艾海權(quán)，臘曉琳，鞏曉蕓，李霞，朱玥潔，丁劍冰，瑪依熱·吐爾遜*

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科生殖助孕中心生殖醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830054；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，烏魯木齊 830011)

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Th17及Treg相關(guān)因子在反復(fù)種植失敗患者種植窗口期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

艾海權(quán)1，臘曉琳1，鞏曉蕓1，李霞1，朱玥潔1，丁劍冰2，瑪依熱·吐爾遜1*

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科生殖助孕中心生殖醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830054；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，烏魯木齊 830011)

目的 通過研究種植窗口期子宮內(nèi)膜中Treg及Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況，探討反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中Treg/Th17平衡調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。 方法 建立種植窗口期子宮內(nèi)膜標(biāo)本庫(kù)。從標(biāo)本庫(kù)選擇2013年10月至2014年12月收集的符合實(shí)驗(yàn)要求的反復(fù)種植失敗患者(實(shí)驗(yàn)組)及首次移植妊娠患者(對(duì)照組)各20例，采用定量RT-PCR測(cè)量?jī)?nèi)膜標(biāo)本中的Treg、Th17特異性表達(dá)因子Foxp3和ROR-γt及相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、IL-17表達(dá)情況。 結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜上均可見Foxp3、ROR-γt及細(xì)胞因子IL-10、IL-17表達(dá)；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量[(0.77±0.15) vs.(1.57±1.22)]及IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量[(1.14±1.03) vs.(1.54±1.77)]均顯著降低(P<0.05)，而ROR-γt mRNA的相對(duì)表達(dá)量[(0.92±0.39) vs.(0.55±0.15)]及IL-17 mRNA的相對(duì)表達(dá)量[(0.95±0.31) vs.(0.49±0.21)]均顯著升高(P<0.05)。 結(jié)論 IL-17、IL-10可能參與內(nèi)膜中Th17/Treg平衡調(diào)節(jié)。

Treg； Th17； 反復(fù)種植失敗； 子宮內(nèi)膜容受性； 種植窗

Methods：The endometrial specimens bank in the implantation window phase was established. A total of 40 specimens met the experimental requirements were collected from October 2013 to December 2014. Among them，20 specimens were from the patients with repeated implantation failure as experimental group，and another 20 specimens from the pregnancy patients in their first transplantation as the control group. The expressions of Foxp3，ROR-γt，IL-10，and IL-17 in endometrial specimens were measured by quantitative RT-PCR.

Results：Foxp3，ROR-γt，IL-10，and IL-17 in endometrium were expressed in both experimental group and control group. The mRNA expressions of Foxp3(0.77 ± 0.15 vs. 1.57 ± 1.22)and IL-10(1.14 ± 1.03 vs. 1.54 ± 1.77)in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). The mRNA expressions of ROR-γt(0.92 ± 0.39 vs. 0.55 ± 0.15)and IL-17(0.95 ± 0.31 vs. 0.49 ± 0.21) in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P<0.05).

Conclusions：IL-10 and IL-17 may involve in regulation balance of Th17/Treg.

(JReprodMed2016，25(11)：1013-1017)

不孕癥嚴(yán)重影響患者的身心健康，己成為一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題。輔助生殖技術(shù)(ART)為不孕癥治療開辟了新篇章，隨著這一技術(shù)及其衍生技術(shù)的飛速發(fā)展，治療周期中獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的數(shù)量增多，但臨床妊娠率卻始終徘徊在40%～70%，而且胚胎種植率一直波動(dòng)于25%～35%之間。胚胎種植失敗成為輔助生殖治療失敗的最大原因。在排除宮腔形態(tài)異常、染色體異常、輸卵管積水、子宮內(nèi)膜病變等因素后，多次移植優(yōu)質(zhì)胚胎仍未妊娠，稱為反復(fù)種植失敗(RIF)，在ART治療中的發(fā)生率約為10%[1]。

胚胎種植是一種成功的半同種移植，有賴于免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[2-3]，RIF可能與機(jī)體的同種免疫功能異常有關(guān)[4]。Treg/Th17平衡在反復(fù)自然流產(chǎn)患者中的作用已被證實(shí)，但Treg/Th17平衡是否參與胚胎種植過程中的免疫調(diào)節(jié)及其機(jī)理尚不明確。本研究通過比較RIF患者種植窗口期子宮內(nèi)膜中Treg及Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，探討RIF患者子宮內(nèi)膜中Treg/Th17平衡調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。

資料與方法

一、研究對(duì)象

1.建立標(biāo)本庫(kù)：在進(jìn)行該研究前嚴(yán)格建立標(biāo)本庫(kù)。對(duì)于擬在我中心行助孕治療的不孕癥夫婦完全按照患者知情同意并自愿原則下采集子宮內(nèi)膜標(biāo)本。

黃體中期(B超監(jiān)測(cè)排卵后6～8 d)采集子宮內(nèi)膜標(biāo)本。所取子宮內(nèi)膜標(biāo)本經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗后，一式3份置入凍存管，立即凍存于液氮罐中。所有標(biāo)本采集后加以相應(yīng)處理，最后轉(zhuǎn)移至我院醫(yī)學(xué)研究中心標(biāo)本庫(kù)-80℃低溫冰箱內(nèi)統(tǒng)一保存以備用。

2.選取研究對(duì)象：從標(biāo)本庫(kù)中選取符合實(shí)驗(yàn)要求的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各20例。實(shí)驗(yàn)組為符合RIF診斷標(biāo)準(zhǔn)(在我院至少3次移植優(yōu)質(zhì)胚胎均未孕)的患者，對(duì)照組為第1次移植1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎即妊娠的患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡35歲以下，均有1次或1次以上IVF/ICSI治療史，均有優(yōu)質(zhì)的胚胎移植，月經(jīng)規(guī)律，內(nèi)分泌正常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜病變、宮腔形態(tài)異常、輸卵管積水、卵巢反應(yīng)不良、染色體異常、性傳播疾病、抗精子抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗心磷脂抗體、抗卵巢抗體陽(yáng)性的患者[1]。

嚴(yán)密跟蹤隨訪不孕癥夫婦治療結(jié)局。

二、研究方法

1.總RNA提取及RNA純度和濃度鑒定：所有用品均嚴(yán)格按消除RNase的常規(guī)方法處理。嚴(yán)格按照Trizol(Invitrogen，美國(guó))說明書操作提取子宮內(nèi)膜組織總RNA。將所提取的內(nèi)膜組織總RNA用適量DEPC水稀釋后，用分光光度計(jì)ND1000(NanoDrop，美國(guó))定量，測(cè)其OD 260與OD 280值，并計(jì)算OD 260/OD 280，當(dāng)此比值在1.8～2.0時(shí)，說明提取的RNA較純，無殘余蛋白質(zhì)和DNA。另外，根據(jù)OD260值可以計(jì)算RNA濃度：RNA(μg/μl)=OD 260×稀釋倍數(shù)×40/1 000[5]。

2.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及電泳鑒定：嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，加拿大)說明書操作步驟反轉(zhuǎn)RNA為cDNA。

3.引物設(shè)計(jì)和合成：從GeneBank中檢索人Foxp3、ROR-γt、IL-10、IL-17和GAPDH基因引物序列，在線Genbank查找目的基因Foxp3、ROR-γt和IL-10、IL-17cDNA序列，應(yīng)用DNA MAN軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由上海生工生物公司合成。

表1 定量RT-PCR所用的基因引物

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Foxp3反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃30 s，95 ℃15 s、56 ℃30 s；ROR-γt反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃15 s、54.4 ℃30 s；IL-10反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃30 s，95 ℃15 s、56.5 ℃ 30 s；IL-17反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃30 s，95 ℃15 s、55.5 ℃30 s；GAPDH反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95 ℃30 s，95℃15 s、58 ℃30 s。反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。并繪制熔解曲線，記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。采用相對(duì)定量法2﹣ΔΔCt法(2﹣ΔΔCt法：實(shí)驗(yàn)每次重復(fù)2次，取平均值。然后算出每個(gè)樣本該基因相對(duì)與內(nèi)參的變化，即用對(duì)照組或RIF組Ct值減去內(nèi)參Ct值得到ΔCt)處理定量PCR數(shù)據(jù)，確定特定熒光閾值對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值，對(duì)目標(biāo)基因定量[5]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組資料用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)圖表采用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

結(jié) 果

一、一般資料

實(shí)驗(yàn)組20例，年齡21.5～34.5歲，平均(29.6±3.8)歲，原發(fā)不孕13例，繼發(fā)不孕7例，不孕年限1.0～7.9年，平均(3.1±2.6)年；對(duì)照組20例，年齡20.8～34.8歲，平均(30.4±3.5)歲，原發(fā)不孕11例，繼發(fā)不孕9例，不孕年限1.2～8.6年，平均(3.4±2.9)年。兩組在年齡、不育年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌3項(xiàng)及體重指數(shù)(BMI)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

二、定量RT-PCR結(jié)果

Foxp3及IL-10的mRNA相對(duì)表達(dá)水平在對(duì)照組顯著高于實(shí)驗(yàn)組(RIF組)(P<0.01)，而ROR-γt及IL-17的mRNA相對(duì)表達(dá)水平在對(duì)照組顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)(圖1、表3)。

表2 兩組患者一般資料比較 (x-±s)

組別Foxp3IL-10ROR-γtIL-17對(duì)照組1.57±1.221.54±1.170.55±0.150.49±0.21實(shí)驗(yàn)組0.77±0.15*1.14±1.03*0.92±0.39*0.95±0.31*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

討 論

正常妊娠時(shí)精子與卵母細(xì)胞在輸卵管內(nèi)受精形成受精卵進(jìn)一步發(fā)育到達(dá)宮腔，胚胎在子宮內(nèi)膜定位、粘附、侵入并使內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生改變從而使胚胎著床的時(shí)間為排卵后6～7 d。大部分研究認(rèn)為排卵后6～7 d時(shí)子宮內(nèi)膜接受胚胎的能力達(dá)到最大，在其他時(shí)間子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎處于不容受階段，因此把這一時(shí)期定義為“種植窗口期”[6-7]。ART過程中通常將所獲得的胚胎在種植窗口期前植入子宮，胚胎在子宮腔內(nèi)與子宮內(nèi)膜相互適應(yīng)并植入子宮內(nèi)膜。但對(duì)于多次移植失敗的患者，無論經(jīng)濟(jì)上和精神上都承受著極大的打擊，給患者本人及其家庭均帶來極大的經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)。因此關(guān)于此期間子宮內(nèi)膜的研究越來越多，本研究中實(shí)驗(yàn)組為3次移植每次至少1枚優(yōu)胚而未孕者，且排除其他影響胚胎種植的因素，故考慮胚胎種植失敗可能與此期間內(nèi)膜容受有關(guān)。

胚胎是來自母體的卵母細(xì)胞和來自父系的精子結(jié)合的產(chǎn)物，它攜帶1/2有異于母體的組織抗原，被認(rèn)為是一種半同種異體抗原，胚胎植入過程受胚胎及子宮內(nèi)膜的免疫細(xì)胞共同調(diào)節(jié)，母體對(duì)胚胎抗原的免疫排斥和內(nèi)膜對(duì)胚胎抗原的免疫耐受達(dá)到平衡才可能使胚胎順利著床，當(dāng)這種平衡偏向免疫排斥從而出現(xiàn)炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)時(shí)就可能導(dǎo)致胚胎種植失敗[4]。

Treg細(xì)胞來源于naive T細(xì)胞，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能。Foxp3為Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Treg活化和免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮主導(dǎo)作用，同時(shí)Foxp3可反映Treg細(xì)胞的活性水平[8-9]。Shima等[10]報(bào)道，母體的Treg能抑制半同種抗原引起的母體對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)，在胚胎種植期及妊娠早期維持妊娠免疫耐受起重要作用。婁華等[4]通過比較淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療對(duì)RIF患者外周血Treg表達(dá)的影響，最后認(rèn)為RIF的發(fā)生可能與Treg的表達(dá)下降有關(guān)。Th17細(xì)胞同樣來源于naive T細(xì)胞，但與Treg細(xì)胞屬于兩種不同作用的細(xì)胞亞群，Th17主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，控制Th17細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子為ROR-γt[8]。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)與正常妊娠婦女相比，反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周血及蛻膜中Thl7細(xì)胞數(shù)量劇增，并且Thl7/Treg比例失衡[12]。

Th17及Treg細(xì)胞在數(shù)量上保持動(dòng)態(tài)平衡，在功能上相互影響相互制約[13-14]。Treg細(xì)胞可通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮抗炎和維持自身免疫耐受[8，15]。IL-10在機(jī)體內(nèi)參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子，而IL-17是由Th17細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[8]，IL-17 的表達(dá)可抑制Treg 增殖[14]。有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞中IL-10的表達(dá)量明顯低于正常妊娠婦女[16]，也有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)婦女蛻膜組織中IL-17表達(dá)明顯高于正常妊娠[17]。因此，在Treg/Th17細(xì)胞模式中RIF患者可能通過調(diào)節(jié)IL-10和IL-17的表達(dá)而引起其失衡[14，17]。

近年來Treg/Thl7平衡在生殖領(lǐng)域研究越來越多，但子宮內(nèi)膜局部的Treg及Th17的研究尚少。我們前期采用免疫組化研究種植窗口期子宮內(nèi)膜標(biāo)本中Treg及Th17細(xì)胞表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在RIF患者及首次移植妊娠患者子宮內(nèi)膜上均可見Foxp3和ROR-γt表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜，但RIF患者內(nèi)膜中的Treg/Thl7平衡偏向Thl7，首次移植妊娠者內(nèi)膜中的Treg/Thl7平衡偏向Treg，提示Treg/Thl7平衡可能參與胚胎種植的免疫過程(未發(fā)表資料)。本研究進(jìn)一步通過對(duì)種植窗口期子宮內(nèi)膜標(biāo)本采用定量RT-PCR測(cè)量Treg及Th17的特異轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和ROR-γt的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在首次移植妊娠組Foxp3表達(dá)增加、ROR-γt表達(dá)下降，Treg/Th17比值增加，而反復(fù)種植失敗組的Treg/Th17比值下降，與文獻(xiàn)報(bào)道中的外周血Treg/Th17平衡一致[4]，也印證了我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)本研究中還發(fā)現(xiàn)作為炎癥和免疫抑制的重要細(xì)胞因子IL-10在首次移植妊娠組表達(dá)增加，而參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子IL-17在反復(fù)種植失敗組表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道中的在Treg/Th17細(xì)胞模式中RIF患者可能通過調(diào)節(jié)IL-10和IL-17的表達(dá)而引起其失衡結(jié)論一致[14，17]。

綜上所述，IL-17、IL-10可能參與種植窗口期子宮內(nèi)膜局部Th17/Treg平衡調(diào)節(jié)。但由于本研究中例數(shù)較少，尚需進(jìn)一步完善。

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[編輯：羅宏志]

Expression of Th17 and Treg in endometrium during implantation window phase in patients with repeated implant failure

AI Hai-quan1，LA Xiao-lin1，GONG Xiao-yun1，LI Xia1，ZHU Yue-jie1，DING Jian-bing2，MA Yi-re·Tu-er-xun1*

1.DepartmentofReproductiveMedicine，theFirstaffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054 2.DepartmentofImmunology，SchoolofBasicMedicalSciences，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011

Objective：To investigate the expression of specific transcription factors and related cytokines of Treg and Th17 in the endometrium，and explore the mechanism of regulation balance of Th17/Treg in patients with repeated implant failure.

Treg；Th17； Repeated implantation failure； Endometrial receptivity； Implantation window

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.012

2016-07-06；

2016-08-22

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013ZRZD019)

艾海權(quán)，女，湖北浠水人，碩士，主治醫(yī)師/講師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*