陳宏偉，李宗鋒，張紅娟，裴柳，劉洪偉，金亮，王東，李軍良

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000)

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原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中NLK蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

陳宏偉，李宗鋒，張紅娟，裴柳，劉洪偉，金亮，王東，李軍良

(秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000)

目的 觀察原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織中nemo樣激酶(NLK)蛋白的表達(dá)，并探討其與患者臨床病理特征的關(guān)系。方法 以自身配對法分別留取HCC患者腫瘤切除后肝癌及癌旁肝組織各136例，采用免疫組化法檢測NLK蛋白，分析NLK蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 在HCC及癌旁肝組織NLK蛋白陽性表達(dá)率分別為96.32%、5.15%，兩者比較P<0.01；HCC組織中NLK蛋白表達(dá)與腫瘤Edmondson-Steiner分級(P=0.002)、腫瘤直徑(P=0.022)、結(jié)節(jié)數(shù)目(P<0.001)有關(guān)，但與患者其他臨床病理參數(shù)不相關(guān)(P均﹥0.05)。結(jié)論 在HCC組織中NLK蛋白表達(dá)明顯升高，NLK可能在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族；nemo樣激酶

Nemo樣激酶(NLK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族成員，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶和絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶同源性成員之一[1]。盡管NLK蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織中的表達(dá)情況已有所研究[2]，但有關(guān)NLK蛋白與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系，尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究觀察了HCC及配對癌旁肝組織中NLK蛋白的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年4月～2010年8月秦皇島市第一醫(yī)院收治的136例HCC患者，術(shù)前均未行放化療，術(shù)中留取肝癌及癌旁肝組織，術(shù)后均經(jīng)病理科2位以上的資深醫(yī)師確診。其中，男108例，女28例；年齡31～76歲，中位年齡45.0歲；腫瘤直徑>5 cm 36例，腫瘤直徑≤5 cm 100例；多發(fā)腫瘤結(jié)節(jié)60例，單發(fā)腫瘤結(jié)節(jié)76例；Edmondson-SteinerⅠ級39例，Ⅱ級63例，Ⅲ、Ⅳ級34例；HBsAg陰性29例，HBsAg陽性107例；無肝硬化76例，合并肝硬化60例；116例無轉(zhuǎn)移，20例有轉(zhuǎn)移(包括門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。本研究由醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，并征得患者及家屬知情同意。

1.2 NLK蛋白檢測方法 將肝癌及癌旁肝組織標(biāo)本用石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。免疫組化染色采用SP法，試劑盒購于北京中杉金橋公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。NLK蛋白陽性定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒作為陽性反應(yīng)。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)>75%、>50%～75%、>25%～50%、≤25%分別計4、3、2、1分，染色程度強(qiáng)染色、中等強(qiáng)度染色、弱染色、無染色分別計4、3、2、1分。兩項得分相乘>4為陽性表達(dá)，≥9為高表達(dá)，≤8為低表達(dá)[3]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC癌組織及癌旁肝組織中NLK蛋白表達(dá)比較 NLK在HCC癌組織及癌旁肝組織陽性表達(dá)率分別為96.32%(131/136)、5.15%(7/136)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=226.167，P<0.01)。

2.2 NLK蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系 NLK蛋白表達(dá)與HCC患者Edmondson-Steiner分級(P=0.002)、腫瘤直徑(P=0.022)和腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目(P<0.001)有關(guān)，而與其他的臨床病理因素?zé)o關(guān)。見表1。

3 討論

NLK是一種進(jìn)化上保守的促分裂原活化蛋白激酶類似的激酶，也是經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路中的一個非常重要的調(diào)節(jié)因子[4]。最近研究表明，NLK表達(dá)失調(diào)在多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后評估方面都有重要作用，有望成為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。NLK在多條通路中起著不同的調(diào)控作用，在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著不同的角色。在一些人類腫瘤中，NLK發(fā)揮抑癌基因作用。一項關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究[5]顯示，低級別的星形細(xì)胞瘤(Ⅱ級)中NLK表達(dá)明顯高于間變性星形細(xì)胞瘤(Ⅲ級)和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級)，低表達(dá)NLK患者預(yù)后較差；Cox多因素分析顯示，NLK可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。同時發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG、U251、LN229和T98G過表達(dá)NLK后Caspase-3表達(dá)水平也升高，表明NLK通過活化Caspase-3而誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。Lv等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，NLK在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯降低，且與非小細(xì)胞肺癌的病理組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、Ki-67表達(dá)明顯相關(guān)；并且，證實(shí)NLK可通過抑制Wnt信號通路下游靶基因c-myc、Cyclin D1而參與非小細(xì)胞肺癌的調(diào)控。Huang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，NLK在乳腺癌組織中的表達(dá)低于正常乳腺組織，且與c-myb、Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞株中，NLK可能與c-myb直接結(jié)合并使其降解，引起其靶基因c-myc和Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，從而阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Han等[7]證實(shí)，NLK在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)癌旁組織，NLK低表達(dá)與結(jié)直腸患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈侵襲、肝轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)，且NLK低表達(dá)者預(yù)后較差。Yasuda等[8]研究證實(shí)，過表達(dá)NLK能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。Zhang等[1]研究表明，NLK表達(dá)在卵巢癌組織中低于正常卵巢組織，且隨著卵巢癌病理組織學(xué)分級增加，NLK表達(dá)也逐漸降低；而且，NLK表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的增殖呈負(fù)相關(guān)，能夠增加化療藥順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的凋亡。Emami等[9]研究表明，與正常的前列腺上皮和原發(fā)性前列腺癌相比，前列腺癌轉(zhuǎn)移灶中NLK的核定位表達(dá)程度明顯減弱；而且，過表達(dá)NLK能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，尤其對雄激素受體陽性的前列腺癌細(xì)胞作用更加明顯。

表1 NLK蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理 參數(shù)的關(guān)系

另一方面，NLK在一些腫瘤中發(fā)揮癌基因作用。Chen等[10]研究證實(shí)，NLK陽性的鼻咽癌患者無瘤生存率和總體生存率更低，而復(fù)發(fā)率更高。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞中，敲低內(nèi)源性NLK表達(dá)能夠明顯抑制CAL-27細(xì)胞的增殖及集落形成能力，阻滯細(xì)胞周期從G0/G1期到S期的轉(zhuǎn)變。Li等[12]研究表明，NLK在膽囊癌組織中的表達(dá)高于正常膽囊組織，且NLK過表達(dá)與膽囊癌的組織學(xué)分級、TNM分期、神經(jīng)周圍侵襲與否密切相關(guān)。而且，高表達(dá)NLK的膽囊癌患者預(yù)后更差。Tan等[13]也證實(shí)，在膽囊癌細(xì)胞中沉默NLK基因可以抑制其增殖、腫瘤形成和遷移能力。本研究表明，NLK蛋白在HCC癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁肝組織，且與HCC腫瘤直徑、Edmondson-Steiner分級以及腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)有關(guān)。可能與NLK高表達(dá)能上調(diào)Cyclin D1和CDK2轉(zhuǎn)錄水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)[2]。因此，NLK蛋白可能在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，有望成為HCC治療的新靶點(diǎn)。

[1] Zhang Y, Peng C, Wu G, et al. Expression of NLK and its potential effect in ovarian cancer chemotherapy[J]. Int J Gynecol Cancer, 2011,21 (8):1380-1387.

[2] Jung KH, Kim JK, Noh JH, et al. Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin D1 and CDK2 in human hepatocellular carcinoma[J]. J Cell Biochem, 2010,110 (3):687-696.

[3] Kaur R, Yuan X, Lu ML, et al. Increased PAK6 expression in prostate cancer and identification of PAK6 associated proteins[J]. Prostate, 2008,68 (14):1510-1516.

[4] Lv L, Wan C, Chen B, et al. Nemo-like kinase (NLK) inhibits the progression of NSCLC via negatively modulating WNT signaling pathway[J]. J Cell Biochem, 2014,115 (1): 81-92.

[5] Cui G, Li Z, Shao B, et al. Clinical and biological significance of nemo-like kinase expression in glioma[J]. J Clin Neurosci, 2011,18 (2):271-275.

[6] Huang Y, Jiang Y, Lu W, et al. Nemo-like kinase associated with proliferation and apoptosis by c-Myb degradation in breast cancer[J]. PLoS One, 2013,8 (7):e69148.

[7] Han Y, Kuang Y, Xue X, et al. NLK, a novel target of miR-199a-3p, functions as a tumor suppressor in colorectal cancer[J]. Biomed Pharmacother, 2014,68 (5):497-505.

[8] Yasuda J, Tsuchiya A, Yamada T, et al. Nemo-like kinase induces apoptosis in DLD-1 human colon cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,308 (2):227-233.

[9] Emami KH, Brown LG, Pitts TE, et al. Nemo-like kinase induces apoptosis and inhibits androgen receptor signaling in prostate cancer cells[J]. Prostate, 2009,69 (14):1481-1492.

[10] Chen S, Ma Z, Chen X, et al. Prognostic significance of nemo-like kinase in nasopharyngeal carcinoma[J]. Mol Med Rep, 2014,10 (1):131-136.

[11] Zhang B, Li KY, Chen HY, et al. Lentivirus-based RNA silencing of Nemo-like kinase (NLK) inhibits the CAL-27 human adenosquamos carcinoma cells proliferation and blocks G0/G1phase to S phase[J]. Int J Med Sci, 2013,10 (10):1301-1306.

[12] Li M, Zhang S, Wang Z, et al. Prognostic significance of nemo-like kinase (NLK) expression in patients with gallbladder cancer[J]. Tumour Biol, 2013,34(6):3995-4000.

[13] Tan Z, Li M, Wu W, et al. NLK is a key regulator of proliferation and migration in gallbladder carcinoma cells[J]. Mol Cell Biochem, 2012,369(1-2):27-33.

河北省秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(201502A158)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.032

R735.7

B

1002-266X(2016)38-0088-03

2016-05-10)