李耀國(guó),孫 彤,張雅劍,鞏建豪

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院， 海南 三亞 572022)

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5-氮雜胞苷對(duì)馬氏珠母貝早期發(fā)育的影響

李耀國(guó),孫 彤,張雅劍,鞏建豪

(海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院， 海南 三亞 572022)

為了解5-氮雜胞苷對(duì)馬氏珠母貝早期發(fā)育的影響,該研究檢測(cè)并分析了其對(duì)早期發(fā)育階段甲基化水平和礦化基因表達(dá)的影響. 結(jié)果顯示5-氮雜胞苷處理可引發(fā)基因組甲基化水平顯著降低. 5-氮雜胞苷處理亦使DNMT3的表達(dá)量低于海水處理組,而礦化基因nacrein的表達(dá)量高于海水處理組.DNMT3和nacrein的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(R2=0.755,P=0.000). 基因組甲基化水平的改變可能是調(diào)控生物礦化過(guò)程的重要因素.

馬氏珠母貝;去甲基化試劑;早期發(fā)育;甲基化水平;生物礦化

0 引言

生物體的表型變化主要由DNA序列的變異引起,除了常見的A、T、C、G 四個(gè)脫氧堿基的變異外,一種表觀遺傳DNA甲基化修飾引起了科研工作者的廣泛關(guān)注.這種DNA甲基化修飾表現(xiàn)為甲基化轉(zhuǎn)移酶將序列中胞嘧啶加上一個(gè)甲基基團(tuán),使胞嘧啶成為“5-甲基胞嘧啶”[1].5-甲基胞嘧啶主要發(fā)生在“CpG” 二核苷酸或者其它類型位點(diǎn)如“GpC”中的胞嘧啶上[2-3].動(dòng)物中胞嘧啶甲基化在非編碼DNA區(qū)域(內(nèi)含子、重復(fù)元件和活性轉(zhuǎn)座子元件)的失活中起到重要作用,并能通過(guò)引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變來(lái)影響基因表達(dá),是大多數(shù)生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少的一部分[4].

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP,methylation sensitive amplification polymorphism)是一種可對(duì)基因組 “5′-CCGG-3′”位點(diǎn)胞嘧啶甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)的常用方法. 其原理主要是根據(jù)HpaII和MspI這兩種同裂酶對(duì)基因組“5′-CCGG-3′”雙鏈位點(diǎn)中胞嘧啶甲基化狀態(tài)不同而具不同酶切活性,可比較不同酶切反應(yīng)對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物的電泳圖譜來(lái)分析樣品甲基化狀況.HpaII酶可以酶切“5′-CCGG-3′”單鏈外部胞嘧啶甲基化序列,而MspI酶可以酶切“5′-CCGG-3′”雙鏈內(nèi)部胞嘧啶甲基化序列[5].MSAP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組甲基化水平檢測(cè),DNA甲基化與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)聯(lián)分析[6]以及DNA甲基化與生物抗性的關(guān)系分析等[7].

多數(shù)非脊椎動(dòng)物甲基化在基因組中的分布呈一種“鑲嵌模型”,即甲基化修飾的“CpG”位點(diǎn)散布于整個(gè)基因組中[8].其中雙殼貝類DNA甲基化主要存在于基因內(nèi)含子及外顯子上[9],基因的DNA甲基化與其表達(dá)調(diào)節(jié)相關(guān),其中免疫相關(guān)基因常呈現(xiàn)出點(diǎn)綴分布的甲基化狀態(tài)[10].貝類甲基化的研究報(bào)道較少,主要集中于太平洋牡蠣和馬氏珠母貝兩個(gè)物種中. 太平洋牡蠣甲基化的基因與基因高轉(zhuǎn)錄豐度及組織間低表達(dá)變異存在關(guān)聯(lián),同源盒型基因的甲基化可使基因表達(dá)水平下降,DNA甲基化與基因組具有一定關(guān)聯(lián)性并對(duì)早期發(fā)育產(chǎn)生影響[9-12].馬氏珠母貝(Pinctadafucata)是廣泛分布于中國(guó)廣東、廣西、海南省及日本沿海的具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珍珠貝. 其組織甲基化水平范圍為11.71至14.71%,免疫相關(guān)基因galectin啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與基因的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān),而基因組甲基化水平與galectin基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[13-14].目前對(duì)馬氏珠母貝DNA甲基化的研究主要集中于對(duì)其基因組及基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè)及分析,尚未見人工主動(dòng)改變基因組甲基化水平對(duì)其早期胚胎發(fā)育及基因表達(dá)影響的研究報(bào)道.

該研究利用MSAP技術(shù)檢測(cè)DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜胞苷處理對(duì)馬氏珠母貝早期發(fā)育階段基因組甲基化水平的影響,比較處理后甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DNMT3及礦化基因nacrein的表達(dá)水平變化,并對(duì)基因表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了分析.目的在于獲得人工主動(dòng)去甲基化對(duì)馬氏珠母貝早期發(fā)育影響的直接證據(jù),并為深入探討DNA甲基化在貝類生長(zhǎng)發(fā)育、生物礦化中的作用提供科學(xué)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣品采集和核酸提取

該研究所用2齡馬氏珠母貝個(gè)體從中國(guó)科學(xué)院大亞灣海洋生物綜合實(shí)驗(yàn)站(深圳)采集,作為育種親貝在海水池中暫養(yǎng).通過(guò)解剖觀察判斷親本雌、雄性別后,設(shè)立3組馬氏珠母貝雌、雄親本單對(duì)配對(duì)的人工授精實(shí)驗(yàn). 分別將每組單對(duì)配對(duì)親本產(chǎn)生的精子和卵細(xì)胞進(jìn)行混合以形成受精卵.每對(duì)單對(duì)配對(duì)親本的受精卵分成兩部分:對(duì)照組(采用滅菌海水浸泡處理)及實(shí)驗(yàn)組(采用10-5mol L-15-氮雜胞苷溶液浸泡處理). 分別對(duì)所有三組單對(duì)配對(duì)實(shí)驗(yàn)中受精卵、二細(xì)胞期、桑葚期胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲進(jìn)行顯微觀察及樣品采集(包含殼頂幼蟲). 采集的樣品保存于核酸保護(hù)液中.樣品基因組DNA和RNA的提取按照廣州美基公司的核酸提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作.提取后的核酸稀釋于超純水中,核酸的完整性和濃度分別通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop分光光度計(jì)OD260/280值進(jìn)行分析,于-80°C保存待用.

1.2 MSAP技術(shù)檢測(cè)早期發(fā)育階段甲基化水平

利用MSAP技術(shù)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組受精卵、二細(xì)胞期、桑葚期胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲和殼頂幼蟲樣品的基因組甲基化水平進(jìn)行檢測(cè). 具體步驟如下:雙酶切反應(yīng),利用EcoRI和HpaII,EcoRI和MspI酶組合分別對(duì)源自同一樣品的兩份DNA進(jìn)行37 ℃下酶切6 h.酶切后經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析酶切完全性.引物接頭的生成及連接:等體積的10 pmol/μL EcoRI接頭F引物及10 pmol/μL EcoRI 接頭R引物混合后退火形成EcoRI接頭；等體積的50 pmol/μL HM 接頭F引物及50 pmol/μL HM 接頭R引物混合后退火形成HM 接頭.其中退火程序:65 ℃,15 min；37 ℃,15 min；20 ℃,15 min；最后置于冰水混合物15 min.酶切產(chǎn)物與引物接頭的連接:2 μL雙酶切產(chǎn)物,50 pmol HM 接頭,10 pmol EcoRI接頭,T4 DNA 連接酶(350U/μL)0.2 μL,4 μL 10 × T4 DNA 連接緩沖液,加ddH2O至總體積為20 μL,16℃連接過(guò)夜.連接產(chǎn)物稀釋10倍后作為預(yù)擴(kuò)增模板.預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)和選擇擴(kuò)增反應(yīng):預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系設(shè)置為20 μL:包括10.5 μL Premix Ex Taq(Takara,大連),1 μL稀釋10倍后的連接產(chǎn)物,1μL 的20 pmol/μL引物EcoR+A,1μL 的20 pmol/μL引物HM +T,加ddH2O 6.5 μL.PCR程序?yàn)?4 ℃ 5 min；20個(gè)循環(huán)的94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 5 min,得到預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物. 選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系包括10.5 μL Premix Ex Taq,1 μL稀釋10倍后的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物,0.5 μL的20 pmol/μL的選擇擴(kuò)增引物E+3,2 μL 的20 pmol/μL的選擇擴(kuò)增引物HM+3(3為堿基數(shù))所用引物組合為(Eco+ATA,HM+TCT；Eco+ATA,HM+TCA；Eco+ATC,HM+TCT；Eco+ATC,HM+TCA),加ddH2O 6 μL. 反應(yīng)程序分兩步:第一步為13個(gè)循環(huán)的94 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.7 ℃,直至56 ℃.第二步為27個(gè)循環(huán)的94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min；最后72℃ 5 min.上述引物序列基于Xiong等[15]研究設(shè)計(jì),接頭引物及擴(kuò)增引物序列見表1,由華大基因廣州分公司合成.

1.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測(cè)

將選擇擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與甲酰胺變性上樣緩沖液按體積比3∶1混合, 95 ℃加熱10 min后置冰上迅速冷卻. 每管取3 μL上樣于8% SDS-PAGE凝膠,200 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示帶到達(dá)凝膠底部. 將SDS-PAGE凝膠小心取下放入雙蒸水漂洗后進(jìn)行銀染顯色并拍照記錄.根據(jù)MSAP擴(kuò)增條帶可分析四種甲基化情況:(1)MspI酶和HpaII酶對(duì)應(yīng)的電泳泳道同一位置存在大小相同的條帶,為“5′-CCGG-3′”雙鏈序列胞嘧啶無(wú)甲基化位點(diǎn)(Type I 位點(diǎn)).(2)在HpaII酶對(duì)應(yīng)泳道有一條擴(kuò)增條帶而在MspI酶泳道相應(yīng)位置無(wú)條帶，為“5'-CCGG-3'”單鏈序列外部胞嘧啶甲基化位點(diǎn)(Type II 位點(diǎn)).(3)在MspI酶對(duì)應(yīng)泳道具有一條擴(kuò)增條帶而在HpaII酶泳道的相應(yīng)位置無(wú)條帶，為“5'-CCGG-3'”的雙鏈序列內(nèi)部胞嘧啶甲基化位點(diǎn)(Type III 位點(diǎn))[16].(4)在MspI對(duì)應(yīng)的電泳泳道及HpaII對(duì)應(yīng)泳道的同一位置均無(wú)條帶，而其它樣品在該位置具有條帶，為雙鏈“5'-CCGG-3'”全甲基化位點(diǎn)(Type IV 位點(diǎn))[17].DNA 甲基化水平的計(jì)算: DNA甲基化水平(%)=總甲基化位點(diǎn)數(shù)/(Type I + Type II+ Type III + Type IV 位點(diǎn)數(shù)).其中總甲基化位點(diǎn)數(shù)為Type II、Type III、Type IV 位點(diǎn)數(shù)之和.

表1 MSAP分析及熒光定量所用載體及引物序列引物及載體名稱引物序列(5'-3')EcoRI接頭FCTCGTAGACTGCGTACCEcoRI接頭RAATTGGTACGCAGTCTACHpaII-MspI接頭FGATCATGAGTCCTGCTHpaII-MspI接頭RCGAGCAGGACTCATGAEco+AGACTGCGTACCAATTCAHM+TATCATGAGTCCTGCTCGGTEco+ATAGACTGCGTACCAATTCATAEco+ATCGACTGCGTACCAATTCATCHM+TCTATCATGAGTCCTGCTCGGTCTHM+TCATCATGAGTCCTGCTCGGTCADNMT3FGGACCACCTTCACAGAAACTCDNMT3RTGCGGAAAAACTCAAAAAACAnacreinFACCAGACGTAAGGGATCAGAAnacreinRATCGTTATGACCAGGGAATG18sFACACCGCCCGTCGCTACTAC18sRCGCCCTTCTTCTCGGCACAC

1.4 熒光定量檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

利用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DNMT3、生物礦化基因nacrein 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè).步驟如下: 利用Primer Primier 5.0 軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)熒光定量引物(DNMT3F和DNMT3R以及nacrein F 和nacrein R).PCR 反應(yīng)在Roche LightCycler480 熱循環(huán)儀中進(jìn)行，體系如下: 5 μL 2 × SYBR Premix ExTaqTM，1 μL模板cDNA,熒光定量引物各0.4 μL(10 μM),加 3.2 μL去離子水至總體積為10 μL. PCR反應(yīng)程序:95°C 1 min,45 個(gè)循環(huán)的95°C 5 s,55°C 15 s,72°C 60 s. 選用的參考基因?yàn)?8S (Genebank登錄號(hào):AY028625.1),引物對(duì)應(yīng)為18s F和18s R[14].基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)Ct方法 (2-△△Ct 方法)計(jì)算.馬氏珠母貝5-氮雜胞苷實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基因相對(duì)表達(dá)量比較,各發(fā)育時(shí)期間的基因組甲基化水平比較、相關(guān)性分析均通過(guò)SPSS19.0 軟件進(jìn)行,顯著性水平設(shè)置為P<0.05.

2 結(jié)果

2.1 早期發(fā)育胚胎觀察

圖1 馬氏珠母貝各早期發(fā)育階段

對(duì)馬氏珠母貝各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組早期發(fā)育狀況進(jìn)行了顯微觀察及拍照,結(jié)果如下圖1所示.其中受精卵為精子與卵細(xì)胞混合后約15分鐘形成,隨后排出第一和第二極體. 從二細(xì)胞期至囊胚期主要體現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增多.當(dāng)馬氏珠母貝早期胚胎發(fā)育至D型幼蟲期時(shí),其外型呈較明顯的“D”型. 比較對(duì)照組(滅菌海水處理)和實(shí)驗(yàn)組(10-5mol L-15-氮雜胞苷溶液處理)的早期發(fā)育胚胎發(fā)現(xiàn)兩組之間并不存在明顯的形態(tài)差異. 2.2 早期發(fā)育DNA甲基化水平檢測(cè)

利用MSAP技術(shù)對(duì)馬氏珠母貝各單對(duì)配對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的受精卵、二細(xì)胞期、桑葚期胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲樣品的DNA甲基化水平進(jìn)行了檢測(cè). 共計(jì)4對(duì)選擇性擴(kuò)增引物被用于DNA甲基化分析(圖2).結(jié)果顯示總計(jì)檢測(cè)到1719個(gè)“5′-CCGG-3′”位點(diǎn)中的胞嘧啶甲基化狀態(tài). 選擇性9,平均檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)為35. 被檢測(cè)到的位點(diǎn)中含211個(gè)甲基化位點(diǎn),包括188個(gè)全甲基化位點(diǎn)和23個(gè)半甲基化位點(diǎn). 對(duì)照組中受精卵、二細(xì)胞期胚、桑葚胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲的DNA甲基化水平分別為12.85±1.94%,13.19±2.81%,13.41±1.94%,14.79±1.71%,13.43±1.33% 和13.55±1.45%. 處理組中受精卵、二細(xì)胞期胚、桑葚胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲的DNA甲基化水平分別為10.09±1.07%,10.73±0.95%,11.19±1.82%,11.56±1.19%,10.41±1.23%和11.50±1.45%. 處理組與對(duì)照組各組內(nèi)DNA甲基化水平均無(wú)顯著差異. 除桑葚胚和殼頂幼蟲期樣品外,處理組DNA甲基化水平顯著低于對(duì)照組對(duì)應(yīng)樣品的甲基化水平(P<0.05)(圖3).早期發(fā)育各階段中擔(dān)輪幼蟲的DNA甲基化水平最高, 受精卵的DNA甲基化水平最低. 隨著馬氏珠母貝早期發(fā)育的進(jìn)行,基因組甲基化水平總體呈上升的趨勢(shì).

2.3 早期發(fā)育階段基因表達(dá)檢測(cè)

利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3及生物礦化基因nacrein在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果如圖4所示. 在對(duì)照組和處理組中,DNMT3和nacrein基因的表達(dá)量均隨發(fā)育進(jìn)行呈升高的趨勢(shì). 與對(duì)照組相比,經(jīng)去甲基化試劑5-氮雜胞苷溶液處理后,生物礦化基因nacrein的表達(dá)量升高,但升高未達(dá)顯著水平. 與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3的表達(dá)量降低,但降低未達(dá)顯著水平. 整個(gè)早期發(fā)育過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3和生物礦化基因nacrein的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(R2=0.755,P=0.000).

圖4 早期發(fā)育階段基因表達(dá)水平分析橫軸1-6分別代表受精卵、二細(xì)胞期胚、桑葚胚、擔(dān)輪幼蟲、D型幼蟲及殼頂幼蟲，縱軸為相對(duì)表達(dá)水平值

3 討論與結(jié)論

DNA甲基化修飾可從親本遺傳至子代并對(duì)許多生物代謝活動(dòng)起到重要調(diào)控作用[18].如正常的基因組甲基化修飾對(duì)動(dòng)物、植物的生殖細(xì)胞形成、早期胚胎發(fā)育潛能形成及發(fā)育調(diào)控具重要作用[19-20].該研究中,我們利用去甲基化試劑5-氮雜胞苷對(duì)馬氏珠母貝受精卵進(jìn)行浸泡處理并分析其對(duì)早期發(fā)育過(guò)程、DNA甲基化水平及甲基化轉(zhuǎn)移酶、礦化基因表達(dá)的影響. 從結(jié)果可知5-氮雜胞苷處理可使馬氏珠母貝早期發(fā)育受到明顯影響,主要表現(xiàn)在三個(gè)方面:一是早期胚胎成活率降低；二是大部分早期發(fā)育階段基因組甲基化水平顯著降低(P<0.05)；三是甲基化轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量降低和礦化基因的表達(dá)量上升. 相似的研究在同屬雙殼貝類的太平洋牡蠣中也開展過(guò),5-氮雜胞苷處理可顯著降低早期發(fā)育過(guò)程中的DNA甲基化水平,并引起D型幼蟲等胚胎的形態(tài)異常,最終導(dǎo)致死亡[12].本研究中馬氏珠母貝早期發(fā)育階段經(jīng)去甲基化試劑處理后,雖未發(fā)現(xiàn)胚胎階段出現(xiàn)形態(tài)發(fā)育異常,但也出現(xiàn)了處理組(5-氮雜胞苷處理)存活率低于對(duì)照組(海水處理)的現(xiàn)象,說(shuō)明早期發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化水平的人工降低對(duì)多數(shù)個(gè)體是致死的.

動(dòng)物中DNA甲基化主要發(fā)生在“CpG”二核苷酸位點(diǎn)上,基因組中可高達(dá)60%到90%的“CpG”二核苷酸被甲基化修飾[21].DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因家族成員主要為DNMT1,DNMT2,DNMT3a,DNMT3b以及DNMT3L,這些酶在DNA甲基化修飾形成中發(fā)揮重要作用. 其中DNMT3主要負(fù)責(zé)配子形成期及胚胎發(fā)育早期DNA甲基化模式的建立.目前貝類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因及DNA甲基化結(jié)合蛋白的研究很少. 僅見Wang等[22]鑒定并獲得了太平洋牡蠣中Dnmt1,Dnmt2,Dnmt3和MBD2/3等DNA甲基化酶核心基因.DNMT3甲基化酶表達(dá)水平的降低可能引起全基因組甲基化水平的降低[23].本研究中馬氏珠母貝DNMT3甲基化轉(zhuǎn)移酶基因在經(jīng)去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理后表達(dá)水平降低可能預(yù)示著全基因組甲基化水平降低,進(jìn)而大規(guī)模的基因表達(dá)水平變化可能會(huì)發(fā)生.

馬氏珠母貝隸屬于軟體動(dòng)物,其外套膜分泌產(chǎn)物是貝殼及珍珠形成的基礎(chǔ).貝殼由外套膜分泌產(chǎn)物在外殼的內(nèi)面與外套膜間沉積而成[24].馬氏珠母貝外套膜nacrein蛋白是其外表皮細(xì)胞分泌基質(zhì)蛋白的一種,由碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域和Gly-X-Asn結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中Gly-X-Asn重復(fù)結(jié)構(gòu)域在減弱鈣化過(guò)程中起關(guān)鍵作用. 重組nacrein蛋白可以在含CaCl2和NaHCO3的飽和碳酸鈣溶液中抑制碳酸鈣的沉淀,起到負(fù)向調(diào)控貝類殼鈣化過(guò)程的作用[25].該研究中5-氮雜胞苷處理可引起nacrein表達(dá)水平的升高,可能會(huì)對(duì)馬氏珠母貝生物礦化過(guò)程如殼和珍珠的形成產(chǎn)生影響. 從研究結(jié)果還可知DNMT3基因與nacrein基因的表達(dá)量呈顯著正相關(guān),因此可以較大膽的推測(cè),nacrein基因表達(dá)量的變化可能源于基因組甲基化水平的變化,該基因某些區(qū)域(如啟動(dòng)子區(qū)域) 甲基化水平的變化可能直接與其表達(dá)量變化相關(guān).在今后的研究中,可以嘗試對(duì)礦化基因啟動(dòng)子區(qū)、基因內(nèi)部編碼區(qū)等部位的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè),并分析其與基因表達(dá)的關(guān)系,為DNA甲基化在生物礦化過(guò)程中的可能作用提供證據(jù).

該研究利用去甲基化試劑5-氮雜胞苷處理了馬氏珠母貝的受精卵并研究了其對(duì)后續(xù)發(fā)育階段的影響. 結(jié)果表明5-氮雜胞苷可引起早期發(fā)育階段基因組甲基化水平顯著降低,甲基化轉(zhuǎn)移酶基因DNMT3和礦化基因nacrein的表達(dá)量均發(fā)生變化且兩基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān).研究表明基因組甲基化修飾對(duì)馬氏珠母貝早期發(fā)育過(guò)程具有重要意義,通過(guò)改變基因組甲基化水平可能是調(diào)控礦化過(guò)程,影響貝殼及珍珠形成的可行途徑之一.

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(編校：李由明)

Effect of 5-azacytidine on Early Development ofPinctadafucata

LI Yao-guo, SUN Tong, ZHANG Ya-jian, GONG Jian-hao

(College of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022,China)

To investigate the effect of 5-azacytidine on early development process of Pinctada fucata (P.fucata), genome methylation level change and expression level change of biomineralization gene were analyzed. The results showed that the treatment of 5-azacytidine resulted in a significantly decrease of the genome methylation levels of early embryos. The expression levels ofDNMT3 in the group after treatment of 5-azacytidine were lower than those in the group treated with seawater, whilst the expressions ofnacreingene were higher than those in the seawater treatment group. A significant positive correlation was observed between the expressions ofDNMT3 and nacrein genes (R2=0.755,P=0.000). The change of genome methylation level may be a key factor involved in the regulation of biomineralization process.

Pinctadafucata; demethylation agent; early development; methylation level; biomineralization

2016-10-05

海南自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20164166)；海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)科帶頭人和博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(RHDXB201620)

李耀國(guó)(1986-),男,湖南湘鄉(xiāng)人,海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院講師,博士,研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物分子育種與資源保護(hù).

S91

A

1008-6722(2016) 05-0005-06

10.13307/j.issn.1008-6722.2016.05.02