吳沅沅,賀 超,洪 廣,吳靜嫻,勞鍵潼,李廣麗,陳華譜,黃 海

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088;2.海南熱帶海洋學(xué)院， 海南 三亞 572022)

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泰國斗魚神經(jīng)肽Y基因的克隆及組織表達(dá)研究

吳沅沅1,賀 超1,洪 廣1,吳靜嫻1,勞鍵潼1,李廣麗1,陳華譜1,黃 海2

(1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088;2.海南熱帶海洋學(xué)院， 海南 三亞 572022)

利用Smart-RACE的方法,從泰國斗魚(Betta splendens)腦中克隆得到了神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y,NPY)的cDNA全長序列.泰國斗魚NPY基因的 cDNA序列為506bp,其中開放讀碼框300bp,編碼99個(gè)氨基酸.氨基酸比對(duì)分析顯示NPY成熟肽的氨基酸序列較保守.通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,泰國斗魚NPY與鱸形目鱸魚等的親緣關(guān)系最近,但魚類的NPY分子進(jìn)化分為兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支,顯示出獨(dú)特的特點(diǎn).利用RT-PCR進(jìn)行泰國斗魚雌雄個(gè)體的組織分布分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰國斗魚NPY mRNA的主要在腦中高表達(dá),并顯示出明顯的組織特異性及性別差異性.本研究為開展NPY分子進(jìn)化及后續(xù)的功能研究提供了研究基礎(chǔ).

泰國斗魚;神經(jīng)肽Y;序列分析;組織分布

0 引言

神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y,NPY)由36個(gè)氨基酸殘基組成,并在進(jìn)化上十分保守.胰多肽家族除了NPY外,還包括神經(jīng)肽YY(PYY)、四足動(dòng)物的胰多肽(PP)和魚胰多肽Y等[1].目前,NPY已經(jīng)在眾多脊椎動(dòng)物中開展了生理功能的研究,并證實(shí)其在攝食、能量代謝、生殖調(diào)控、生殖行為、血壓調(diào)節(jié)、交感神經(jīng)和節(jié)律調(diào)節(jié)中具有重要的生理功能[2-4].其中NPY在攝食與能量代謝中的生理功能最受關(guān)注,被認(rèn)為是上游攝食神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控的主導(dǎo)因子之一,發(fā)揮著促進(jìn)攝食的關(guān)鍵性作用[5].

魚類是種類最多的脊椎動(dòng)物群體,并逐漸成為生理研究的重要研究對(duì)象.目前,NPY基因已經(jīng)在金魚[6],虹鱒[7],石斑魚[8],羅非魚[9],鱖魚[10],大西洋鱈[11]、象鯊魚[12]、鰻鱺[13]和牙鲆[14]等魚類中克隆鑒定出來,并展開了組織分布相關(guān)的研究.在眾多的結(jié)果中發(fā)現(xiàn),NPY主要分布在腦中,外周組織中也有分布,但存在著物種間的差異性.例如,在鱖魚中,NPY在腦中的表達(dá)最高,其次為腎臟和肝臟,而其他組織表達(dá)量相對(duì)較低[10].在斜帶石斑魚中,NPY除了在腦中高表達(dá)外,在眼睛、胸腺、胃和卵巢等外周組織中的表達(dá)量也較高[8];在鰻鱺中,NPY除了在腦中高表達(dá)外,性腺和腸的表達(dá)量也較高,而脾臟和胃的表達(dá)量較低[13];在牙鲆中,只在腦中檢測到NPY的表達(dá)[14].從中可看出,作為神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控因子的NPY 主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,而在外周組織中的分布具有明顯的物種差異性.這可能是由于魚類的種類繁多,生理特性具有多樣性,從而導(dǎo)致不同魚類之間的NPY的表達(dá)分布存在著差異,因此,為了更好地了解魚類NPY的生理功能,還需要在更多的魚類中開展進(jìn)一步的研究.

泰國斗魚(Betta splendens)是一種小型熱帶淡水觀賞魚類,因其色彩艷麗、體形多姿,容易飼養(yǎng),備受眾多消費(fèi)者青睞.但目前對(duì)泰國斗魚研究尚少,關(guān)于它的內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)理尚未清楚.本文以泰國斗魚為研究對(duì)象,利用現(xiàn)代分子克隆技術(shù)手段,克隆鑒定出神經(jīng)肽Y的cDNA序列,并開展了序列分析及組織分布研究,為探討NPY基因在泰國斗魚中的生理功能提供研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)中所用到的泰國斗魚購買于廣東省湛江市霞山區(qū)花鳥市場,經(jīng)冰上深度麻醉處理后,將其腦、性腺、垂體、心臟、肌肉、肝、腎、脾、腸等組織器官取出,并立即置于液氮保存,用于總RNA提取.

1.2試劑

總RNA提取試劑使用的Trizol Reagent(Life, USA); 去除基因組DNA用的DNaseⅠ和反轉(zhuǎn)錄用的The ReverTra Ace-、腎、脾、腸等組織器官取出神經(jīng)和節(jié)律調(diào)節(jié)中具有重要的生理功能it試劑盒(TOYOBO,Japan);基因克隆的Smart-RACE試劑盒(Takara,Japan);Taq酶和載體pTZ7R/T購于中國天根公司;質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒為中國東盛公司產(chǎn)品, 其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.3引物

通過NCBI 基因庫的序列搜索,獲得其他相近魚類NPY基因cDNA序列.通過比對(duì)分析,根據(jù)保守序列,設(shè)計(jì)出用于泰國斗魚NPY基因的SMART-RACE 克隆的引物.

表1 泰國斗魚NPY基因的克隆與定量分析中所用到的引物

1.4總RNA提取

根據(jù)TrizolGCACAGTGT試劑盒(Life, USA)說明書的要求操作,利用注射器將各組織搗碎勻漿.提取總RNA后利用核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度與完整度的檢測.

1.5分子克隆

利用泰國斗魚全腦的總RNA作為模板,根據(jù)Smart-RCAE 試劑盒(Takara,Japan)的操作步驟,合成NPY基因5因端和3和端的第一鏈cDNA,通過序列重合來拼接,獲得cDNA序列全長. 然后設(shè)計(jì)開放閱讀框全長設(shè)計(jì)全長特異引物進(jìn)行全長驗(yàn)證.

1.6序列分析

利用DNAtools 6.0 軟件預(yù)測出泰國斗魚NPY基因的開放讀碼框(Open Reading Frame, ORF),并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列.用NCBI blast比對(duì)軟件對(duì)不同脊椎動(dòng)物的NPY蛋白前體序列進(jìn)行同源性分析.利用SignalIP 3.0 網(wǎng)站上預(yù)測基因的信號(hào)肽.clustalx 1.8和Mega 4.0的軟件構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹[15-16].

1.7 組織分布

取泰國斗魚各組織的總RNA 1 ug,根據(jù)DNaseⅠ的使用方法,先去除基因組DNA,然后按照First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α(TOYOBO, Japan)的說明書進(jìn)行合成第一鏈cDNA模板.利用泰國斗魚NPY基因的特異引物(圖1),并以β以的特異引物基因作為內(nèi)參進(jìn)行組織分布的半定量檢測.反應(yīng)體系為25 μ5,循環(huán)反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,40個(gè)循環(huán),、72℃延伸1 min,取8in的pcr產(chǎn)物,進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,天能Tanon2500R凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照與半定量分析.

圖1 泰國斗魚NPY基因的cDNA序列及其氨基酸序列

2 結(jié)果

2.1泰國斗魚NPY基因的全長cDNA序列

如圖1所示,利用Smart-Race分子克隆技術(shù),從泰國斗魚的腦組織中克隆獲得泰國斗魚NPY基因cDNA全長序列為506 bp,其中5中非編碼區(qū)36 bp,3p非編碼區(qū)170 bp,開放閱讀框(ORF) 300 bp,編碼了含有99個(gè)氨基酸的前體蛋白,其N端為含有28個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,信號(hào)肽之后是含有36個(gè)氨基酸殘基的NPY成熟肽.

圖2 不同脊椎動(dòng)物NPY蛋白前體的氨基酸序列比對(duì)

起始密碼子和終止密碼子用方框標(biāo)示;前體蛋白信號(hào)肽用下劃線表示;NPY的36個(gè)氨基酸成熟肽序列用粗體與灰色背景表示.

2.2泰國斗魚NPY的氨基酸序列比對(duì)及同源性分析

不同物種的NPY氨基酸序列比對(duì)分析顯示,不僅各物種NPY蛋白前體的氨基酸殘基數(shù)目相似,而且NPY成熟肽的氨基酸序列從低等的魚類到高等的人類都具有很高的保守性(圖2).

泰國斗魚NPY蛋白前體的氨基酸序列與其他物種的NPY序列進(jìn)行同源性分析顯示,泰國斗魚NPY與鱸魚NPY的氨基酸同源性最高,達(dá)到97%;與羅非魚和青鱂的同源性分別達(dá)到94%和92%;與雞、小鼠和人的同源性均達(dá)到70%以上,但與斑馬魚、金魚和中華倒刺鲃等少數(shù)魚類的同源性只有60%左右(表2).

NCBI數(shù)據(jù)庫中各魚類NPY蛋白前體序列的登陸號(hào)分別為:nDic(鱸魚):CAB64932.1;nRac(軍曹魚):AGN03939.1;nSer(鰤魚):BAN10296;nEpi(斜帶石斑魚):AAT48713.1;nPse(美洲擬鰈):ACH42755.1;nChe(波紋唇魚):AJP08708.1;nPoe(多育苔花鳉):JAO59368.1;nSin (鱖魚):ABS83815.1;nMon(黃鱔):AEX97166.1;nGad(大西洋鱈):ABB79923.1;nLeu (蝦虎魚):BAK09590.2;nHom (人類):NP _000896.1;nRat(褐家鼠):NP_036746.1;nGal(雞):NP_990804.1;nCar(銀鯽):AFB69326.1;nSpi(中華倒刺鲃):ABE73783.1;nCte(草魚):AGI44276.1;nMyx(胭脂魚):ABQ53144.1;nDan(斑馬魚):AAI62071.1;nTac(黃顙魚):AGM46557.1;下劃線部分為NPY 成熟肽.

表2 泰國斗魚NPY蛋白前體與 其他物種NPY蛋白前體的同源性分析物種同源性(%)鱸魚97羅非魚94日本青鱂92斑馬魚63金魚64中華倒刺鲃65雞72小鼠73人類72

2.3 泰國斗魚NPY 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用鄰接法構(gòu)建泰國斗魚等脊椎動(dòng)物NPY 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果顯示，魚類的NPY蛋白分為明顯的兩個(gè)進(jìn)化分支:一支是由泰國斗魚、鱸魚、軍曹魚和斜帶石斑魚等絕大多數(shù)魚類組成,并與雞、小鼠和人類等高等脊椎動(dòng)物相聚類;另一支由斑馬魚、金魚和黃顙魚等魚類組成,并獨(dú)立于泰國斗魚和人類等物種的聚類.根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹,泰國斗魚的NPY與鱸魚和軍曹魚的親緣關(guān)系較近,但與斑馬魚、金魚和黃顙魚等魚類的進(jìn)化親緣關(guān)系較遠(yuǎn),甚至比人類的親緣關(guān)系還要遠(yuǎn).

圖3 不同脊椎動(dòng)物NPY的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)樹中結(jié)點(diǎn)處數(shù)值代表10,000次評(píng)估的自舉檢驗(yàn)置信度.各物種的NPY蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫中登陸號(hào)分別為:Dicentrarchuslabrax(鱸魚):CAB64932.1;Rachycentroncanadum(軍曹魚):AGN03939.1;Seriolaquinqueradiata(鰤魚):BAN10296.1;Poeciliopsisprolifica(多育若花鳉):JAO59368.1;Lateolabraxjaponicus(花鱸):AIK01745.1;Epinepheluscoioides(斜帶石斑魚):AAT48713.1;Cheilinusundulatus(波紋唇魚):AJP08708.1;Pseudopleuronectesamericanus(美洲擬鰈):ACH42755.1;Sinipercachuatsi(鱖魚):ABS83815.1;Monopterusalbus(黃鱔):AEX97166.1;Micropterussalmoides(加州鱸):ALC04308.1;Gadusmorhua(大西洋鱈):ABB79923.1;Leucopsarionpetersii(蝦虎魚):BAK09590.2;Gallusgallus(雞):NP_990804.1;Homosapiens(人類):NP_000896.1;Rattusnorvegicus(褐家鼠):NP_036746.1;Tachysurusfulvidraco(黃顙魚):AGM46557.1;Myxocyprinusasiaticus(胭脂魚):ABQ53144.1;Daniorerio(斑馬魚):AAI62071.1;Ctenopharyngodonidella(草魚):AGI44276.1;Carassiusgibelio(銀鯽):AFB69326.1;Spinibarbussinensis(中華倒刺鲃):ABE73783.1.2.4泰國斗魚NPY基因的組織分布

利用RT-PCR半定量的方法分析NPY基因在泰國斗魚雌雄個(gè)體不同組織中的表達(dá)情況.在雌性中,NPY在腦中的表達(dá)量最高,其次是腎臟、垂體、肝臟和性腺,而在胃、心臟、肌肉和腸中均未檢測到表達(dá)信號(hào).在雄性中,NPY在腦中的表達(dá)量最高,其次是垂體和性腺,而在肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌肉和腸中均沒有檢測到表達(dá)信號(hào).

B為全腦,P為垂體,L為肝臟,Go為性腺,K為腎臟,S為脾臟,H為心臟,M為肌肉,I為腸.β腸肉組織中的基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照.

3 討論

NPY蛋白前體從低等的魚類到高等的人類中,蛋白前體序列的長度與大小相似,并在N端具有與蛋白分泌相關(guān)的信號(hào)肽序列,屬于典型的分泌型蛋白[17].本研究利用現(xiàn)代分子克隆技術(shù)獲得泰國斗魚NPY基因的cDNA序列全長,并進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明泰國斗魚NPY成熟肽和其他物種的NPY成熟肽一樣,均由36個(gè)氨基酸殘基組成[5-14],并保持著較高的序列同源性,顯示出保守的結(jié)構(gòu)特征,從而預(yù)示著泰國斗魚NPY和其他物種的一樣,具有保守的生理功能[1-3].

圖4 泰國斗魚NPY mRNA在不同組織中的表達(dá)情況

NPY蛋白前體的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,NPY分子進(jìn)化具有獨(dú)特之處.泰國斗魚與鱸魚等的同源性均達(dá)到90%以上,但與斑馬魚、金魚和黃顙魚等部分魚類的同源性較低,甚至低于與高等哺乳動(dòng)物的同源性,顯示出魚類NPY分子進(jìn)化的差異[18-19].另外,通過分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)魚類的NPY分子在進(jìn)化上分成了兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化分支.泰國斗魚、鱸魚等魚類與人類的親緣關(guān)系比與斑馬魚的還要近.如此顯著的進(jìn)化差異與通常的物種進(jìn)化地位不相符[20].根據(jù)同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果,本文克隆獲得的泰國斗魚NPY序列與其他絕大多數(shù)物種(包括低等到高等脊椎動(dòng)物)相聚類,應(yīng)屬于傳統(tǒng)的NPY家族成員.但在斑馬魚等魚類的另一個(gè)分支中,同樣含有高保守的36個(gè)氨基酸NPY成熟肽,也符合NPY家族成員的特征.因此,在脊椎動(dòng)物中可能存在兩種NPY亞型,但由于在物種進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因的缺失而導(dǎo)致NPY亞型的丟失.造成不同物種的NPY在同源性和進(jìn)化上顯示出了明顯的差異,這與在建鯉魚中的推論相一致[21].

在泰國斗魚中,NPY基因具有顯著的組織表達(dá)特異性,預(yù)示NPY在不同組織中發(fā)揮著不同的生理功能[3-4].同時(shí),NPY也顯示出性別表達(dá)差異,從而表明NPY在雌雄個(gè)體中的功能差異,這與鰻鱺等魚類的研究結(jié)果相似[13].泰國斗魚NPY基因在腦中的表達(dá)量最高,與其他物種的NPY表達(dá)情況相一致[10-14],表明NPY在發(fā)揮上游神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控功能上的保守性.NPY在魚類腦中的高表達(dá)是共性,但在其他組織中的表達(dá)情況卻存在種間差異.在鱖魚中,NPY在腦中表達(dá)最高,其次為腎臟和肝臟,其他組織表達(dá)量相對(duì)較低[10].在斜帶石斑魚中,NPY除腦組織外,在眼睛、胸腺、胃和卵巢等組織中同樣具有較高的表達(dá)量[8];在鰻鱺中,NPY在腦、性腺和腸的表達(dá)量較高,而脾臟和胃的表達(dá)量較低[13].不同魚類NPY的表達(dá)差異性說明了NPY除了在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控上具有重要作用外,還可能發(fā)揮著其他生理功能,其作用機(jī)制還有待深入研究.

本文從泰國斗魚中克隆鑒定出NPY基因的cDNA序列全長,并進(jìn)行序列分析及其在雌雄個(gè)體不同組織中的分布研究,結(jié)果表明泰國斗魚NPY具有保守的結(jié)構(gòu)特征,其組織表達(dá)具有顯著的組織表達(dá)特異性及性別差異性,這為深入探討NPY基因的分子進(jìn)化及生理功能提供了初步的研究基礎(chǔ).

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(編校：李由明)

Molecular Cloning and Tissue Expression of Neuropeptide Y in Thailand Betta,Bettasplendens

WU Yuan-yuan1, HE Chao1, HONG Guang1,WU Jing-xian1,LAO Jian-tong1, LI Guang-li1, CHEN Hua-pu1, HUANG Hai2

(1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang Guangdong 524088, China; 2.Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China )

The cDNA sequences of Thailand betta(Bettasplendens) neuropeptide Y (NPY) were cloned with the rapid-amplification of cDNA ends (RACE). The NPY cDNA sequence contains 506 bp nucleotides with the open reading frame (ORF) of 300 bp, encoding a putative protein of 99 amino-acid residues. The sequence alignment shows low similarity in the NPY precursor proteins among vertebrates, but is highly conservative in the NPY mature peptide domains. According to the phylogenetic analysis, the Thailand betta NPY was more closely related to other perciformes fishes, while the molecular evolution of fish NPY develops into two distinct branches. Tissue distribution analysis by RT-PCR revealed that the Thailand betta NPY showed the evident tissue-specific profiles in both male and female. The preliminary information is provided by the present study for the molecular evolution and functional study of NPY.

bettasplendens; neuropeptide Y; sequence analysis; tissue distribution

2016-09-27

海南省科技合作專項(xiàng)(KJHZ2015-08);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A201408A06);廣東海洋大學(xué)“海之帆—起航計(jì)劃”大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)(hzfqhjhzrkx2015b15)

陳華譜(1983-),男,廣東湛江人,廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院講師,博士,研究方向?yàn)轸~類生理與繁殖.

S917.4

A

1008-6722(2016) 05-0011-06

10.13307/j.issn.1008-6722.2016.05.03