王 輝 張 恒 王 浩 閻 皓

白藜蘆醇對(duì)輻射誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞紊亂的調(diào)節(jié)作用

王 輝1張 恒1王 浩2閻 皓1

目的觀察電離輻射及白藜蘆醇對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的影響，探討其對(duì)細(xì)胞因子TGF-β及IFN-γ的影響，闡明白藜蘆醇對(duì)輻射誘導(dǎo)免疫抑制的改善作用。方法將24只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、照射組和照射給藥組，每組8只。照射組和照射給藥組接受137Cs源γ射線全身照射（6.0 Gy），對(duì)照組小鼠接受偽照射。照射前7 d及照射后28 d，每日予白藜蘆醇（20 mg/kg）灌胃。末次給藥后1 d，檢測(cè)各組小鼠外周血CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量，CD4+CD25+細(xì)胞內(nèi)FoxP3表達(dá)水平，脾淋巴細(xì)胞TGF-β分泌水平，以及CD8+細(xì)胞及脾淋巴細(xì)胞TNF-γ表達(dá)水平。采用單因素方差分析對(duì)3組間的細(xì)胞比例及細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果與正常小鼠比較，電離輻射可以增高CD4+CD25+細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞和CD4+中的比例125.0%和57.2%，增高脾細(xì)胞TGF-β水平31.4%，降低脾細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平26.9%，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；白藜蘆醇干預(yù)可以降低單純照射組小鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞和CD4+中的比例32.3%和27.8%，降低CD4+CD25+細(xì)胞的FoxP3陽(yáng)性比例26.6%，以及脾淋巴細(xì)胞TGF-β水平62.9%，增加CD8+T細(xì)胞及脾淋巴細(xì)胞生成的IFN-γ水平133.0%和87.4%，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論白藜蘆醇可以抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞，改善受照小鼠的免疫功能。

白藜蘆醇；調(diào)節(jié)T細(xì)胞；TGF-β；IFN-γ；電離輻射

Int J Med Radiol，2016，39（6）：603-606

放療是惡性腫瘤重要的治療手段，尤其對(duì)于部分病人是唯一的治療手段[1]。相關(guān)研究表明放療期間病人可出現(xiàn)免疫功能下降，對(duì)病人預(yù)后造成不良影響[2]，因此對(duì)其機(jī)制及改善手段的研究具有重要的理論和臨床價(jià)值。惡性腫瘤具有多種免疫逃避機(jī)制，包括分泌多種免疫抑制因子、介導(dǎo)細(xì)胞表面FasL表達(dá)、誘導(dǎo)具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖和分化[2-3]等。有研究[4]表明，腫瘤進(jìn)展期間常伴隨調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖，并可能通過TGF-β通路介導(dǎo)。

白藜蘆醇富含于虎杖、葡萄等植物體內(nèi)，是一種非黃酮多酚類化合物，對(duì)人類免疫缺陷病毒（HIV-1）、單純皰疹病毒等多種病毒具有抑制作用，對(duì)于幽門螺旋桿菌等具有抗菌作用[5]。低劑量的白藜蘆醇可以增加小鼠Th1細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12）和干擾素-γ（IFN-γ），可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及IL-2水平，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠免疫力[6]。相關(guān)研究表明，白藜蘆醇對(duì)多種實(shí)體瘤，如胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等具有抑制作用，并可能與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)[6]。以上免疫調(diào)節(jié)作用及抗腫瘤作用，均與調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能相關(guān)，本研究對(duì)受照小鼠用白藜蘆醇干預(yù)，研究電離輻射及白藜蘆醇對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的影響，并探討其對(duì)免疫抑制細(xì)胞因子（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，TGF-β）及CD8+生成的IFN-γ的影響，闡明白藜蘆醇對(duì)輻射誘導(dǎo)免疫抑制的改善作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。C57BL/6雄性小鼠(SPF級(jí))24只，8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所，合格證號(hào)[SCXK(京)2005-0013]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用經(jīng)天津市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠每籠4只飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房（飼養(yǎng)設(shè)施合格證號(hào)：SVXK津2009-0002）。②主要儀器和試劑。照射源為137Cs伽馬射線輻照儀（加拿大Atomic Energy公司）；LSRII流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)BD Bioscience公司），F(xiàn)lowjo7.6.2版流式細(xì)胞分析軟件（美國(guó)FlowJo公司）；白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BD Pharm LyseTM裂解液購(gòu)自美國(guó)BD公司；FoxP3染色緩沖液（美國(guó)eBioscience公司，Cat. No.005523）；布雷菲德菌素A（美國(guó)Sigma公司）；CD16/32mAb（2.4G2，美國(guó)BD Pharmingen公司)；anti-CD4 PE-CY5抗體，anti-CD8 FITC（53-6.7），anti-CD25 PE抗體，F(xiàn)ITC anti-mouse FoxP3抗體（FJK-16），anti-IFN-γ PE抗體（XMG1.2）均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理24只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純照射組和照射給藥組。每組8只，對(duì)照組給予假照射（即不照射），單純照射組和照射給藥組小鼠進(jìn)行腹部137Cs伽馬射線照射，吸收劑量6.0 Gy，源靶距40 cm，吸收劑量率0.73 Gy/min。白藜蘆醇用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液助溶配制成懸濁液，照射前7 d至照射后28 d每天灌胃給藥（20 mg/kg）。對(duì)照組和單純照射組小鼠按照射給藥組方法給予同等量載體灌胃。用藥劑量和給藥方式根據(jù)相關(guān)前期工作和預(yù)實(shí)驗(yàn)制定[7]。

1.2.2 免疫細(xì)胞準(zhǔn)備小鼠照射后第29天，從眼靜脈叢取血，EDTAK3抗凝，用BD Pharm LyseTM裂解液在4℃裂解5 min，制備的外周血單核細(xì)胞（PBMC）用含1%小牛血清的磷酸鹽溶液（PBSBSA，pH7.4）洗2次，在RPMI 1640液中再懸浮備用。小鼠脫頸處死后收獲脾，研磨后用400目的不銹鋼網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞用Hank’s平衡鹽液（HBSS）清洗后，裂解紅細(xì)胞方法同上，在RPMI 1640液中再懸浮備用。

1.2.3 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析PBMC懸液在CD16/ 32mAb中孵育阻斷FcRs非特異染色，加入適當(dāng)濃度anti-CD4 PE-CY5抗體、anti-CD25 PE抗體，在4℃暗光孵育30 min。細(xì)胞洗3次后在流式細(xì)胞分析(FCM)緩沖液（磷酸鹽緩沖液加0.1%小牛血清加0.1%NaN3）中懸浮。細(xì)胞清洗3次后用LSRII流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析，每樣本至少分析5 000個(gè)細(xì)胞，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)FoxP3和IFN-γ染色為檢測(cè)PBMC內(nèi)FoxP3表達(dá)，細(xì)胞用anti-CD4 PE-CY5抗體、anti-CD25 PE抗體孵育，清洗后按說(shuō)明書操作步驟用

FoxP3染色緩沖液固定和通透，用FITC anti-mouse FoxP3抗體（FJK-16）于4℃暗光孵育30 min。為檢測(cè)CD8+T細(xì)胞核內(nèi)IFN-γ表達(dá)，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑布雷菲德菌素A加入細(xì)胞培養(yǎng)液孵育5 h以累積細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子。加入Fc阻斷劑在4℃孵育5 min，加入anti-CD8 FITC抗體暗光孵育30 min。染色后，細(xì)胞送LSRII流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析，每樣本至少分析5 000個(gè)細(xì)胞，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)IFN-γ、TGF-β脾淋巴細(xì)胞用含200 μg/mL小牛血清的PRMI培養(yǎng)液調(diào)為1×107個(gè)細(xì)胞/mL孵育24 h，按說(shuō)明書步驟用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)上清液IFN-γ含量；按說(shuō)明書步驟通過酸化將無(wú)活性的Lat-TGF-β活化，用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)上清液活化TGF-β含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件包分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況對(duì)照組小鼠皮毛光滑，身體健壯，飲食、活動(dòng)正常，體質(zhì)量增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)無(wú)死亡。照射組小鼠皮毛干枯無(wú)光澤，精神弱，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食不積極，呼吸急促，體質(zhì)量無(wú)增長(zhǎng)，無(wú)死亡。照射給藥組與照射組比較，小鼠皮毛光澤尚可，身體較壯，飲食、活動(dòng)積極，體質(zhì)量有增長(zhǎng)，無(wú)死亡。

2.2 白藜蘆醇對(duì)CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量的影響正常對(duì)照小鼠的CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量處于較低水平，電離輻射可以導(dǎo)致CD4+CD25+細(xì)胞在PBMC中的比例升高125.0%，在CD4+細(xì)胞中的比例升高57.2%；照射給藥組與單純照射組比較，CD4+CD25+細(xì)胞在PBMC中的比例降低32.3%，在CD4+T細(xì)胞中的比例降低27.8%，各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 白藜蘆醇對(duì)CD4+CD25+細(xì)胞的FoxP3陽(yáng)性比例的影響電離輻射對(duì)CD4+CD25+細(xì)胞的FoxP3陽(yáng)性比例沒有顯著影響，照射給藥組較照射組小鼠CD4+CD25+細(xì)胞的FoxP3陽(yáng)性比例降低26.6%，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.4 白藜蘆醇對(duì)脾淋巴細(xì)胞TGF-β水平的影響照射組較正常對(duì)照組TGF-β水平增高31.4%；照射給藥組較照射組小鼠TGF-β水平降低62.9%，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）。

2.5 白藜蘆醇對(duì)IFN-γ水平的影響照射組脾細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平為703.2pg/mL，較對(duì)照組降低26.9%（P＜0.05），照射給藥組CD8+T細(xì)胞中IFN-γ陽(yáng)性比例為2.113%，較單純照射組提高133.0%；照射給藥組脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平較照射組增高87.4%，達(dá)到1 317.8 pg/mL，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

3 討論

在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制起到重要作用，在腫瘤的放化療中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞也對(duì)預(yù)后起到不良作用。相關(guān)研究表明電離輻射可以短期誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例增高，并可能抑制細(xì)胞免疫和體液免疫，但尚無(wú)有效的防護(hù)措施[8]。本研究表明，小鼠接受亞致死劑量（6 Gy）的γ射線全身照射，可以導(dǎo)致長(zhǎng)期調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例增高，而白藜蘆醇連續(xù)干預(yù)可以有效降低受照小鼠調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例，提示白藜蘆醇可以改善受照小鼠由調(diào)節(jié)T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制。

表1 各組間細(xì)胞比例及細(xì)胞因子表達(dá)水平比較（n=8,x±s）

以往研究中，調(diào)節(jié)T細(xì)胞定義為細(xì)胞膜表面表達(dá)CD4和CD25蛋白，調(diào)節(jié)T細(xì)胞多數(shù)表達(dá)叉頭狀家族轉(zhuǎn)錄蛋白FoxP3，對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育和功能起到重要作用[9]。FoxP3作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞重要的胞內(nèi)標(biāo)志，并與細(xì)胞膜表面蛋白CD4和CD25共同用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞的定義。Chen等[4]的研究表明，小鼠CD4+ CD25+細(xì)胞內(nèi)表達(dá)FoxP3的比例為72%～79%，對(duì)抑制細(xì)胞免疫起到重要作用。本研究中這一比例為

76.32%，與上述研究結(jié)果基本相符，如表1所示，電離輻射對(duì)CD4+CD25+細(xì)胞FoxP3陽(yáng)性比例有增加趨勢(shì)，而長(zhǎng)期低劑量白藜蘆醇干預(yù)可以有效降低CD4+CD25+表達(dá)FoxP3，改善受照小鼠免疫功能。

TGF-β是具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起重要作用，TGF-β可以誘導(dǎo)CD4+ CD25+增生[10-11]，可以協(xié)同刺激FoxP3表達(dá)，進(jìn)而將外周血CD4+CD25-細(xì)胞分化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞[12]，而調(diào)節(jié)T細(xì)胞可以通過TGF-β通路抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞特異細(xì)胞毒作用[4]。本研究結(jié)果顯示，電離輻射可以誘導(dǎo)TGF-β分泌；白藜蘆醇干預(yù)可以有效降低受照小鼠TGF-β水平，提示白藜蘆醇可以有效改善輻射誘導(dǎo)的免疫功能抑制。本研究中TGF-β分泌水平下降伴隨FoxP3表達(dá)水平降低，與Islas-Vazquez等[11]的研究結(jié)論相符。白藜蘆醇對(duì)腫瘤免疫作用的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確，是否通過抑制TGF-β抑制FoxP3表達(dá)進(jìn)而抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞生成和功能，尚有待進(jìn)一步研究。

IFN-γ具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用，可被調(diào)節(jié)T細(xì)胞及TGF-β信號(hào)通路抑制，抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞、刺激CD8+T細(xì)胞可以促進(jìn)IFN-γ生成[13]。本研究表明，白藜蘆醇可以有效增加CD8+T細(xì)胞IFN-γ陽(yáng)性比例及脾淋巴細(xì)胞生成IFN-γ水平，提示白藜蘆醇可以作為免疫刺激劑對(duì)機(jī)體免疫起到積極作用。本研究結(jié)果表明IFN-γ水平升高與調(diào)節(jié)T細(xì)胞數(shù)量及TGF-β水平呈負(fù)相關(guān)，這與Luz-Crawford等[13]的研究結(jié)果相符。但白藜蘆醇對(duì)IFN-γ調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚不明確，是否與抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞及降低TGF-β表達(dá)水平相關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

總之，電離輻射可以增加調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例，增高脾淋巴細(xì)胞TGF-β水平；白藜蘆醇可以降低調(diào)節(jié)T細(xì)胞比例，降低脾淋巴細(xì)胞TGF-β水平，增加CD8+T細(xì)胞生成的IFN-γ水平，其調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步研究闡明。

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（收稿2016－08－17）

Regulatory effect of resveratrol on radiation induced regulatory T cell disorder

WANG Hui1,ZHANG Heng1,WANG Hao2,YAN Hao1.
1 Department of Oncology,Tianjin Union Medical Center,Tianjin 300121,China;2 Department of Pharmaceutical,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences

ObjectiveTo observe the effects of ionizing radiation and resveratrol on the regulatory T cells and to investigate the effects of resveratrol on TGF-β from spleen cells and IFN-γ from CD8+T cells and splenic lymphocytes.To elucidate the effect of resveratrol on radiation induced immunosuppression.MethodsTwenty-four C57BL/6 male mice were randomly divided into control group,irradiation group,and irradiation+resveratrol group.Irradiation group and irradiation+ resveratrol group received total body irradiation（γ-ray,6.0 Gy）,while the control group received pseudo-irradiation. Resveratrol（20 mg/kg）was orally administered to the mice 7 days before and 28 days after irradiation.One day after the last administration,the number of CD4+CD25+cells in peripheral blood of mice was detected.The expression of FoxP3 in CD4+ CD25+cells was detected.The level of TGF-β in splenic lymphocytes and the expression of TNF-γ in CD8+cells and splenic lymphocytes were detected.The cell ratio and the expression of cytokines were compared by single factor analysis of variance（ANOVA）.Multiple comparisons between groups were performed by LSD-t test.ResultsCompared with control mice,irradiation increased the percentage of CD4+CD25+cells in peripheral blood mononuclear cells and CD4+cells by 125.0%and 57.2%,increased the level of TGF-β in spleen cells by 31.4%,and decreased the level of IFN-γ expression in spleen cells by 26.9%.The differences between groups were statistically significant（all P＜0.05）.Treatment of resveratrol could decrease the ratio of regulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells and CD4+cells of irradiated mice by 32.3%and 27.8%,decrease the level of TGF-β in splenic lymphocytes by 62.9%,respectively,increase the level of IFN-γ in the CD8+T cells and spleen lymphocytes by 133.0%and 87.4%,respectively.The differences between groups were

Resveratrol;Regulatory T cells;TGF-β;IFN-γ;Ionizing radiation

10.19300/j.2016.L4641

R815

A

1天津市人民醫(yī)院腫瘤科，天津300121；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所輻射防護(hù)與藥物研究室

王輝，E-mail：ezxwanghui@sohu.com

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81573089），天津市衛(wèi)計(jì)委科技基金（2015KZ061）

statistically significant（all P＜0.05）.ConclusionResveratrol can inhibit the regulatory T cells and improve the immune function of irradiated mice.