李苗 付冰冰 吳霞 胡澤昆 孫曉鵬

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·臨床研究論著·

系統(tǒng)性紅斑狼瘡與腸道菌群的相關研究

李苗 付冰冰 吳霞 胡澤昆 孫曉鵬

目的 探討SLE與腸道菌群、炎癥因子及疾病活動度之間的關系，以及經糖皮質激素(激素)聯合羥氯喹治療后三者的變化及其治療作用機制。方法 選擇25名健康體檢者(正常對照組)及30例初診SLE患者(SLE組)，后者接受為期3個月的激素聯合羥氯喹治療，分別收集正常對照組及SLE組患者治療前后的糞便標本，應用SYBR Green I實時熒光定量PCR對大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌定量，同時應用ELISA法對外周血中IL-17、轉化生長因子-β(TGF-β)的表達水平進行檢測， 并行SLE疾病活動指數(SLEDAI)評價SLE患者的病情活動程度。結果 與正常對照組相比，治療前SLE患者大腸埃希菌數較多(P<0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌數較少(P均<0.01)；外周血中IL-17水平較高(P<0.05)，且與SLEDAI評分呈正相關(r=0.699，P<0.05)；TGF-β水平下降(P<0.05)，且與乳酸桿菌的數量呈正相關(r=0.416，P<0.05)。與治療前相比，激素聯合羥氯喹治療3個月后 SLE患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌數減少(P均<0.05)，大腸埃希菌數無明顯變化(P>0.05)；SLE患者SLEDAI評分降低(P<0.05)，血清IL-17水平下降(P<0.01)、但仍高于正常對照組(P<0.01)，TGF-β水平升高(P<0.01)、但仍低于正常對照組(P<0.05)。結論 SLE患者存在較明顯的腸道菌群失調狀態(tài)。激素聯合羥氯喹治療可改善SLE患者的病情，但同時可能會進一步加重腸道菌群失調狀態(tài)。IL-17及TGF-β等炎癥因子可能參與SLE的發(fā)病及治療作用機制。SLE狀態(tài)下，乳酸桿菌與TGF-β可能有關。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 腸道菌群；糖皮質激素；羥氯喹；實時熒光定量聚合酶鏈式反應

Glucocorticoid; Hydroxychloroquine; Real-time PCR

SLE是一種累及全身多系統(tǒng)多臟器的自身免疫性疾病，發(fā)病機制目前尚未明確，一直是當前風濕病領域研究的熱點問題[1-3]。輔助性T細胞17(Th17)和調節(jié)性T細胞(Treg)及其下游表達的相關炎癥細胞因子IL-17、轉化生長因子-β(TGF-β)在SLE發(fā)病過程中尤為重要[4]。腸道黏膜免疫反應是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其主要依靠黏膜內T、B細胞及分泌至腸腔中的sIgA等共同完成局部免疫功能[5]。腸道菌群作為黏膜免疫重要參與者，通過影響?zhàn)つっ庖咧刑囟ǖ难装Y因子發(fā)揮對機體免疫系統(tǒng)的整體調節(jié)作用。糖皮質激素(激素)及免疫抑制劑是目前治療SLE的一線藥物，可有效改善SLE患者的病情。本研究采用自身對照的實驗設計，應用SYBR Green I熒光定量PCR及ELISA對SLE患者在治療前后的腸道菌群及外周血炎癥因子進行定量，旨在分析在疾病狀態(tài)下及治療后各研究指標的差異，闡明腸道菌群與IL-17、TGF-β等炎癥細胞因子在SLE的發(fā)病機制、疾病進展及治療中的作用。

對象與方法

一、研究對象

選取2014年1月至2014年12月佳木斯大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科門診及住院部初診SLE患者30例為SLE組，納入標準：①年齡18～55歲；②符合美國風濕病學會1982年診斷標準，確診為SLE。排除標準：①近4周內曾應用抗生素或微生物制劑；②近期有腸道手術史；③藥物依從性差及不配合患者。其中男2例、女28例，年齡19～54歲、中位年齡26歲。另選擇同期在我院行健康體檢的25名健康人為正常對照組，該25人與30例SLE患者的性別構成、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。本研究的各個程序均符合醫(yī)院倫理委員會所制定的倫理學標準，所有入組者均簽署知情同意書。

二、治療方法

所選取的初診患者均根據2010年中華醫(yī)學會SLE診斷及治療指南規(guī)范治療：聯合使用激素和羥氯喹，劑量為潑尼松0.5～1 mg/(kg·d),或甲潑尼龍40～60 mg/d，持續(xù)應用1周，之后依據患者病情調整劑量，同時使用羥氯喹0.2～0.4 g/d。

三、檢測方法

1. 主要試劑及儀器

主要試劑包括日本Takara 2倍濃縮的實時定量PCR擴增的預混和溶液，Taq DNA 聚合酶，普通PCR產物純化試劑盒，糞便基因組DNA提取試劑盒。主要儀器有美國Bio-Rad核酸蛋白檢測儀，德國Biometra溫度梯度PCR儀，北京六一電腦三恒多用電泳儀，上海領成Tocan凝膠成像分析儀，美國ABI 7300實時熒光定量PCR儀。

2. 糞便標本采集及檢測

分別收集正常對照組和SLE組患者在治療前及治療3個月的糞便標本，40 min內保存于-80℃冰箱。稱取中段200 mg便樣，嚴格按照糞便基因組DNA提取試劑盒操作說明操作，對所提取DNA進行濃度及純度檢測，OD260/OD280均在1.8～2.0，多管分裝并置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鎏崛NA產物應用SYBR Green I 實時熒光定量PCR法對糞便標本中的大腸埃希菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌定量。根據參考文獻[6]設計引物序列，由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列信息見表1，進行常規(guī)PCR反應。PCR反應體系為25 μl：上、下游引物各1 μl，5 U/L Taq聚合酶0.2 μl，模板DNA 2 μl，MgCl24 μl， 重蒸水16.8 μl。反應條件：95℃預變性5 min，95℃15 s，退火30 s(大腸埃希菌60℃、雙歧桿菌52℃、乳酸桿菌54℃)，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃復性10 min。反應結束后將PCR產物置于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時間50 min。瓊脂糖凝膠電泳結束以后，應用Tocan凝膠成像分析系統(tǒng)對各電泳條帶進行攝像。另外，將普通PCR產物進行切膠回收，嚴格按照普通PCR產物純化回收試劑盒操作說明對PCR產物進行純化回收，將回收后的產物用紫外分光光度計測定其濃度和A值，換算成各標準品1 μl的拷貝數。將各標準品做10倍系列梯度稀釋，設置5個濃度梯度點，進行熒光定量PCR，反應體系20 μl：2倍濃縮的實時定量PCR擴增的預混和溶液 10 μl、上、下游引物25 mmol/L各0.8 μl、ROX 0.4 μl，標準品DNA模板1.5 μl，重蒸水6.5 μl。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，最后95℃復性15 s。根據實驗結果生成標準曲線。反應結束后將產物從60～95℃以0.5℃間隔逐漸加熱，繪制熔解標準曲線圖。通過標準曲線計算得到各待測樣品中大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的拷貝數。

表1 各腸道菌群16SrDNA引物序列

3. 血清IL-17和TGF-β水平檢測

分別于正常對照組入組時和SLE組患者治療前及治療3個月的清晨采集其外周肘靜脈血，低速離心分離血清，采用ELISA法檢測正常對照組及SLE患者治療前、后血清中IL-17、TGF-β水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

四、臨床資料的采集及SLE疾病活動指數(SLEDAI)評分

分別于治療前、治療3個月，對SLE組患者進行病史采集、體格檢查及實驗室相關指標檢測，并進行SLEDAI評分，了解患者病情活動情況。

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、引物特異性驗證結果

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR引物的特異性，以500 bp標記物為標尺，從圖1中普通PCR產物可見明亮的特異性條帶，無引物二聚體等非特異性擴增，說明引物特異性好。

二、擴增曲線

實時熒光定量PCR反應，以循環(huán)數為橫坐標，實時熒光強度為縱坐標，兩者形成S型擴增曲線，熒光強度隨模板循環(huán)數的增加而增加，經過指數擴增期、線性擴增期之后到達平臺期，各腸道菌群的擴增曲線見圖2。

圖1 引物特異性驗證結果

M：標記物；1：大腸埃希菌(190 bp)；2：乳酸桿菌(232 bp)；3：雙歧桿菌(198 bp)

三、標準曲線

以各標準品的拷貝數的對數值為橫坐標，以Ct值為縱坐標，由軟件自動繪制出各標準菌的標準曲線，拷貝數與Ct值之間的線性關系可以計算出待測樣本中各個細菌的拷貝數。大腸埃希菌屬：Y=-3.603X+42.377，r= 0.999；雙歧桿菌屬：Y=-8.846X+46.678，r= 0.999；乳酸桿菌屬：Y=-3.310X+36.446，r=0.998；r值均大于0.990，見圖3。

圖2 SLE患者糞便標本的腸道菌群擴增曲線

A：大腸埃希菌擴增曲線；B：雙歧桿菌擴增曲線；C：乳酸桿菌擴增曲線

圖3 SLE患者糞便標本的腸道菌群標準曲線

A：大腸埃希菌標準曲線；B：雙歧桿菌標準曲線；C：乳酸桿菌標準曲線

四、熔解曲線

SYBR Green染料是一種非特異的染料，可嵌合于雙鏈DNA的小溝，只有雙鏈DNA才會發(fā)出熒光，在延伸結束階段采集熒光信號，熔解曲線是對PCR引物特異性進一步驗證，觀察擴增產物是否為所需要目的產物，本研究3種細菌的熔解曲線均為單峰，說明擴增產物為目標產物，且無非特異性擴增，見圖4。

圖4 SLE患者糞便標本的腸道菌群熔解曲線

A：大腸埃希菌熔解曲線；B：雙歧桿菌熔解曲線；C：乳酸桿菌熔解曲線

五、腸道菌群定量結果

采用實時熒光定量PCR分析正常對照組及SLE患者在治療前后腸道內大腸埃希菌、雙歧桿菌以及乳酸桿菌3種細菌數的變化。與正常對照組相比，治療前SLE患者腸道內大腸埃希菌數較多(P<0.01)；雙歧桿菌和乳酸桿菌數較少(P<0.01)。應用激素及羥氯喹治療后，SLE患者腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數比治療前減少(P均<0.05)，大腸埃希菌數無變化(P>0.05)，見表1、2。

表1 SLE組與正常對照組的3種腸道菌群數量比較 lg copies/g

注：與正常對照組比較，SLE組治療前t大腸埃希菌=2.552、t雙歧桿菌=3.461、t乳酸桿菌=2.322，aP<0.05、bP<0.01；與SLE組治療前比較，SLE組治療后t大腸埃希菌=1.540、t雙歧桿菌=6.783、t乳酸桿菌=9.264，cP<0.01

六、外周血IL-17、TGF-β水平及SLEDAI評分結果

與正常對照組相比，SLE組患者血清中IL-17水平增高(P<0.05)，且與SLEDAI評分呈正相關(r=0.699，P<0.05)，見圖5A；TGF-β水平下降(P<0.05)，且與乳酸桿菌數呈正相關(r=0.416，P<0.05)，見圖5B。經激素及羥氯喹治療后，SLE組患者血清中IL-17水平下降(P<0.01)，但仍高于正常對照組(P<0.01)；TGF-β水平升高(P<0.01)，但仍低于正常對照組(P<0.01)。SLE患者治療后，SLEDAI評分明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 SLE組與正常對照組的外周血IL-17、TGF-β及SLEDAI比較

注：與正常對照組比較，SLE組治療前tIL-17=10.831、tTGF-β=9.759，SLE組治療后tIL-17=8.492、tTGF-β=2.461，aP<0.01、bP<0.05；與SLE組治療前比較，SLE組治療后tIL-17=6.562、tTGF-β=-9.450、tSLEDAI=4.071，cP<0.01

圖5 IL-17與SLEDAI評分及TGF-β與乳酸桿菌數的相關性分析

A：IL-17與SLEDAI的相關性分析；B：TGF-β與乳酸桿菌數的相關性分析

討 論

IL-17本質是一種含155個氨基酸的糖蛋白，可通過刺激中性粒細胞、單核細胞，誘導趨化因子(如MCP-1)與細胞因子(如IL-6、TNF-α)，促進自身抗體的產生，加重局部炎癥和對組織的損傷。多項研究發(fā)現，IL-17在新發(fā)SLE、兒童SLE、青少年SLE以及發(fā)病的孕婦中均呈增高的趨勢[7-9]。此外，在SLE患者外周血中Th17水平及在活化的外周血單個核細胞中mRNA的表達也有增加[10]。本研究通過ELISA法檢測IL-17水平發(fā)現，SLE患者外周血IL-17水平高于正常對照組，且與SLEDAI評分呈正相關，與上述研究結果一致，表明在SLE患者體內IL-17水平呈增高趨勢，推測可能為SLE患者體內存在IFN-α- B細胞刺激因子(BLyS)-IL-17軸，通過激活BLyS，促進B細胞的增殖和分化，產生大量自身抗體并促進Th17細胞分泌IL-17，促發(fā)機體持續(xù)性炎癥反應，同時大量自身抗體形成的免疫復合物還可通過漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)促進IFN-α的形成，加重SLE炎癥狀態(tài)[11]。另有研究表明，IL-17與IL-6存在強相關，且IL-17/1L-6更能反映疾病活動程度，IL-17主要由初始CD4+T細胞在IL-6及TGF-β作用下分化的Th17細胞直接分泌，高水平的IL-6可進一步促進IL-17的表達，上調炎癥反應[12]。由此可推測，IL-17可通過驅動不同的免疫途徑，影響SLE的發(fā)病進展，另有研究發(fā)現，血清巨噬細胞移動抑制因子水平亦與狼瘡疾病活動性有關[13]。

TGF-β家族由一類結構、功能相關的多肽生長因子亞家族組成, TGF-β對巨噬細胞、淋巴細胞等產生免疫抑制功能，對維持機體免疫耐受發(fā)揮重要作用[14]。本研究顯示，初治SLE患者與正常對照組相比，TGF-β水平下降，與李志等[15]研究結果相符。目前已有相關研究證實，SLE患者體內多態(tài)性啟動因子C-509T可能會增強 SLE的遺傳易感性，其可對TGF-β基因產生影響，降低TGF-β的表達[16]。同時當內環(huán)境中僅有TGF-β存在時，初始CD4+T細胞分化為Treg，而不會分化為Th17，從而發(fā)揮免疫抑制作用，有效抑制免疫活性細胞的增殖和分化，當IL-6大量存在時，抑制Treg細胞的增殖，與TGF-β共同誘導Th17的分化，分泌IL-17介導機體炎癥反應。在SLE狀態(tài)下Th17的過度分化使IL-17、IL-23等促炎細胞因子的過度表達，TGF-β不能發(fā)揮原有的免疫抑制功能，從而打破了兩者之間正常的免疫平衡狀態(tài)，導致SLE的發(fā)病[17]。

腸道菌群是存在于人體胃腸道內的正常微生物群，不僅參與構成腸道的生物屏障，還可參與人體多種病理生理性代謝過程。本研究顯示，與正常對照組相比，SLE患者腸道內雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌數明顯減少，大腸埃希菌數量明顯增多。大腸埃希菌為條件致病菌[18]。當腸道內雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌數減少時，其競爭性抑制作用減弱，大腸埃希菌等條件致病菌處于生長優(yōu)勢，因此當SLE患者腸道內有益菌和條件致病菌之間的平衡打破，就會造成腸道菌群失調，機體免疫功能障礙，導致SLE等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[19-20]。本研究結果顯示，乳酸桿菌數與外周血TGF-β水平呈正相關，但兩者相關程度較弱，多項研究已表明，腸道菌群可調節(jié)體內多種炎癥細胞因子，雙歧桿菌是腸道內數量最多的益生菌，可促進B細胞的轉化和IL-10、TGF-β的分泌[21]。 乳酸桿菌則可對TNF-α和IL-6產生刺激作用[22]。Kosiewicz等[23]證明乳酸桿菌可以通過機體內黏膜免疫反應促進TGF-β的分泌，提高Treg細胞的水平，由此可見，腸道菌群在機體促炎及抗炎過程均發(fā)揮作用，在SLE狀態(tài)下 TGF-β與乳酸桿菌之間可能有關，但兩者的關系受體內其他菌群、細胞因子及治療過程中藥物的影響，因此兩者之間更深層次的關系還有待進一步研究。

激素和羥氯喹是目前治療SLE的基礎藥物。研究發(fā)現，激素進入靶細胞胞漿后可與胞漿內的特異性受體結合，調節(jié)某些基因的轉錄活性，可抑制淋巴細胞中活化蛋白-1(AP-1)及核因子-κB等轉錄因子，從而下調編碼炎癥性細胞因子的基因表達，發(fā)揮抗炎及免疫抑制作用。羥氯喹則可通過抑制炎癥細胞的趨化和浸潤，從而發(fā)揮有效抗炎作用，該過程涉及TNF-ɑ、IL-1和 IL-6等炎癥因子。本研究顯示，SLE患者經激素聯合羥氯喹治療3個月后的SLEDAI評分降低，外周血中IL-17水平下降，但仍高于正常對照組，TGF-β的表達水平明顯提高，但仍低于正常對照組，以上結果表明激素聯合羥氯喹可有效改善患者的病情，且IL-17、TGF-β等炎癥因子在SLE的發(fā)病及治療機制中發(fā)揮重要作用，激素和羥氯喹可分別通過抑制B細胞的分化及下游炎癥細胞因子的形成，改善Treg細胞的功能，抑制機體炎癥狀態(tài)。本研究顯示，SLE患者治療后，雙歧桿菌、乳酸桿菌的數量減少，大腸埃希菌的數量無變化，提示SLE患者應用激素和羥氯喹治療，雖然在短期內可明顯控制病情，但長期應用可能會使腸道菌群失調狀態(tài)進一步加重，目前有關羥氯喹是否具有抗菌作用一直備受爭議。早在上世紀七十年代，有關學者就提出在體外環(huán)境下，羥氯喹等抗瘧藥可抑制大腸埃希菌、藤黃微球菌DNA聚合酶的形成，數十年后Wolf等[24]則發(fā)現，奎寧沒有表現出對大腸埃希菌的抗菌活性。Huang等[25]觀察無菌小鼠及黏蛋白基因2(Muc2)敲除的小鼠模型，當注射地塞米松4周后，發(fā)現小鼠體內黏蛋白表達下降。推測其機制可能是應用激素及羥氯喹治療后，抑制自身抗體產生，從而減輕自身炎癥狀態(tài)，調節(jié)機體免疫，并對腸黏膜相關組織內黏膜免疫產生影響，進一步影響腸道菌群的免疫耐受機制，導致腸道菌群的結構和功能發(fā)生改變，本研究在自身對照基礎上研究兩者之間的潛在聯系，證實了在SLE病理性自身免疫炎癥及治療作用下腸道菌群存在失調狀態(tài)。

綜上所述，本研究通過熒光定量PCR及ELISA的方法, 對SLE患者腸道中大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌以及外周血IL-17、TGF-β進行精確定量，結果提示IL-17、TGF-β等炎癥因子以及腸道菌群的結構和功能均可能參與SLE的發(fā)病及其治療變化機制，本研究有望在SLE的發(fā)病機制、靶點治療及減少藥物不良反應方面提供新的思路。

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(本文編輯：林燕薇)

Correlation between systemic lupus erythematosus and gut microbiota

LiMiao,FuBingbing,WuXia,HuZekun,SunXiaopeng.

DepartmentofRheumatology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154000,China

,SunXiaopeng,E-mail:SXP_JMS7097@163.com

Objective To analyze the relationship among systemic lupus erythematosus (SLE), gut microbiota, inflammatory cytokines and disease activity, and to explore the effect and potential mechanism of glucocorticoid combined with hydroxychloroquine therapy on their relationship. Methods Twenty five healthy individuals (control group) and 30 patients with new-onset SLE (SLE group) were recruited in this study. Patients in the SLE group received combined therapy of glucocorticoid and hydroxychloroquine for three months. Fecal samples were obtained before and after corresponding treatment in two groups. SYBR Green I real-time PCR was performed to measure the quantity of the Escherichia coli, Baeteroides and Lactobacillus. The expression levels of IL-17 and TGF-β in peripheral blood were detected by ELISA. The disease activity of SLE patients was evaluated by SLE disease activity index (SLEDAI). Results Compared with the control group, the copies of Escherichia coli in SLE patients were significantly increased, whereas the quantity of Baeteroides and Lactobacillus was significantly decreased (allP<0.01). The level of serum IL-17 was significantly up-regulated (P<0.05), and positively correlated with SLEDAI score (r=0.699,P<0.05). The level of serum TGF-β was significantly down-regulated (P<0.05), and positively correlated with the copies of Lactobacillus (r=0.416,P<0.05). After 3-month corticosteroid combined with hydroxychloroquine therapy, the quantity of Baeteroides and Lactobacillus was further reduced (bothP<0.05), while no significant change was observed in the copies of Escherichia coli (P>0.05). In SLE patients, SLEDAI score was reduced (P<0.05) and the level of serum IL-17 was down-regulated (P<0.01), still significantly higher than that in the control group (P<0.01). The level of serum TGF-β was up-regulated (P<0.01), still lower compared with that in the control group (P<0.05). Conclusions SLE patients present with evident state of intestinal dysbacteriosis. Combined therapy of glucocorticoid and hydroxychloroquine can significantly alleviate the severity of SLE, whereas may further aggravate the state of intestinal dysbacteriosis. The inflammatory cytokines of IL-17 and TGF-β may be involved in the pathogenesis and therapeutic mechanism of SLE. Lactobacillus is probably correlated with TGF-β in SLE patients.

Systemic lupus erythematosus; Gut microbiota;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.11.004

佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新重點項目(LZR2014_019)

154000 佳木斯，佳木斯大學附屬第一醫(yī)院風濕免疫科

，孫曉鵬， E-mail：SXP_JMS7097@163.com

2016-05-06)