舒泉，陳蒙華，阮氏芳英，王慧慧，謝露

(廣西醫(yī)科大學，南寧530021)

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ERK通路阻滯劑PD98059對心肺復蘇大鼠腦組織SOD表達和細胞凋亡的影響

舒泉，陳蒙華，阮氏芳英，王慧慧，謝露

(廣西醫(yī)科大學，南寧530021)

目的 觀察ERK通路阻滯劑PD98059(PD)對心肺復蘇(CPR)后大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)表達以及腦細胞凋亡的影響。方法 采用經(jīng)食管交流電刺激誘導心室顫動建立大鼠心臟驟停/心肺復蘇 (CA/CPR)模型，將恢復自主循環(huán)(ROSC)的48只大鼠隨機分成PD組和模型組各24只，分別靜脈注射PD 0.3 mg/kg及等量生理鹽水；選擇6只大鼠為假手術組，只行手術操作不誘導CA/CPR。分別于ROSC后12、24、48、72 h時各處死6只大鼠，取腦組織；用免疫熒光標記法檢測大腦皮層組織SOD1、SOD2熒光密度及Caspase3陽性細胞，TUNEL法檢測凋亡細胞。結果 與模型組比較，PD組各時點SOD1熒光密度均明顯升高(P均<0.05)，PD組ROSC后12、24、48 h時SOD2熒光密度均明顯升高(P<均0.05)。ROSC后72 h，模型組、PD組Caspase3陽性表達率、腦細胞凋亡率均高于假手術組，而PD組Caspase3陽性表達率、腦細胞凋亡率低于模型組，P均<0.05。結論 PD治療能提高CA/CPR后模型大鼠腦組織SOD表達水平，抑制腦細胞凋亡。

心臟驟停；心肺復蘇；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路阻滯劑；細胞凋亡；超氧化物歧化酶；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

在心臟驟停(CA)患者中，心肺復蘇(CPR)后的成活率較低[1]；即使恢復自主循環(huán)(ROSC)成功者，僅3%～7%的患者能夠完全康復[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(ROS)過度產(chǎn)生在缺血/再灌注(I/R)腦細胞損傷中起重要作用[4～6]。ROS過度產(chǎn)生可造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷，最終導致細胞死亡[7]。此外，ROS還能對某種信號通路具有活化或者抑制作用[8，9]。ROS可通過抑制活化蛋白磷酸酶的活性，導致細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2信號通路激活[10]。PD98059(PD)是ERK通路阻滯劑。本課題組先前研究已證實[11，12]，CPR大鼠腦細胞凋亡與ERK通路關系密切，PD可明顯延長心室顫動大鼠CPR后的生存時間。PD治療是否能夠促進腦內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)生成，提高大鼠內(nèi)源性抗氧化能力，從而產(chǎn)生抗凋亡作用，尚不明確。2015年6～10月，我們建立CA/CPR模型，探究PD對CA/CPR后腦組織SOD表達和腦細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組與造模干預 健康的SD大鼠54只，體質(zhì)量230～380 g，不拘雌雄，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。采用經(jīng)食管交流電刺激誘導心室顫動[14]建立大鼠CA/CPR模型，將ROSC[13]的48只大鼠隨機分成PD組和模型組各24只，分別靜脈注射PD 0.3 mg/kg及等量生理鹽水；選擇6只大鼠為假手術組，只行手術操作不誘導CA/CPR。

1.2 腦組織標本采集 分別于ROSC后12、24、48、72 h時各取6只，予腹腔麻醉后立即斷頭處死，取完整腦組織-80 ℃冰箱保存。實驗結束后，取腦組織，制作石蠟切片。

1.3 腦組織SOD1、SOD2熒光密度測定 采用免疫熒光法。取腦組織石蠟切片，60 ℃烤片30 min；用二甲苯浸洗3次，每次10 min；梯度乙醇各浸泡1次，每次5 min；用自來水沖洗玻片上殘留的乙醇，PBS洗3次，每次5 min；將玻片放置在檸檬酸鈉溶液(pH 6.0)中高壓煮沸5 min,修復組織抗原；抗原修復完后，放到冰水中冷卻；PBS洗3次，每次5 min。以3.0%～3.5%的過氧化氫覆蓋組織，37 ℃恒溫箱中放置10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶對熒光的影響。PBS洗3次，每次5 min；加一抗(產(chǎn)品號：ab13498和ab13534，濃度1∶200，美國Abcam公司)孵育，4 ℃過夜；PBS洗3次，每次5 min；以二抗(產(chǎn)品號：ab150079，濃度1∶300，美國Abcam公司)孵育，37 ℃恒溫箱中1 h，注意避光。用PBS洗3次，每次5 min；以DAPI(武漢博士德公司)染核2 min，再用PBS洗3次，每次5 min；滴加適量抗熒光衰減封片劑(上海Solarbio公司)，封片。200倍光鏡下，用共軛雙聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)拍5個不同視野的熒光圖像，避免拍到有自發(fā)熒光的切片邊緣，并用專業(yè)軟件測定熒光密度。

1.4 腦組織Caspase3陽性細胞檢測 采用免疫熒光法。取腦組織石蠟切片，處理同1.3。以一抗(產(chǎn)品號：ab32351，濃度1∶200，美國Abcam公司)孵育，4 ℃冰箱中過夜；PBS洗3次，每次5 min；以二抗(產(chǎn)品號：A02110，濃度1∶100，美國Abbkine公司)孵育，37 ℃恒溫箱中1 h，注意避光；PBS漂洗3次，玻片干后加DAPI常溫反應2 min；PBS漂洗3次，玻片干后滴加抗熒光封片劑封片。200倍光鏡下，每組切片拍攝5個陽性視野，以(Caspase3陽性細胞個數(shù)/高倍視野下細胞數(shù))×100%計算Caspase3陽性細胞率。

1.5 腦細胞凋亡情況觀察 采用TUNEL法。取腦組織石蠟切片，處理同1.3；玻片干后滴加50 μL的TUNEL反應混合液 (50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻，德國Roche公司)，在暗濕盒中在37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次，每次5 min。玻片干后加DAPI常溫避光反應2 min，PBS漂洗3次，玻片干后滴加抗熒光封片劑封片。200倍光鏡下，每組切片拍攝5個陽性視野，以(TUNEL陽性細胞數(shù)/高倍視野下細胞數(shù))×100%計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織不同時點SOD1、SOD2熒光密度比較 見表1。

表1 各組大鼠腦組織不同時點SOD1、SOD2熒光密度比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 各組腦組織Caspase3陽性表達率比較 ROSC后72 h，假手術組Caspase3陽性表達率為30.6%±6.7%，模型組為52.3%±4.2%,PD組為37.4%±12.5%；模型組、PD組Caspase3陽性表達率均高于假手術組，而PD組Caspase3陽性表達率低于模型組，P均<0.05。

2.3 各組腦細胞凋亡率比較 ROSC后72 h，假手術組腦細胞凋亡率為37.0%±4.8%，模型組為67.5%±13.2%,PD組為48.6%±1.3%；模型組、PD組腦細胞凋亡率均高于假手術組，而PD組腦細胞凋亡率低于模型組，P均<0.05。

3 討論

大鼠在行CA/CPR治療后，氧化應激相關通路被激活，ROS表達迅速增加，抗氧化酶相對不足，是導致組織損傷的重要原因[10，11]。有研究表明，外源性SOD能明顯減輕動物模型的缺血再灌注損傷[12，13]。SOD按其金屬輔基的不同可分為3種：第1種叫Cu-Zn-SOD(SOD1)，呈綠色，金屬輔基為Cu、Zn，主要表達在機體細胞質(zhì)中；第2種叫Mn-SOD(SOD2)，呈紫色，金屬輔基為Mn，主要表達在原核細胞中和真核細胞的線粒體；第3種叫Fe-SOD，呈黃褐色，主要表達在原核細胞中。本研究選用大鼠建立CA/CPR模型，探究PD對腦組織SOD表達及腦細胞凋亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)，模型組腦組織SOD1和SOD2在ROSC后12、24、48 h時的熒光密度均較假手術組低，說明大鼠在實施CPR治療后，大鼠體內(nèi)對抗氧化應激損傷的能力明顯下降。PD干預治療后，大鼠腦組織中SOD1、SOD2各時間點的熒光密度均較模型組強，提示PD治療能明顯提高腦組織SOD1和SOD2的表達水平。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，CA/CPR大鼠在氧化應激后ROS活性升高與腦細胞的凋亡關系密切[11，12]，而SOD是ROS最強有力的清除劑。由此可推測，SOD對腦細胞的保護作用是通過對ROS的清除來實現(xiàn)的。ROS可促進ERK 通路的激活[10]，所以在模型組中ERK通路被ROS長期過度激活是造成腦細胞凋亡的重要原因。而在PD組中，ERK通路阻滯劑PD阻斷了ERK通路，有效抑制了氧化應激作用的信號傳導，所以PD組的腦細胞凋亡明顯較少。SOD1和SOD2表達峰值都出現(xiàn)在ROSC后48 h，提示CPR后大鼠氧化應激是一種長時程反應。

在細胞凋亡進程中，細胞核的形態(tài)變化和Caspase3的表達起著重要的提示作用。Caspase是一種很普遍的細胞凋亡驅(qū)動器，其活化是細胞程序化死亡中細胞蛋白裂解的一個重要環(huán)節(jié)[14]。活化的Caspase3能導致DNA片段化、凋亡小體形成和神經(jīng)細胞死亡。本次研究結果表明，PD組Caspase3陽性和TUNEL陽性細胞的數(shù)量明顯比模型組少，提示PD治療有抗凋亡作用，這種作用可能與SOD1和SOD2的表達增加有關。有研究表明，大鼠在氧化應激時，細胞Caspase3的表達會增多，TUNEL陽性細胞數(shù)量也會相應增多[15]。但本次研究提示,TUNEL陽性細胞明顯比Caspase3陽性細胞多，提示大鼠I/ R過程中，除Caspase3外，還有其他相關凋亡蛋白參與了凋亡。

由此可見，CPR后ERK通路被ROS長時間過度激活對腦細胞存活是不利的。在PD治療后，腦細胞的凋亡明顯受到抑制，但還是有部分細胞出現(xiàn)凋亡，可見還有其他通路參與了腦細胞凋亡過程，具體作用機制有待進一步研究。

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Effects of ERK channel blocker PD98059 on SOD expression and apoptosis of brain tissues after CPR in rats

SHUQuan,CHENMenghua,RUANSHIFangying,WANGHuihui,XIELu

(GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To observe the effects of ERK channel blocker PD98059 on the expression of superoxide dismutase (SOD) and apoptosis of brain tissues after cardio-pulmonary resuscitation (CPR) in rats.Methods We used the alternating current of the esophagus stimulation to induce the ventricular fibrillation and establish the cardiac arrest/cardiopulmonary resuscitation (CA/CPR) model. Forty-eight rats, once spontaneous circulation restoring (ROSC), were divided into two groups: PD98059 (PD) group (treated with 0.3 mg/kg, intravenous intravenously,n=24) and model group (injected with same amount of normal saline,n=24). The control group (SH) was treated without CA/CPR (n=6). In each group, we executed 6 rats to obtain the brain tissues at 12, 24, 48 and 72 h after ROSC. The SOD1, SOD2 fluorescence density and positive cells of Caspase-3 in the cerebral tissues were detected by immunofluorescence labeling method, and the apoptosis by TUNEL labeling method. Results After CPR, the SOD1 fluorescence density of the PD group was all higher than that of model group at each time points (allP<0.05). The SOD2 fluorescence density of the PD group was significantly increased at 12, 24 and 48 h (allP<0.05). At 72 h after ROSC, Caspase-3 positive expression rate and the apoptosis rate of the PD group and model group was significantly higher than that of the control group, and the Caspase-3 positive expression rate and apoptosis rate of the PD group was lower than that of the model group (allP<0.05). Conclusion PD98059 can improve the SOD expression and inhibit apoptosis of brain tissues of rats after CA/CPR.

cardiac arrest; cardio-pulmonary resuscitation; extracellular regulated protein kinases channel blocker; apoptosis; superoxide dismutase; Caspase-3

國家自然科學基金資助項目(81160231)。

舒泉(1989-)，男，碩士研究生，主要研究方向為心血管基礎。E-mail： 497462239@qq.com

簡介：謝露(1959-)，女，博士，博士生導師，主要研究方向為心血管基礎。E-mail： xielu8282@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.005

R541

A

1002-266X(2016)38-0016-03

2016-04-23)