田青 葉文華 陶玉倩

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·基礎(chǔ)研究論著·

體外培養(yǎng)的乳鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪后軸突損傷的實(shí)驗(yàn)觀察

田青 葉文華 陶玉倩

目的 建立乳鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型，觀察氧糖剝奪處理對神經(jīng)元軸突損傷的影響。方法 取出生24 h內(nèi)的SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元，采用逐漸降低培養(yǎng)液中血清濃度和添加阿糖胞苷的方法培養(yǎng)、純化神經(jīng)元，觀察其形態(tài)并鑒定。建立氧糖剝奪模型，隨機(jī)分為正常對照組和氧糖剝奪處理組(2、4、6、8 h各1組)。采用噻唑藍(lán)比色法測定神經(jīng)元活性，βⅢ-tubulin 免疫熒光染色觀察軸突形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 神經(jīng)元培養(yǎng)3～5 d后，胞體變得飽滿并分出軸突和樹突，突起之間逐漸交織成密集網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)標(biāo)記陽性率>95%。與正常對照組相比，隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長，軸突網(wǎng)絡(luò)逐漸損傷、崩解，同時(shí)神經(jīng)元活性呈梯度下降(P<0.01)。結(jié)論 該研究成功建立了神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)及氧糖剝奪模型，并觀察到在氧糖剝奪處理過程中神經(jīng)元的軸突損傷及同時(shí)出現(xiàn)的神經(jīng)元活性下降。

新生乳鼠；大腦皮層神經(jīng)元；氧糖剝奪；軸突損傷

缺血性腦卒中發(fā)生后，由于胞內(nèi)鈣超載，繼發(fā)瀑布樣的損傷反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡[1]。目前，在缺血性腦卒中中，對于神經(jīng)細(xì)胞死亡的病理生理機(jī)制已有大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)并闡述，但卻很少關(guān)注神經(jīng)元軸突損傷在其中起到的作用。已有研究表明，軸突損傷可能是一個(gè)早期誘發(fā)神經(jīng)元死亡的重要因素[2]。然而，在缺血性腦卒中急性病理生理過程中，有關(guān)實(shí)驗(yàn)觀察少見報(bào)道。本次研究擬建立體外培養(yǎng)的乳鼠皮層神經(jīng)元模型，觀察氧糖剝奪處理對神經(jīng)元軸突損傷和細(xì)胞活性的影響。

材料與方法

一、主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)動物

牛血清白蛋白(BSA)、Hochest33258、脫氧核糖核酸酶I (DNaseI)(美國Sigma公司)；Neurobasal培養(yǎng)基、B27(美國Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠MAP-2抗體(美國Programma公司)；倒置顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus公司)。實(shí)驗(yàn)動物為新生24 h內(nèi)的SD大鼠，雌雄不限(中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)。

二、主要溶液配制

種植培養(yǎng)液： 98 ml Neurobasal培養(yǎng)基，2 ml B27， 1 ml BSA。維持培養(yǎng)液： 98 ml Neurobasal培養(yǎng)基，2 ml B27。缺氧液：KCl 0.224 g，NaCl 9.116 g，MgSO40.492 g，CaCl20.221 g， KH2PO40.17 g，HEPES 2.383 g，超純水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.35。

三、神經(jīng)元取材、培養(yǎng)、純化

選取2只乳鼠，取大腦皮層，剪碎后收集組織碎片，消化后反復(fù)吹散、離心；用37℃預(yù)熱的種植培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹散為單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿/板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入阿糖胞苷(濃度10 μmol/L)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，3 d后用維持培養(yǎng)液半量換液，以后每間隔3～4 d半量換液1次。

四、神經(jīng)元氧糖剝奪 模型的建立

選取生長良好、分布均勻的神經(jīng)元，吸棄原有培養(yǎng)液，加入缺氧液輕漂洗1～2次，后換入缺氧液(100 μl/96孔培養(yǎng)板,1 ml/35 mm培養(yǎng)皿)，然后將其置入密閉盒中，向盒中持續(xù)緩慢通入體積分?jǐn)?shù)為5%CO2和95%N2氣體30 min，以置換盒內(nèi)氧氣；將通氣后的密閉盒完全密閉后，置入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，達(dá)到所需缺氧時(shí)間后進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察。

五、神經(jīng)元形態(tài)觀察及免疫熒光染色鑒定

神經(jīng)元種植于培養(yǎng)皿后，連續(xù)在普通倒置顯微鏡下對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。培養(yǎng)至5～6 d，應(yīng)用神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2進(jìn)行免疫熒光染色，同時(shí)用Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核。具體方法參考文獻(xiàn)[3]，其中一抗為小鼠抗大鼠MAP-2，熒光二抗為FITC偶聯(lián)的羊抗小鼠。熒光顯微鏡下觀察、拍照，隨機(jī)選擇10個(gè)視野, 取平均值，計(jì)算：MAP-2標(biāo)記陽性率(%)= MAP-2染色陽性細(xì)胞數(shù)/Hoechst33258標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)×100%。

六、氧糖剝奪處理致神經(jīng)元軸突損傷的觀察

神經(jīng)元接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5～6 d后，隨機(jī)分為5組，其中1組為正常對照組，另外4組分別進(jìn)行氧糖剝奪處理2、4、6、8 h。氧糖剝奪處理相應(yīng)時(shí)間后，進(jìn)行軸突標(biāo)記物βⅢ-tubulin免疫熒光染色，并用Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核(方法同前)，其中一抗為兔抗大鼠βⅢ-tubulin，熒光二抗為Cy3偶聯(lián)的羊抗兔。

七、細(xì)胞活性檢測

使用96孔培養(yǎng)板，將神經(jīng)元隨機(jī)分為正常對照組和氧糖剝奪處理組(分別處理2、4、6和8 h)，每組設(shè)1個(gè)空白對照孔和6個(gè)平行復(fù)孔。避光狀態(tài)下，每孔加入終濃度為5 mg/ml 的噻唑藍(lán) 20 μl，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h后，棄去上清，加入DMSO 100 μl，振蕩溶解紫色結(jié)晶物，后用酶標(biāo)儀檢測吸光度值(D490 nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=D處理組/D正常組×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、神經(jīng)元形態(tài)觀察及鑒定

1. 神經(jīng)元總體形態(tài)觀察

神經(jīng)元種植于培養(yǎng)皿，24 h后已完全貼壁，可見有細(xì)小突起開始從胞體爬出，并逐漸向外周延伸。培養(yǎng)3 d后，胞體變得飽滿、立體，折光性強(qiáng)，多呈圓形、橢圓形或梭形；從胞體分出1～2條相對較粗、長的軸突和若干條細(xì)、短樹突，突起之間開始彼此聯(lián)接。培養(yǎng)5 d后，胞體更加飽滿，突起之間逐漸交織成密集網(wǎng)絡(luò)(圖1)。

2.神經(jīng)元生長錐形態(tài)觀察

神經(jīng)元種植于培養(yǎng)皿，24 h后可觀察到神經(jīng)元突起開始從胞體爬出，并逐漸向外周延伸，在突起的末端可見呈扇形膨大的生長錐(圖2，箭頭示)。

圖1 新生SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元(6 d，×200)

圖2 新生SD大鼠大腦皮層神經(jīng)元生長錐(24 h, ×200)

3.神經(jīng)元經(jīng)阿糖胞苷純化后MAP-2免疫熒光鑒定

神經(jīng)元經(jīng)阿糖胞苷純化后，用神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2進(jìn)行免疫熒光染色，同時(shí)Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核?？梢娚窠?jīng)元胞體、突起MAP-2染色陽性，胞核則被Hoechst33258標(biāo)記為藍(lán)色(圖3)。計(jì)算得：神經(jīng)元MAP-2標(biāo)記陽性率(%)>95%，神經(jīng)元純度符合要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 純化后神經(jīng)元MAP-2免疫熒光染色(×200)

二、氧糖剝奪處理對神經(jīng)元軸突及活性的影響

1. 氧糖剝奪處理后導(dǎo)致神經(jīng)元軸突損傷

正常情況下，神經(jīng)元培養(yǎng)到5～6 d，可觀察到飽滿的胞體，胞核大，軸突平滑、粗壯(圖4D)，逐漸交織成為緊密而復(fù)雜的神經(jīng)軸突網(wǎng)絡(luò)(圖4A)。而經(jīng)氧糖剝奪處理4 h后，神經(jīng)元胞體皺縮變形，胞核固縮，軸突變得纖細(xì)、粗糙，呈斷續(xù)串珠樣(圖4E)，神經(jīng)元之間仍有聯(lián)系，但神經(jīng)軸突網(wǎng)絡(luò)開始崩解(圖4B)。氧糖剝奪處理8 h后，神經(jīng)元胞體、胞核及軸突(圖4F)已消失，只殘留部分碎片，軸突網(wǎng)絡(luò)也完全崩解為顆粒樣碎片，細(xì)胞之間失去網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系(圖4C)。

2. 氧糖剝奪處理后導(dǎo)致神經(jīng)元活性下降

與正常對照組相比，氧糖剝奪處理2 h后，細(xì)胞活性即出現(xiàn)明顯下降，其細(xì)胞存活率降至70%；隨時(shí)間延長，細(xì)胞存活率也逐步下降；氧糖剝奪處理8 h后，細(xì)胞活性降至最低值14%(多組間D490nm比較，χ2值為27.87，P<0.05；存活率比較，χ2值為28.09，P<0.05，見表1。

組 別D490nm存活率(%)正常對照組0.89±0.03100.00±0.00氧糖剝奪2h0.63±0.0170.12±2.20氧糖剝奪4h0.45±0.0150.33±2.01氧糖剝奪6h0.28±0.0231.62±2.88氧糖剝奪8h0.12±0.0514.04±5.70

討 論

目前，國內(nèi)外皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)材料來源有兩種：胎鼠和新生鼠。胎鼠來源的神經(jīng)元處于分裂增殖階段，分化程度低，神經(jīng)元體外生存能力較強(qiáng)，易于成功培養(yǎng)。所以，國外研究中多采用胎鼠(多取自15～18 d胎齡)作為神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)材料來源。但是，胎鼠腦體積小，不便取材，每次原代培養(yǎng)均需處死孕鼠，此種方法耗資較大，操作繁瑣，且易造成鼠源的浪費(fèi)。而以出生24 h新生鼠作為取材來源，其神經(jīng)細(xì)胞雖已近分裂晚期，分化較高，但仍處于幼年階段，適應(yīng)性、可塑性仍較強(qiáng)，并且此法對孕鼠無傷害，可保證孕鼠和新生鼠的長期供應(yīng)，既可滿足實(shí)驗(yàn)需求，又具有操作性強(qiáng)的特點(diǎn)[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用新生24 h內(nèi)的大鼠作為取材對象，通過動態(tài)觀察，可見神經(jīng)元體外生長狀態(tài)良好，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

神經(jīng)元發(fā)育和再生過程中，其突起末端膨大，呈扇形，最早由Cajal描述稱為生長錐[5]。本實(shí)驗(yàn)中，原代皮層神經(jīng)元種植于培養(yǎng)皿后24 h，在普通倒置相差顯微鏡光鏡下即可觀察到軸突末端的生長錐，其形態(tài)特點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道吻合。生長錐位于所有突起活躍生長的尖端，軸突的延伸實(shí)際上是生長錐尖端前伸和回縮反應(yīng)相競爭的結(jié)果，軸突的形狀記錄了生長錐的歷史[6]。

圖4 氧糖剝奪處理致軸突損傷(βⅢ-tubulin/Hoechst33258 染色)(×200)

神經(jīng)元培養(yǎng)液可采用有和無血清兩種[7]。血清雖可為神經(jīng)元生長提供豐富營養(yǎng)，但因其同時(shí)也為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞等提供了生長條件，從而影響了神經(jīng)元的純度；而無血清培養(yǎng)液雖營養(yǎng)相對缺乏，但可防止雜質(zhì)細(xì)胞過度增殖，從而提高了神經(jīng)元純度。并且，由于血清直接從動物血液內(nèi)提取，含有很多不明成分，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果可造成一些不可預(yù)測的影響，而無血清培養(yǎng)基成分清楚，有利于實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定。因此，目前無血清培養(yǎng)法被多數(shù)研究者采用[4, 8]。神經(jīng)元培養(yǎng)液配方：Neurobasal培養(yǎng)基和神經(jīng)生長添加劑B27，已被國內(nèi)外普遍認(rèn)可并使用。而本研究取兩者之長，通過逐漸降低培養(yǎng)液中的血清濃度來進(jìn)行培養(yǎng)。在神經(jīng)元種植入培養(yǎng)皿的第1日，使用含1% FBS的培養(yǎng)液，能夠給神經(jīng)細(xì)胞提供充足營養(yǎng)，保持細(xì)胞活性；然后，在后續(xù)的換液過程中，通過半量更換無血清的培養(yǎng)液，逐漸降低培養(yǎng)液中的血清濃度，選擇性地促進(jìn)神經(jīng)元生長，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的生長，使神經(jīng)元得以純化。另外，在培養(yǎng)1 d后，加入有絲分裂抑制劑阿糖胞苷進(jìn)一步純化；利用MAP-2這一特異性分布于神經(jīng)元胞漿和突起中的細(xì)胞骨架蛋白作為標(biāo)記物，進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，結(jié)果顯示神經(jīng)元純度達(dá)95%以上，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

缺血缺氧性腦損傷是缺血性腦卒中的基礎(chǔ)病理過程，有關(guān)動物模型和細(xì)胞模型國內(nèi)外報(bào)道較多，造模方法也不盡相同[9-10]?？紤]到本研究的研究目的和實(shí)驗(yàn)條件的可操作性，我們選擇了神經(jīng)元的氧糖剝奪模型，它是在體外細(xì)胞水平下充分模擬缺血性腦血管病病理過程的經(jīng)典模型[11]。本研究應(yīng)用不含糖的缺氧液，完全替換原細(xì)胞培養(yǎng)液，使得神經(jīng)元處于一個(gè)酸堿平衡但能量、營養(yǎng)供給完全缺失的狀態(tài)；同時(shí)將神經(jīng)元置入已充填95%N2和5%CO2的密閉容器中，以達(dá)到剝奪神經(jīng)元供氧的目的。結(jié)果顯示氧糖剝奪處理2 h，即可觀察到神經(jīng)元活性的明顯下降；并且隨著缺氧時(shí)間延長，神經(jīng)元活性逐漸下降；氧糖剝奪處理8 h及以上時(shí)間，神經(jīng)元活性降至最低值；神經(jīng)元存活率與缺氧時(shí)間有良好的負(fù)性梯度。此氧糖剝奪模型能夠較好地模擬體內(nèi)神經(jīng)元缺血缺氧性損傷，具有易操作、易控制、重復(fù)性好的特點(diǎn)。

腦梗死發(fā)生后，神經(jīng)元死亡的初始引發(fā)機(jī)制還有很多未知，而軸突損傷對于整個(gè)神經(jīng)元死亡來說可能是一個(gè)早期引發(fā)因素。本研究應(yīng)用氧糖剝奪處理體外培養(yǎng)的神經(jīng)元以模擬腦梗死后的急性期，以軸突標(biāo)記物βⅢ-tubulin熒光染色法和噻唑藍(lán)法，分別在不同時(shí)間梯度觀察了氧糖剝奪處理對神經(jīng)元軸突形態(tài)學(xué)及活性的影響。隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長，軸突網(wǎng)絡(luò)逐漸支離崩解，細(xì)胞存活率也逐步下降；氧糖剝奪處理8 h，軸突網(wǎng)絡(luò)已基本完全消失，此時(shí)細(xì)胞活性也降至最低值。以上結(jié)果表明氧糖剝奪處理可誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突網(wǎng)絡(luò)的損傷、崩解，并同時(shí)導(dǎo)致神經(jīng)元活性下降。

神經(jīng)元軸突損傷后，軸突本身會發(fā)生一系列變性反應(yīng)，其中華勒變性是一種經(jīng)典類型。損傷后，華勒變性發(fā)生迅速，軸突骨架結(jié)構(gòu)如微管、神經(jīng)微絲等去組裝并呈現(xiàn)無序性地顆粒聚集，同時(shí)髓鞘發(fā)生腫脹、收縮、斷裂，最后崩解為脂質(zhì)顆粒[12]。上述文獻(xiàn)報(bào)道與本研究神經(jīng)元氧糖剝奪處理后觀察到的形態(tài)學(xué)變化相符，表明體外培養(yǎng)的神經(jīng)元遭受缺氧缺糖性損傷后，軸突可發(fā)生類似于華勒變性的崩解變性反應(yīng)。

除了軸突本身變性反應(yīng)，軸突受損的神經(jīng)元胞體也會因此發(fā)生一系列反應(yīng)，稱為“逆向性反應(yīng)”或“胞體反應(yīng)”[13]。本研究觀察到，氧糖剝奪處理神經(jīng)元可誘發(fā)軸突損傷，同時(shí)細(xì)胞活性下降，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，可以推測在神經(jīng)元氧糖剝奪的病理機(jī)制中，軸突損傷有可能通過逆向性胞體反應(yīng)誘發(fā)神經(jīng)元死亡。然而，對于胞體反應(yīng)的起始機(jī)制尚不清楚。由于軸突斷裂而喪失靶源性營養(yǎng)因子、逆行性損傷電流反應(yīng)如高鈣內(nèi)流等被認(rèn)為是軸突損傷誘發(fā)胞體死亡的部分因素[13-14]。在缺血性腦損傷急性期，在病理性細(xì)胞凋亡的過程中，軸突損傷可在早期發(fā)生，繼而由于軸漿運(yùn)輸?shù)钠茐?、?xì)胞間相互營養(yǎng)支持的減少等誘發(fā)細(xì)胞死亡。

本研究成功建立了神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)及氧糖剝奪模型，并觀察到在神經(jīng)元氧糖剝奪處理過程中的軸突損傷及同時(shí)出現(xiàn)的神經(jīng)元活性下降，而有關(guān)軸突及軸突網(wǎng)絡(luò)損傷的分子生物學(xué)機(jī)制，則需要進(jìn)一步的研究來探討。

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(本文編輯：楊江瑜)

Experimental observation of OGD-induced axonal injury in neonatal rat models with primary cultured cortical neurons

TianQing,YeWenhua,TaoYuqian.

DepartmentofNeurology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

,TaoYuqian,E-mail:taoyuqiansums@163.com

Objective The neonate rat models with primary cultured cortical neurons were established. The impact of oxygen and glucose deprivation (OGD) treatment on neuronal axonal injury was observed. Methods Cerebral cortical neurons of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats aged < 24 h were obtained. The neurons were cultured and purified by gradual reduction of serum concentration and supplement of cytarabine (Ara-c) into the culture medium. The neuronal morphology and identification were carried out. OGD models were established. Cultured cortical neurons were randomly divided into control and OGD treatment groups(2,4,6,8 h group). Neuronal activity was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromide (MTT) assay. Morphological changes of the axon were observed with βⅢ-tubulin immunofluorescence staining. Results After 3-5 d culture, the neuron cell body became plump presenting with axons and dendrites, which gradually constructed a dense network. The positive rate of microtubule associated protein 2 (MAP-2) was >95%. Compared with the control group, the axonal network was gradually damaged and disrupted along with the prolonged OGD treatment. Meantime, the neuronal activity was decreased in a gradient manner (P<0.01). Conclusion In this study, OGD-treated neonate rat models with primary cultured cortical neurons were established. Neuronal axonal injury accompanied with decreased neuronal activity was observed after OGD treatment.

Neonatal rat; Cerebral cortical neuron; Oxygen and glucose deprivation; Axon injury

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.11.003

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(田青)；528200 佛山，佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院ICU(葉文華)；510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科(陶玉倩)

，陶玉倩，E-mail: taoyuqiansums@163.com

2016-08-06)