曾玉翠，陳蕓，曾荔蘋，湯惠茹，吳瑞芳，3*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院超聲科，3.深圳市婦科腫瘤醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究開發(fā)中心，深圳 518036)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

不同玻璃液凍存卵巢組織移植于雞胚前后的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡研究

曾玉翠1，陳蕓2，曾荔蘋1，湯惠茹1，吳瑞芳1，3*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院超聲科，3.深圳市婦科腫瘤醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究開發(fā)中心，深圳 518036)

目的 研究不同玻璃液(VS)保護(hù)下凍存的卵巢組織移植于雞胚前后的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡情況，以評(píng)估不同玻璃液的冷凍保護(hù)效果。 方法 將卵巢組織分割成1～2 mm×1 mm×1 mm的小塊分別放入VS1、VS2、VS3、VS4 4種不同的玻璃液中，經(jīng)過4種玻璃液平衡后凍存并復(fù)蘇的卵巢組織稱為凍存卵巢組織(FOT)，分別將經(jīng)4種玻璃液凍存的FOT移植到胚齡10 d的雞卵絨毛尿囊膜(CAM)上培養(yǎng)，于雞卵胚齡16 d取出移植于CAM的卵巢組織(TOT)，以未經(jīng)玻璃液平衡的新鮮卵巢組織為對(duì)照(COT)，分析4種玻璃液保存的FOT、TOT、COT中線粒體活性、細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平和間質(zhì)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 線粒體活性：經(jīng)過VS1、VS3和VS4凍存的FOT和TOT中的線粒體活性低于COT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)VS2凍存的TOT與COT中線粒體活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平：經(jīng)過VS1、VS3和VS4凍存的FOT和TOT細(xì)胞內(nèi)ROS水平低于COT，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；經(jīng)VS2凍存的FOT細(xì)胞內(nèi)ROS水平與COT組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。間質(zhì)細(xì)胞凋亡情況：經(jīng)過VS1、VS2、VS3和VS4平衡的FOT間質(zhì)細(xì)胞凋亡率和COT組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 由玻璃液VS2保護(hù)凍存卵巢組織的冷凍損傷小、移植后缺血損傷輕，是本研究?jī)?yōu)化的卵巢冷凍保護(hù)玻璃液；玻璃化冷凍對(duì)間質(zhì)細(xì)胞損傷小，適于人卵巢組織的冷凍保存。

玻璃液；卵巢組織；氧化應(yīng)激；凋亡

Methods：Human ovarian tissues were dissected to 1-2 mm×1 mm×1 mm size，and then put into in four kinds of vitrification solutions(VS1，VS2，VS3，VS4)for cryopreservation.Part of the frozen ovarian tissues(FOT)was grafted into CAM.The transplanted ovarian tissues(TOT)were collected 5 days after transplantation.The tissue without treatment was as control ovarian tissue(COT).The mitochondrial activity，reactive oxygen species(ROS)and apoptosis of stromal cells in COT，F(xiàn)OT and TOT after cryopreservation with four different vitrification solutions were evaluated and compared.

Results：Mitochondrial activity of tissue after cryopreservation with VS1，VS3 or VS4 was significantly lower than COT(P<0.05).TOT after cryopreservation with VS2 was not significant different with COT(P>0.05).ROS levels in FOT and TOT after cryopreservation with VS1，VS3 or VS4 were significantly lower than COT(P<0.05).ROS levels in FOT with VS2 were not significantly different with COT(P>0.05).There was no significant difference in apoptosis between FOT and COT among the four VS groups(P>0.05).

Conclusions：VS2 results in a higher level of mitochondrial activity and ROS，therefore，it is an optimal solution.Vitrification cryopreservation shows little damage to stromal cells，which is an alternative way to protect human ovarian tissue.

(JReprodMed2016，25(11)：1006-1012)

近年來隨著腫瘤診療技術(shù)的提高，越來越多的年輕腫瘤患者治療后可長(zhǎng)期生存。然而，大劑量的放化療藥物對(duì)生殖腺毒性作用，導(dǎo)致患者在腫瘤治療結(jié)束后出現(xiàn)卵巢早衰和不孕。研究證實(shí)，在抗腫瘤治療前凍存患者卵巢組織來保護(hù)其生育力是一個(gè)行之有效的方法[1]。

玻璃化冷凍因不需要特殊設(shè)備、操作簡(jiǎn)單，被認(rèn)為是慢速冷凍的替代方案。在卵巢組織玻璃化冷凍過程中，玻璃化冷凍保護(hù)液，簡(jiǎn)稱玻璃液(vitrification solution，VS)對(duì)組織的滲透毒性和化學(xué)毒性可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，抗凍保護(hù)作用降低，發(fā)生組織的冷凍損傷。本文通過激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)與原位末端標(biāo)記(TUNEL)法，研究由不同玻璃液凍存的卵巢組織移植于雞胚前后氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞的凋亡，用以評(píng)估不同玻璃液的冷凍保護(hù)效果。

材料和方法

一、材料

1.人卵巢組織的獲?。罕狙芯糠桨傅玫奖本┐髮W(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，卵巢組織來源于1位因子宮內(nèi)膜癌行雙側(cè)卵巢切除術(shù)的39歲患者。手術(shù)中卵巢組織離體后立即取材，剖開雙側(cè)卵巢組織，各切取一半，置于盛有6 ml 經(jīng)HEPES緩沖的M199培養(yǎng)液(含20%胎牛血清和100 μg/ml青/鏈霉素)的離心管中，15 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

2.卵巢組織的處理與分組：將送至實(shí)驗(yàn)室的卵巢組織去除血跡和髓質(zhì)及肉眼可見的卵泡與黃體等周期性結(jié)構(gòu)后，分割成40余個(gè)1～2 mm×1 mm×1 mm的小塊。將分割的小塊卵巢組織每10塊為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，共4組；同時(shí)留取4塊新鮮卵巢組織作為對(duì)照組(COT)，其中2塊立即用4%多聚甲醛固定，待原位末端標(biāo)記法(TUNEL)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，另2塊經(jīng)MitoTracker Orange CMTMRos和2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯孵育后(具體步驟見下文)用2%甲醛固定，待測(cè)線粒體活性和氧化應(yīng)激水平。

二、主要試劑及配制

M199(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(FBS，Gibco，美國(guó))；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(武漢博士德)；MitoTracker Orange CMTMRos(M7510，LifeTechnologies，美國(guó))；2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCF)、蔗糖、海藻糖(Sigma，美國(guó))。

4種玻璃液(VS1-VS4)的選擇與配制參閱文獻(xiàn)如下：

VS1：7.5% 乙二醇(EG)+7.5%二甲亞砜(DMSO)+M199，15% EG+15% DMSO+M199[2]；

VS2：7.5% EG+7.5% DMSO+基礎(chǔ)液(M199+20% FBS)，15% EG+15% DMSO+0.5 mol/L蔗糖+M199+20% FBS[3]；

VS3：25%(EG+DMSO)+M199+20% FBS[4]；

VS4：10%(EG+DMSO)+0.1 mol/L蔗糖+0.1 mol/L海藻糖+6% FBS+M199，20%(EG+DMSO)+0.3 mol/L蔗糖+0.1 mol/L海藻糖+6% FBS+M199[5]。

以上滲透性冷凍劑均購(gòu)于Sigma公司。

三、研究方法

1.卵巢組織的凍存：參閱前期研究[6]，平衡時(shí)間見表1。各實(shí)驗(yàn)組卵巢組織塊分別經(jīng)不同玻璃液平衡后置于金屬網(wǎng)格載體，以滅菌紗布吸走多余玻璃液，投入裝有液氮的泡沫箱中，冷凍后將組織連同載體置于預(yù)冷后的1.8 ml冷凍管(Corning)中，投入液氮罐中冷凍保存。

表1 各實(shí)驗(yàn)組卵巢組織平衡時(shí)間

2.卵巢組織的凍融：卵巢組織凍存2周后，取出金屬網(wǎng)格載體，置于空氣中30 s，迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴，將卵巢組織依次移入蔗糖濃度梯度為1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.125 mol/L的解凍液中各5 min，復(fù)融組織塊，漂洗卵巢組織3次。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每組凍融的10個(gè)卵巢組織塊中各取出兩塊以4%多聚甲醛固定，用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)；每組取3塊組織行線粒體活性和活性氧自由基(ROS)水平檢測(cè)；剩余的5塊組織用于雞胚移植。

3.凍融卵巢組織塊雞胚移植：雞胚準(zhǔn)備同前期研究[6]，將受精雞卵放入37℃孵箱中孵育至雞胚胚齡第10 天取出。內(nèi)徑為5 mm的硅膠環(huán)置于去除了上細(xì)胞層的CAM上，用眼科鑷將復(fù)融的卵巢組織塊置于硅膠環(huán)內(nèi)。如此將4種玻璃液保護(hù)下凍融的各5塊卵巢組織分別移植到20個(gè)雞胚CAM上，并在雞卵外殼上標(biāo)記編號(hào)。移植卵巢組織塊后雞胚繼續(xù)孵育5 d，于雞胚胚齡第16天取出，將移植的卵巢組織塊連同CAM一起取材。將取下的卵巢組織塊中的2塊以4%多聚甲醛固定，進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，其余3個(gè)卵巢組織塊行線粒體活性和ROS水平檢測(cè)。

4.線粒體活性與ROS檢測(cè)：經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)，獲得了3類卵巢組織塊，即分別經(jīng)4種玻璃液平衡后冷凍復(fù)融的卵巢組織塊(FOT)；取下移植5 d后的卵巢組織(TOT)；新鮮的對(duì)照組卵巢組織(COT)。

參照Martino等[7]介紹的方法，取FOT、TOT與 COT置于10% FBS+PBS+280 nmol/L MitoTracker Orange CMTMRos中，在37℃、6% CO2條件下孵育45 min定位和檢測(cè)線粒體活性；再將卵巢組織置于10% FBS+PBS+10 μmol/L 2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯中孵育45 min，檢測(cè)ROS水平。上述處理后的卵巢組織于2%甲醛固定。組織脫水、包埋，制作30 μm厚切片，每個(gè)組織塊取兩張連續(xù)切片。

將制好的玻片置于CLSM(200×)上，M7510激發(fā)出桔色熒光代表有活性的線粒體。DCF激發(fā)出綠色熒光代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平。每張玻片取3個(gè)視野(23 000 pixel2)分析熒光強(qiáng)度，涉及熒光強(qiáng)度的所有參數(shù)設(shè)置恒定。

5.TUNEL法凋亡檢測(cè)：FOT、TOT與 COT制作5 μm厚切片，具體操作步驟參照試劑盒說明書。由于卵巢組織塊小及卵泡數(shù)少，本文僅分析卵巢間質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性表現(xiàn)為核染成棕黃色，凋亡率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)LSD法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

4種玻璃液凍存的卵巢組織塊經(jīng)復(fù)融后，各取5塊分別移植到雞胚CAM上，移植后繼續(xù)孵育5 d，移植的卵巢組織上都長(zhǎng)了新生血管，質(zhì)地柔軟，判斷組織塊全部存活。

二、不同玻璃液凍存的卵巢組織中線粒體活性與ROS水平的定性分析比較

將不同玻璃液凍存的凍融卵巢組織塊(FOT)、移植后(TOT)與新鮮組織塊(COT)進(jìn)行線粒體活性和ROS水平檢測(cè)，觀察到卵巢組織切片均標(biāo)記上了M7510激發(fā)的桔色熒光和DCF激發(fā)的綠色熒光染料，表明熒光染料組織滲透完全。

結(jié)果顯示，在CLSM下觀察卵巢FOT、TOT與COT的M7510和DCF激發(fā)熒光強(qiáng)度不一，即4種不同玻璃液凍存的卵巢組織塊冷凍損傷程度不同，新鮮對(duì)照組與VS2玻璃液保護(hù)的FOT及TOT熒光較強(qiáng)，說明其線粒體活性和ROS水平較高(圖1A～D)；玻璃液VS1、VS3和VS4保存的FOT及TOT熒光較弱，說明其線粒體活性和ROS水平較低(圖1E～H)。

M7510熒光強(qiáng)度代表線粒體活性(桔色)；DCF熒光強(qiáng)度代表ROS水平(綠色)。A：COT的M7510熒光強(qiáng)度；B：玻璃液VS2保護(hù)下FOT的M7510熒光強(qiáng)度；C：COT的DCF熒光強(qiáng)度；D：玻璃液VS2保護(hù)下FOT的DCF熒光強(qiáng)度；E：玻璃液VS1保護(hù)下FOT的M7510熒光強(qiáng)度；F：玻璃液VS4保護(hù)下TOT的M7510熒光強(qiáng)度，可見細(xì)胞壞死帶(藍(lán)色箭頭所指處)，G：玻璃液VS1保護(hù)下FOT的DCF熒光強(qiáng)度；H：玻璃液VS4保護(hù)下TOT的DCF熒光強(qiáng)度，可見細(xì)胞壞死帶(藍(lán)色箭頭所指處)圖1 不同玻璃液凍存的卵巢組織復(fù)融與CAM移植后的線粒體活性和ROS水平定性分析

三、不同玻璃液凍存的卵巢組織中線粒體活性與ROS水平的定量分析比較

在CLSM下，對(duì)反應(yīng)卵巢組織線粒體活性的M7510和代表氧化應(yīng)激狀態(tài)的DCF激發(fā)的熒光信號(hào)進(jìn)行定量分析，由不同玻璃液保護(hù)下的FOT與TOT的結(jié)果如圖2所示。

與同組COT比較，*P<0.05；與同組FOT比較，**P<0.05；與同組TOT比較，▲P<0.05圖2 不同玻璃液凍存的卵巢組織復(fù)融與CAM移植后的線粒體生物能和ROS水平定量分析

線粒體活性：FOT線粒體活性在玻璃液VS1(3.32±1.06)、VS2(3.87±1.24)、VS3(5.75±2.14)和VS4(6.44±2.61)中低于COT(15.66±4.22)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TOT線粒體活性在玻璃液VS1(5.44±3.06)、VS3(5.36±3.46)和VS4(4.69±2.09)中與對(duì)應(yīng)的同一種玻璃液的FOT相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；而VS2的TOT(12.57±3.10)與VS2的FOT相比，線粒體活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)，說明玻璃化冷凍卵巢組織的線粒體產(chǎn)生了一定程度的損傷，VS2玻璃液保護(hù)下冷凍的卵巢組織線粒體活性得到了較好的恢復(fù)，而其他3種玻璃液保護(hù)下冷凍的卵巢組織移植后線粒體活性無(wú)改善。

ROS水平：FOT的ROS水平在玻璃液VS1(6.84±1.67)、VS3(5.23±2.98)和VS4(8.06±3.37)中低于COT(19.58±7.69)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而VS2保護(hù)的FOT的ROS水平(15.18±2.80)與COT比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)；TOT的 ROS水平在VS1(8.85±2.56)、VS3(5.04±1.37)和VS4(7.94±2.63)中與對(duì)應(yīng)的同一種玻璃液FOT相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)，即卵巢組織移植5 d后，ROS水平無(wú)改變；而VS2 保護(hù)下TOT的ROS水平(7.46±3.34)較移植前(VS2-FOT)為低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

上述結(jié)果提示，玻璃液VS1、VS3和VS4保護(hù)的FOT與TOT線粒體活性受到損傷，組織ROS下降；而玻璃液VS2保護(hù)下組織線粒體損傷程度較輕，移植后線粒體活性恢復(fù)好，并與ROS水平保持動(dòng)態(tài)的平衡。

四、不同玻璃液凍存的卵巢組織塊間質(zhì)細(xì)胞凋亡情況比較

卵巢組織復(fù)融后，間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)仍保持正常，少量的間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡(圖3A紅色箭頭所指處)。復(fù)融的卵巢組織移植5 d后，間質(zhì)細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞皺縮，較多間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡(圖3B藍(lán)色箭頭所指處)。

A：FOT凋亡細(xì)胞(紅色箭頭所指處)；B：TOT凋亡細(xì)胞(藍(lán)色箭頭所指處)；C：陽(yáng)性對(duì)照；D：陰性對(duì)照；圖3 卵巢組織冷凍復(fù)融和移植后間質(zhì)細(xì)胞凋亡情況

數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)OT的間質(zhì)細(xì)胞凋亡率在VS1(9.67±3.71)、VS2(8.50±3.20)、VS3(6.78±4.03)和VS4(9.36±3.48)中，與COT(7.95±2.89)之間并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。凍融卵巢組織移植后5 d，TOT間質(zhì)細(xì)胞凋亡率在VS1(27.02±2.09)、VS2(13.92±6.27)、VS3(30.18±8.20)和VS4(23.31±11.84)中，顯著高于對(duì)應(yīng)的同一種玻璃液的FOT和COT(P<0.05)；玻璃液VS2的TOT間質(zhì)細(xì)胞凋亡率低于其他3種玻璃液的TOT凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

與同種玻璃液的COT和FOT比較，*P<0.05；與不同種玻璃液的TOT比較，☆P<0.05圖4 各玻璃液凍存的卵巢組織的凋亡情況

4種玻璃液復(fù)融的卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞損傷輕微；VS1、VS3和VS4復(fù)融卵巢組織移植5 d后，卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加，而VS2保護(hù)的TOT間質(zhì)細(xì)胞凋亡較少，提示VS2保護(hù)的TOT移植物缺血缺氧損傷較輕。

討 論

在年輕腫瘤患者抗腫瘤治療前對(duì)其卵巢組織玻璃化凍存是保存生殖功能的有效方法。研究卵巢玻璃化冷凍及移植后線粒體功能和或氧化應(yīng)激反應(yīng)改變的報(bào)道較少[8-9]。本文通過CLSM結(jié)合TUNEL方法比較以不同玻璃液保護(hù)凍存卵巢組織的生物能、氧化應(yīng)激狀態(tài)及其細(xì)胞凋亡，并以此優(yōu)化玻璃液方案。

線粒體作為組織細(xì)胞代謝的樞紐，是活性氧自由基(ROS)生成的關(guān)鍵場(chǎng)所。ROS可透過細(xì)胞膜改變脂類、蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致線粒體的功能減退及能量產(chǎn)生障礙[10]。通常情況下細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)多種抗氧化系統(tǒng)調(diào)控線粒體ROS的平衡狀態(tài)。一旦ROS穩(wěn)態(tài)被破壞，將會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。

不同個(gè)體卵巢組織的線粒體生物能存在較大差異，本研究卵巢組織來源于同一個(gè)體，避免了人卵巢組織本身的差異。復(fù)蘇后，四種玻璃液保護(hù)下的卵巢組織生物能均降低，提示卵巢組織線粒體在玻璃化冷凍過程中易受損。VS1、VS3和VS4保護(hù)下FOT的ROS水平降低，而VS2 FOT的ROS水平與新鮮對(duì)照比較無(wú)差異。Rahimi等[10]證實(shí)凍融的卵巢組織ROS水平異常升高可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究4種玻璃液保護(hù)下FOT ROS水平無(wú)增高，且間質(zhì)細(xì)胞凋亡率與COT相比亦無(wú)增加，提示ROS水平在冷凍復(fù)融后卵巢組織的凋亡中起一定作用。

組織移植5 d后，VS1、VS3、VS4的TOT與對(duì)應(yīng)的同一種玻璃液的FOT相比，線粒體的生物能和ROS水平并沒有明顯的改善，說明該3種玻璃液對(duì)卵巢組織線粒體的損傷較為嚴(yán)重，在卵巢組織移植過程中，線粒體活性恢復(fù)慢甚至不能恢復(fù)。VS2的TOT線粒體生物能相比FOT明顯增加，同時(shí)ROS水平下降。提示，玻璃液VS2冷凍卵巢組織對(duì)線粒體損傷較輕。此時(shí)ROS水平下降的可能原因是在移植組織重新建立血供過程中，調(diào)控生物氧化功能基因未被破壞，組織在缺血應(yīng)激下線粒體相關(guān)基因被激活，但因氧供不足，組織處于“氧債”階段，因此產(chǎn)生的ROS反而減少，另外一方面由于線粒體功能恢復(fù)，卵巢組織內(nèi)抗氧化系統(tǒng)或者超氧化物歧化酶激活對(duì)自由基清除能力增加。根據(jù)Fabbri等[8]研究，卵巢組織冷凍損傷分為三種程度，嚴(yán)重冷凍損傷時(shí)，線粒體和ROS水平均明顯下降，中輕度損傷導(dǎo)致線粒體生物能升高和/或ROS水平升高或者輕微下降，無(wú)損傷時(shí)線粒體生物能和ROS水平不改變。本研究提示從卵巢組織生物能/氧化應(yīng)激水平進(jìn)行分析得出玻璃液VS2保護(hù)組織抗冷凍損傷的作用優(yōu)于其他3種玻璃液。

卵巢間質(zhì)細(xì)胞不僅可以影響卵泡外膜的形成，而且通過旁分泌因子來影響卵泡的發(fā)育和成熟。因此，間質(zhì)細(xì)胞不僅起維持卵巢組織結(jié)構(gòu)作用，還關(guān)乎凍存卵巢組織移植后內(nèi)分泌功能的恢復(fù)。本研究中復(fù)蘇后的卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞凋亡率與新鮮的卵巢組織無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明4種玻璃液方案均可以較好地保護(hù)卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞。許多研究證實(shí)玻璃化冷凍后的卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞間隙、形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)與新鮮組織相似[11-12]。但也有研究報(bào)道卵巢組織冷凍因低溫和高濃度冷凍劑等造成的物理?yè)p傷和抗氧化代謝損傷而導(dǎo)致卵巢組織細(xì)胞凋亡增加[13]。Mazoochi等[14]報(bào)道玻璃化冷凍會(huì)引起凋亡相關(guān)基因如p53、Bcl-2、Bax、Fas和FasLd等表達(dá)改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

移植后卵巢組織細(xì)胞凋亡與移植組織塊血供重建情況直接相關(guān)。移植后處于缺血缺氧狀態(tài)下，卵巢組織的損傷較為嚴(yán)重。Wang等[15]在移植動(dòng)物模型體內(nèi)注射VEGF和bFGF來縮短移植組織塊缺血缺氧的時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后細(xì)胞凋亡率與新鮮組織無(wú)差異，也有研究報(bào)道在缺血缺氧應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞反而會(huì)被激活[16]。本研究卵巢組織移植5 d后，卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞的凋亡率與新鮮組織和冷凍復(fù)蘇后的組織相比明顯增加，但VS2移植組織間質(zhì)細(xì)胞凋亡率較VS1、VS3和VS4的TOT為低，從凋亡角度提示VS2對(duì)卵巢組織的凍存效果較好。但Amorim等[17]報(bào)道移植1周后間質(zhì)細(xì)胞凋亡率與新鮮對(duì)照組差異不明顯，認(rèn)為間質(zhì)細(xì)胞凋亡與玻璃液方案并無(wú)直接的關(guān)系。

總之，玻璃化冷凍對(duì)卵巢組織間質(zhì)細(xì)胞損傷小適用于人卵巢組織的冷凍保存。玻璃液VS2對(duì)卵巢組織冷凍保存效果較好。本研究雞胚的移植時(shí)間不長(zhǎng)，后期將進(jìn)一步延長(zhǎng)移植時(shí)間，觀察血管完全建立后線粒體功能恢復(fù)和細(xì)胞凋亡情況，另外需要加大樣本量，比較不同病人的卵巢組織線粒體活性/氧化應(yīng)激水平評(píng)估疾病本身的影響及不同玻璃液之間冷凍效果的差異。

[1] Sánchez-Serrano M，Crespo J，Mirabet V，et al. Twins born after transplantation of ovarian cortical tissue and oocyte vitrification[J].Fertil Steril，2010，93：268.e11-e13.

[2] Zhou XH，Wu YJ，Shi J，et al. Cryopreservation of human ovarian tissue：comparison of novel direct cover vitrification and conventional vitrification[J].Cryobiology，2010，60：101-105.

[3] Wang Y，Xiao Z，Li L，et al. Novel needle immersed vitrification：a practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation[J].Hum Reprod，2008，23：2256-2265.

[4] Gandolfi F，Paffoni A，Papasso Brambilla E，et al. Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the cryopreservation of ovarian tissue：comparative analysis between human and animal models[J].Fertil Steril，2006，Suppl 1：1150-1156.

[5] Kagawa N，Silber S，Kuwayama M.Successful vitrification of bovine and human ovarian tissue[J].Reprod Biomed Online，2009，18：568-577.

[6] Zeng YC，Tang HR，Zeng LP，et al. Assessment of the effect of different vitrification solutions on human ovarian tissue after short-term xenotransplantation onto the chick embryo chorioallantoic membrane[J].Mol Reprod Dev，2016，83：359-369.

[7] Martino NA，Lacalandra GM，F(xiàn)ilioli Uranio M，et al. Oocyte mitochondrial bioenergy potential and oxidative stress：within-/between-subject，in vivo versus in vitro maturation，and age-related variations in a sheep model[J].Fertil Steril，2012，97：720-728.e1.

[8] Fabbri R，Vicenti R，Martino NA，et al. Confocal laser scanning microscopy analysis of bioenergetic potential and oxidative stress in fresh and frozen-thawed human ovarian tissue from oncologic patients[J].Fertil Steril，2014，101：795-804.

[9] Hatami S，Zavareh S，Salehnia M，et al. Comparison of oxidative status of mouse pre-antral follicles derived from vitrified whole ovarian tissue and vitrified pre-antral follicles in the presence of alpha lipoic acid[J].J Obstet Gynaecol Res，2014，40：1680-1688.

[10] Rahimi G，Isachenko E，Sauer H，et al. Effect of different vitrification protocols for human ovarian tissue on reactive oxygen species and apoptosis[J].Reprod Fertil Dev，2003，15：343-349.

[11] Fabbri R，Vicenti R，Macciocca M，et al. Good preservation of stromal cells and no apoptosis in human ovarian tissue after vitrification[J].Biomed Res Int，2014，2014：673537.

[12] Mathias FJ，D’Souza F，Uppangala S，et al. Ovarian tissue vitrification is more efficient than slow freezing in protecting oocyte and granulosa cell DNA integrity[J].Syst Biol Reprod Med，2014，60：317-322.

[13] Rimon E，Cohen T，Dantes A，et al. Apoptosis in cryopreserved human ovarian tissue obtained from cancer patients：a tool for evaluating cryopreservation utility[J].Int J Oncol，2005，27：345-353.

[14] Mazoochi T，Salehnia M，Pourbeiranvand S，et al. Analysis of apoptosis and expression of genes related to apoptosis in cultures of follicles derived from vitrified and non-vitrified ovaries[J].Mol Hum Reprod，2009，15：155-164.

[15] Wang L，Ying YF，Ouyang YL，et al. VEGF and bFGF increase survival of xenografted human ovarian tissue in an experimental rabbit model[J].J Assist Reprod Genet，2013，30：1301-1311.

[16] David A，Van Langendonckt A，Gilliaux S，et al. Effect of cryopreservation and transplantation on the expression of kit ligand and anti-mullerian hormone in human ovarian tissue[J].Hum Reprod，2012，27：1088-1095.

[17] Amorim CA，Dolmans MM，David A，et al. Vitrification and xenografting of human ovarian tissue[J].Fertil Steril，2012，98：1291-1298.

[編輯：侯麗]

Oxidative stress reaction and apoptosis of human ovarian tissue pre/post transplanted into chicken embryos after cryopreservation with different vitrification solutions

ZENG Yu-cui1，CHEN Yun2，ZENG Li-ping1，TANG Hui-ru1，WU Rui-fang1，3*

1.DepartmentofObstetricsandGynecology，BeijingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036 2.DepartmentofUltrasound，BeijingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036 3.ShenzhenTechnicalResearchandDevelopmentCenteronGynecologicOncology，Shenzhen518036

Objective：To evaluate the effect of cryopreservation with different vitrification solutions on oxidative stress reaction and apoptosis of human ovarian tissues before and after transplantation into chick embryo chorioallantoic membrane(CAM).

Vitrification solution； Ovarian tissue； Oxidative stress reaction； Apoptosis

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.011

2016-02-24；

2016-04-04

深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)國(guó)際合作項(xiàng)目(GJHZ20130417100103783)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目)(2013B021800095)

曾玉翠，女，江西上饒人，碩士研究生，生殖內(nèi)分泌專業(yè).(*