張忠獻(xiàn)，王鵬舉，王堯河

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、鄭州大學(xué)科技部細(xì)胞與基因治療國(guó)際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州 450052)

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腫瘤基因治療病毒載體相關(guān)研究生物安全問題淺析

張忠獻(xiàn)，王鵬舉，王堯河

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、鄭州大學(xué)科技部細(xì)胞與基因治療國(guó)際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州 450052)

近年來，腫瘤基因治療無論在科研領(lǐng)域還是在臨床應(yīng)用中都取得突破進(jìn)展。隨著越來越多的以病毒為載體腫瘤基因治療藥物被批準(zhǔn)上市，該領(lǐng)域的研究會(huì)快速增長(zhǎng)。然而，病毒載體經(jīng)過改造之后，對(duì)人類的致病性很弱，使科研工作者很容易忽視其潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本文就常見病毒載體所涉及的生物安全方面的管理規(guī)定及潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分析總結(jié)。

基因治療；病毒載體；生物安全

2003年重組人p53腺病毒注射液作為世界上第1個(gè)獲準(zhǔn)上市的腫瘤基因治療藥在我國(guó)上市[1]，至2012年歐洲藥監(jiān)局批準(zhǔn)了第1個(gè)在西方國(guó)家被批準(zhǔn)上市的基因治療產(chǎn)品Glybera[2]和2015年美國(guó)食品藥品管理局的批準(zhǔn)生產(chǎn)的imlygic用于皮膚癌治療等，腫瘤基因治療無論在科研領(lǐng)域還是在臨床應(yīng)用中都取得很多突破進(jìn)展[3]。病毒載體作為腫瘤基因治療中外源基因?qū)氚屑?xì)胞并有效表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)治療疾病的一種非常有效的工具。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和分子病毒學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)病毒載體的進(jìn)一步改造完善，其在基因治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。對(duì)病毒載體的不斷優(yōu)化和改良，也在世界各地的實(shí)驗(yàn)室里不間斷進(jìn)行著。載體中不必要的病毒基因去除可明顯減輕細(xì)胞毒性和免疫原性，還可避免產(chǎn)生可復(fù)制的病毒顆粒和人體感染病毒的危險(xiǎn)。在此基因上，外源基因的定位整合可提高基因治療的效果。然而，病毒載體安全性的提高，更容易讓科研工作者們忽略其潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本文就常見病毒載體的生物安全屬性及其風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行淺析。

1 常見病毒載體的基本屬性

常見的病毒載體既有非致性的腺相關(guān)病毒載體，也有可引起艾滋病的人類免疫缺陷病毒(HIV)等。各種病毒載體母體的基本生物學(xué)特性及致病性見表1[4]。

2 常見病毒載體生物安全管理法律法規(guī)要求

早在基因工程研究領(lǐng)域快速發(fā)展的初期，為促進(jìn)我國(guó)生物技術(shù)的研究與開發(fā)，加強(qiáng)基因工程工作的安全管理，我國(guó)就頒布《基因工程安全管理辦法》(國(guó)家科委第17號(hào))[5]。至2006年，為加強(qiáng)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理，規(guī)范病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，在《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》[6]的基礎(chǔ)上，制訂了《人間傳染的病原微生物名錄》[7]，對(duì)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理做了明確的規(guī)定。特別是針對(duì)使用人類病毒的重組體作了具體的說明：在新的法規(guī)未出臺(tái)的情況下，暫時(shí)遵循的原則是：首先，禁止2個(gè)不同病原體之間進(jìn)行完整基因組的重組；其次，對(duì)于對(duì)人類致病的病毒，如有疫苗株，只允許疫苗株用于外源基因的表達(dá)載體；另外，對(duì)操作防護(hù)條件也提出了明確的要求，具有復(fù)制能力的重組活病毒(復(fù)制型重組病毒)，要求不低于其母本病毒；復(fù)制缺陷型病毒不得低于BSL-2的防護(hù)條件。常見病毒載體的生物安全分類見表2。

表1 常見病毒載體基本特性

表2 常見病毒載體的生物安全分類

3 病毒載體科研相關(guān)的生物安全風(fēng)險(xiǎn)分析

病毒載體的實(shí)驗(yàn)室生物安全主要包含病毒載體母體以及載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)過程中使用和誘發(fā)的各類基因片段、重組基因片段。由于生命科學(xué)和生物技術(shù)的特殊性，病毒載體母體及各類基因片段一旦進(jìn)入環(huán)境，就會(huì)對(duì)人體健康和生態(tài)安全造成潛在威脅。

病毒載體的構(gòu)建及生產(chǎn)，為了開發(fā)更加高效的載體以及引入有治療作用的基因，在分子生物學(xué)水平對(duì)病毒基因及治療基因進(jìn)行編輯整合。未轉(zhuǎn)染之前的基因編輯一般在普通實(shí)驗(yàn)室下完成，處理不當(dāng)或不及時(shí)處理，可導(dǎo)致各種基因片段暴露于實(shí)驗(yàn)室。暴露的基因片段為重組提供的模板和可能，如果污染了我們已經(jīng)構(gòu)建好的具有特定療效的新型基因治療產(chǎn)品，那么因?yàn)槲廴居锌赡茉斐扇康墓ぷ鳉в谝坏Ａ硗?，?duì)環(huán)境的染污還有可能造成潛在有風(fēng)險(xiǎn)的新的微生物的出現(xiàn)。

新構(gòu)建病毒載體療效評(píng)價(jià)，新的病毒載體構(gòu)建好之后一般先在細(xì)胞水平評(píng)價(jià)體外療效，然后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體內(nèi)療效。細(xì)胞水平的評(píng)價(jià)常做的實(shí)驗(yàn)是病毒的殺傷和復(fù)制實(shí)驗(yàn)。這2個(gè)實(shí)驗(yàn)容易忽視的關(guān)鍵點(diǎn)是感染細(xì)胞之后剩余的少量病毒及實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后細(xì)胞培養(yǎng)板中殘存的病毒。腫瘤病毒基因治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，目前以皮下腫瘤模型為主。瘤內(nèi)注射治療時(shí)，由于病毒的注射可以使瘤內(nèi)壓力都加，可導(dǎo)致病毒從瘤內(nèi)射出，造成科研工作人員的面部暴露。動(dòng)物的掙扎或工作人員出現(xiàn)差錯(cuò)容易發(fā)生注射針頭刺傷也是很重要的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。另外，手術(shù)、取材及尸體處理等都是潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

4 防控措施

有針對(duì)性開展生物安全知識(shí)教育，增強(qiáng)科研工作者的生物安全意識(shí)。魏明等[8]調(diào)查某醫(yī)學(xué)院本科生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全防護(hù)知識(shí)知曉情況，結(jié)果顯示50.3%醫(yī)學(xué)生對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全的概念不清，52.3%學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)室感染事件、實(shí)驗(yàn)室安全認(rèn)識(shí)不夠，86.9%學(xué)生不了解實(shí)驗(yàn)室生物安全法律法規(guī)。不難看出，實(shí)驗(yàn)室生物安全事故多為人為事故的原因。痘苗病毒作為最常用的載體之一，魏強(qiáng)等[9]通過文獻(xiàn)分析了痘苗病毒實(shí)驗(yàn)室獲得性感染病例的狀況及特征，發(fā)現(xiàn)52.9%病例是在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中意外針刺手部而導(dǎo)致感染，70.6%病例感染部位發(fā)生在手部，暴露后平均5.1天出現(xiàn)感染癥狀。僅2例病例在出現(xiàn)意外情況后及時(shí)采取了現(xiàn)場(chǎng)沖洗、消毒等應(yīng)急處理措施，及時(shí)就醫(yī)，并如實(shí)向醫(yī)生說明工作中接觸痘苗病毒情況。多數(shù)病例在發(fā)生意外后，并未采取應(yīng)急措施，麻痹大意、繼續(xù)工作，事后在出現(xiàn)癥狀后方去就診。由于一個(gè)實(shí)驗(yàn)室所采用的病毒載體都是確定的，所以其生物安全教育培訓(xùn)的內(nèi)容就需要有針對(duì)性、更詳細(xì)。

做好日常防護(hù)及應(yīng)急預(yù)案。病毒載體的弱致病性，長(zhǎng)期致使科研工作者們忽視其生物安全。例如，對(duì)腫瘤動(dòng)物模型進(jìn)行治療時(shí)，帶上防護(hù)面具對(duì)動(dòng)物治療，實(shí)驗(yàn)操作的方便程度就會(huì)大降低。這也是日常防護(hù)難以有效執(zhí)行的一個(gè)原因。另外，日常防護(hù)用具的選擇也十分重要。現(xiàn)在市場(chǎng)上各種產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，高質(zhì)量的防護(hù)用具有利于日常防護(hù)的執(zhí)行。另外，科研工作者發(fā)生意外后及時(shí)進(jìn)行必要的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急處置，及時(shí)就診并向醫(yī)生提供研究背景信息應(yīng)是預(yù)防和控制痘苗病毒實(shí)驗(yàn)室獲得性感染的重要方面。

[1] 關(guān)大剛，鄭旭.重組人p53腺病毒注射液(今又生)臨床研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19(12)：2560-2563.

[2] 石亮，劉云波.腺相關(guān)病毒的特性及應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016,22(11):2088-2092.

[3] 孫友松.2015年10月美國(guó)和歐盟新批準(zhǔn)藥物概述[J].藥學(xué)進(jìn)展，2015,39(10):794-800.

[4] 黃文林,徐志凱,董小平.分子病毒學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2016:384-388.

[5] 基因工程安全管理辦法[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,1994,74(9):577-580.

[6] 病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2004,(12):19-21.

[7] 衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《人間傳染的病原微生物名錄》的通知[J].中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部公報(bào),2006,(2):32-52.

[8] 魏明,倪嘉莉,趙冬,等.醫(yī)學(xué)院本科生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全防護(hù)知識(shí)調(diào)查[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,29(15):2296-2297.

[9] 魏強(qiáng)，盧選成，武桂珍.痘苗病毒實(shí)驗(yàn)室獲得性感染病例的狀況及特征分析[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2013,27(1):73-75.

張忠獻(xiàn)(1984-)，男，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事細(xì)胞與基因治療相關(guān)研究。E-mail：zhzhx110@126.com

王堯河(1965-)，男，博士，教授，主要從事細(xì)胞與基因治療相關(guān)研究。E-mail：yaohewang@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.029

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2016-01-22)