)確移取50、200、500 μL 114 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑，用蒸餾水定容至10 mL，置于60 ℃水浴中衍生20 min，取出后在流水中快速冷卻，取少許溶液過0.22 μm混合相濾膜，然后分別放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h，液相色譜法測定每個時間點(diǎn)時溶液的峰面積，確定甲醛-五氟苯肼衍生物的顯色穩(wěn)定時間。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0、20、50、100、200、500、1 000 μL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑，用蒸餾水定容至10 mL，此時溶液中的甲醛質(zhì)量濃度分別為0、0.228、0.570、1.140、2.280、5.700、11.400 μg/mL，置于60 ℃水浴中衍生20 min，取出后在流水中快速冷卻，取少許溶液過0.22 μm混合相濾膜，液相色譜檢測。重復(fù)6 次。樣品中甲醛含量計算方法如公式（1）所示：

式中：M為樣品中甲醛含量/（mg/kg）；C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的樣液中甲醛的質(zhì)量濃度/（mg/L）；m為稱取試樣質(zhì)量/g；50為提取液最終定容體積/mL。

1.3.9 五氟苯肼法和SN/T 1547—2011方法的回收率和精密度對比實(shí)驗(yàn)

將試驗(yàn)原料中7 種樣品打碎，每種樣品分別稱取4 份，每份10.00 g，置于100 mL具塞離心管中，每種樣品中甲醛的添加量分別為0、1.14、8.55、17.10 mg/kg，然后在每份樣品中依次加入5.0 mL 3.0 mg/mL的五氟

苯肼衍生劑，加入35 mL蒸餾水，設(shè)定超聲波功率80 W，溫度60 ℃條件下超聲提取30 min，然后依次加入2.5 mL 21.9%的乙酸鋅溶液，2.5 mL 106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液，攪拌均勻，在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，將上清液移入50 mL容量瓶中，再用少量蒸餾水（約5 mL）清洗殘渣1 次，在離心機(jī)上8 000 r/min離心5 min，合并上清液并用蒸餾水定容至50 mL，即為樣品待測液。取少許樣品待測液過0.22 μm混合相濾膜，液相色譜檢測。重復(fù)6 次。

同時參照SN/T 1547—2011液相色譜法測定蘋果、橘子、白菜、蘿卜、辣椒、西蘭花、姜7 種果蔬中甲醛的加標(biāo)回收率和精密度。對比兩種檢測方法的回收率和精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin（Version 8.6）進(jìn)行作圖，采用SPSS （Version 17.0）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，P＜0.01認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的選擇

圖1 五氟苯肼-甲醛衍生物全波長掃描圖Fig.1 UV Absorption spectrum of PFPH-formaldehyde derivatives

圖2 甲醛標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of formaldehyde standard

由圖1可知，五氟苯肼衍生液相色譜法檢測的最佳波長為258 nm。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動相比例乙腈-水（70∶30，V/V），柱溫40 ℃時分離效果最佳，甲醛衍生物的峰形較好，完成一個樣品的分析耗時7 min，甲醛衍生物保留時間在3.9 min（圖2）。因此高效液相色譜法色譜條件為流速1.0 mL/min、流動相乙腈-水（70∶30，V/V）、柱溫40 ℃、進(jìn)樣量20 μL、二極管列陣檢測器，檢測波長258 nm；色譜柱為C18柱。

2.2 衍生反應(yīng)條件的確定

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可得，當(dāng)衍生反應(yīng)溫度達(dá)到60 ℃后，甲醛-五氟苯肼衍生物的峰面積不再隨溫度升高而變化，說明60 ℃時衍生反應(yīng)基本完全，所以選擇60 ℃為較佳衍生溫度（圖3A）。隨著衍生反應(yīng)時間延長，甲醛-五氟苯肼衍生物的峰面積不斷增加，在20 min時達(dá)到最大值，之后衍生物的峰面積不再隨時間增加而變化，所以選擇20 min為較佳衍生時間（圖3B）。隨著衍生劑用量的增加，兩種濃度下甲醛-五氟苯肼衍生物的峰面積均逐漸增加，當(dāng)衍生劑加入量達(dá)到1.0 mL后，衍生物生成量不再隨衍生劑加入量增加而變化，所以選擇每10 mL樣品甲醛提取液中加入1.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑為較佳的加入量（圖3C）。

圖3 衍生反應(yīng)條件對衍生反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of reaction conditions on the derivative reaction

由表3可得，五氟苯肼衍生高效液相色譜法最佳衍生反應(yīng)條件為A2B2C2，即反應(yīng)溫度60 ℃、3.0 mg/mL五氟苯肼衍生劑加入量1.0 mL、反應(yīng)時間20 min。觀察表中3 個因素的極差R大小，發(fā)現(xiàn)衍生劑加入量和反應(yīng)溫

度為主要影響因素，反應(yīng)時間為次要影響因素，由于試驗(yàn)組中沒有A2B2C2，所以補(bǔ)充驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定的峰面積為695.7，比表中所有試驗(yàn)組測得的峰面積都高，所以高效液相色譜法最佳衍生反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時間20 min，每10 mL樣品甲醛提取液中加入1.0 mL 3.0 mg/mL的五氟苯肼衍生劑。

表3 衍生條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果L9（34）Table3 Orthogonal array design L9(34) with experimental results for the optimization of derivative reaction conditions

2.3 提取條件的確定

2.3.1 提取過程中甲醛提取劑用量的確定

圖4 甲醛提取劑用量對提取效果的影響Fig.4 Effect of water addition on the extraction efficiency of formaldehyde

由圖4可知，隨著甲醛提取劑蒸餾水用量的增加，樣品中甲醛的檢出量有少許增加，當(dāng)提取劑用量達(dá)到40 mL時，樣品中的甲醛檢出量達(dá)到最大，當(dāng)提取劑用量繼續(xù)增加到60 mL后，檢出的甲醛含量有減少的趨勢，這可能是因?yàn)樘崛┯昧窟^大，導(dǎo)致提取液中甲醛稀釋倍數(shù)過大，吸光度變小，儀器檢測結(jié)果準(zhǔn)確度降低。所以綜合考慮選擇甲醛提取劑蒸餾水用量為40～60 mL范圍內(nèi)為宜，即料液比為1∶4～1∶6（g/mL）。

2.3.2 超聲波提取條件的確定

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可得，隨著提取時間的延長，3 種樣品中提取出的甲醛含量均不斷升高，當(dāng)提取時間延長至30 min時，提取出的甲醛含量達(dá)到最大值，之后不再隨提取時間的延長而升高，所以為了保證樣品中的甲醛能夠提取充分，選擇30 min為較佳提取時間（圖5A）。當(dāng)超聲波功率較低時，3 種樣品中提取出的甲醛含量隨著超聲波功率的增加呈緩慢上升趨勢，在80 W左右達(dá)到最大值，隨著超聲波提取功率繼續(xù)增加，提取出的甲醛含量有減少的趨勢，所以選擇超聲波功率80 W為較佳提取功率（圖5B）。在40～60 ℃范圍內(nèi)，隨著超聲波提取溫度的升高，3 種樣品中提取出的甲醛含量不斷增加，在60 ℃時達(dá)到最大值，隨著提取溫度繼續(xù)升高，提取出的甲醛含量不斷減少，可能是溫度升高導(dǎo)致部分甲醛隨水蒸氣揮發(fā)而損失，所以選擇60 ℃為較佳提取溫度（圖5C）。隨著超聲波提取次數(shù)的增加，3 種樣品中提取出的甲醛含量基本保持恒定，但測得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差逐漸增大，原因是提取液稀釋倍數(shù)過大導(dǎo)致儀器檢測結(jié)果不穩(wěn)定，所以超聲波提取次數(shù)對提取效果沒有影響，超聲波提取1 次即可有效提取出樣品中的甲醛（圖5D）。

圖5 超聲波條件對甲醛提取效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction conditions on the extraction efficiency of formaldehyde

表4 超聲波提取條件的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果L9（34）Table4 Orthogonal array design L9(34) with experimental results for the optimization of ultrasound extraction conditions

由表4可得，超聲波提取法的最優(yōu)提取條件為A2B2C2，即提取時間30 min、超聲波功率80 W、提取溫度60 ℃。觀察表中3 個因素的極差大小，提取時間和超聲波功率為主要影響因素，提取溫度為次要影響因素。由于正交試驗(yàn)中并未設(shè)置A2B2C2這個條件，所以做一組驗(yàn)證試驗(yàn)，測得該條件下甲醛含量為2.40 mg/kg，比表中所有試驗(yàn)組測得的甲醛含量都高，所以超聲波提取法最佳提取條件為提取溫度60 ℃、超聲波功率80 W、提取時間30 min。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 顏色干擾實(shí)驗(yàn)

表5 不同顏色對甲醛-五氟苯肼衍生液相色譜法檢測結(jié)果的影響Table5 Effect of different colorants on the results of determination of pentafluorophenylhydrazine-formaldehyde derivative by HPLC

由表5可知，經(jīng)過添加莧菜紅、肼黃和靛藍(lán)3 種顏色，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液和白蘿卜樣品溶液中測得的衍生物峰面積與未加色素測得的衍生物峰面積均無顯著差異（P＞0.05），說明顏色對衍生物的生成量沒有影響，即果蔬樣品的顏色對檢測結(jié)果無影響，所以用五氟苯肼衍生液相色譜法前處理過程中不需要進(jìn)行脫色處理。

2.4.2 衍生物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6可知，當(dāng)甲醛-五氟苯肼衍生物放置10 h后，測得3 種質(zhì)量濃度條件下的峰面積有少許減少，隨著放置時間繼續(xù)延長，減少的趨勢更為明顯，說明放置10 h后，甲醛-五氟苯肼衍生物會發(fā)生少量分解，所以顯色處理過后的樣品需在10 h以內(nèi)完成檢測，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖6 衍生物穩(wěn)定性隨時間變化曲線Fig.6 Temporal stability of entafluorophenylhydrazineformaldehyde derivative

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及方法的檢測限

按1.3.8節(jié)步驟處理，得到方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=302.96x+4.755 9，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 8，在0.114～57 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定推算樣品的定量檢測限為0.114 mg/kg。

2.4.4 五氟苯肼法和SN/T 1547—2011法的回收率和精密度對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 不同樣品中甲醛的回收率和精密度（n=6）Table6 Recovery rates and precision of formaldehyde in different samples (n= 6)

由表6可知，當(dāng)樣品中甲醛的添加量為1.14 mg/kg時，回收率為82.6%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～5.0%，添加量為8.55 mg/kg時，回收率為81.5%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～4.9%，添加量為17.10 mg/kg時，回收率為81.4%～97.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～4.4%。在3 個不同添加水平下，回收率平均為81.4%～101.8%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～5.0%。而SN/T 1547—2011中的2,4-二硝基苯肼衍生液相色譜法在3 個不同添加水平下的

回收率為74.8%～96.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～8.8%。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)衍生劑2,4-二硝基苯肼與甲醛的衍生物2,4-二硝基苯腙易溶于極性較小的二氯甲烷等有機(jī)溶劑，在水中會結(jié)晶析出，SNT 1547—2011法通過加入乙腈和改變?nèi)芤簆H值可以在一定程度上增加其在水中的溶解度，但穩(wěn)定性差，而甲醛-五氟苯肼的衍生物在水中不會結(jié)晶，可以將提取和衍生同時進(jìn)行，進(jìn)一步縮短前處理的時間，優(yōu)化前處理步驟，提高方法的精密度。

3 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，甲醛-五氟苯肼衍生物可以通過液相色譜法檢測，優(yōu)化的色譜條件為XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、流動相乙腈-水（70∶30，V/V），流速1.0 mL/min、柱溫40 ℃，檢測波長258 nm。最佳提取衍生條件為反應(yīng)溫度60 ℃，五氟苯肼衍生劑加入量0.3 mg/mL，超聲波提取30 min。該方法的定量檢測限為0.114 mg/kg，在0.114～57 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。當(dāng)甲醛添加量分別為1.14、8.55、17.10 mg/kg時，平均回收率為81.4%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～5.0%（n=6）。

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Determination of Formaldehyde in Fruits and Vegetables by HPLC

LI Jun1,2, LIU Yongxiang2, WANG Hui1,2, LIU Jia1,2, LIU Hui2, KAN Jianquan1,*

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Biological Technology Institute of Guizhou Province, Guiyang 550006, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was used to determine formaldehyde in fruits and vegetables by formaldehyde derivation with pentafluorophenylhydrazine (PFPH). Samples were extracted and derived at 70 ℃ with ultrasonicaction for 30 min. After completion of the reaction, centrifugation was carried out and the supernatant was purified and analyzed by HPLC. The quantitation was performed using the external standard method. The separation was performed on an XDB-C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) in an isocratic elution mode using a mobile phase consisting of acetonitrile and water (70:30, V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was 258 nm. The results showed that the limit of quantification (LOQ) of the presented method was 0.114 mg/kg, with a good linear relationship in the range of 0.114–57 mg/L. The average recovery rates at three spiked levels were 81.4%–101.8%, with relative standard derivation (RSD) of 2.6%–5.0% (n = 6). The method was simple, sTableand suiTablefor the determination of formaldehyde in fruits and vegetables with a low limit of detection (LOD).

fruits and vegetables; formaldehyde; HPLC; pentafluorophenylhydrazine

10.7506/spkx1002-6630-201622030

TS255.7

A

1002-6630（2016）22-0198-07

李俊, 劉永翔, 王輝, 等. 高效液相色譜法定量測定果蔬中甲醛含量[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 198-204. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201622030. http://www.spkx.net.cn

LI Jun, LIU Yongxiang,WANG Hui, et al. Determination of formaldehyde in fruits and vegetables by HPLC[J]. Food Science, 2016, 37(22): 198-204. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622030. http://www.spkx.net.cn

2016-04-10

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部財政專項（GJFP201501201）

李?。?990—），男，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：lijunsjs2015@163.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：kanjianquan@163.com