李麗娟 羅婉珊 張家彬 王慶 吳英松

·論著·

基于下一代測(cè)序平臺(tái)的結(jié)直腸癌KRAS基因檢測(cè)

李麗娟1羅婉珊1張家彬1王慶1吳英松2★

目的基于下一代測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)和分析結(jié)直腸癌KRAS基因的突變情況，以及評(píng)估其應(yīng)用于臨床分子診斷中的可行性。方法應(yīng)用Ion Proton半導(dǎo)體測(cè)序儀，檢測(cè)108例結(jié)直腸癌患者的石蠟包埋組織樣本的KRAS基因突變情況，并與作為金標(biāo)準(zhǔn)的一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果下一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果與一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果基本一致，符合率為94％，靈敏度高達(dá)100％。結(jié)論通過(guò)對(duì)108例臨床樣本的檢測(cè)分析后，該下一代測(cè)序檢測(cè)方法可用于檢測(cè)結(jié)直腸癌KRAS基因突變情況。

下一代測(cè)序；結(jié)直腸癌；KRAS

RAS家族之一的KRAS基因位于12p12.1，編碼分子量為21 kD、具有GTP酶活性的p21蛋白［1］。KRAS為EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路RAS?RAF?MAPK中的重要因子。機(jī)體正常的KRAS基因，通過(guò)控制相關(guān)路徑抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。突變型KRAS基因，在無(wú)需活化EGFR的條件下，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡發(fā)生異常。細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)的紊亂以及增殖的失控會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞癌變。KRAS基因主要在第12、13位密碼子上發(fā)生突變，以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎诘?1位密碼子上可見(jiàn)少數(shù)突變［2］。

KRAS是人體腫瘤中常見(jiàn)的致癌基因，其中20％～50％的結(jié)直腸癌患者伴有KRAS基因突變。其突變出現(xiàn)在結(jié)直腸癌的早期階段，不受治療的影響而維持穩(wěn)定狀態(tài)［3］。KRAS是第一個(gè)對(duì)臨床治療結(jié)直腸癌的決策產(chǎn)生影響的生物標(biāo)記物，是幫助了解相關(guān)基因和癌癥的發(fā)展預(yù)后、療效的關(guān)鍵指標(biāo)。當(dāng)KRAS基因?yàn)橥蛔冃蜁r(shí)，則不建議采用

EGFR靶向藥物。臨床研究表明，當(dāng)患者本身為KRAS基因野生型即不存在KRAS基因突變，服用EGFR有關(guān)靶向治療藥物，能獲得明顯的治療效果。例如非KRAS基因突變的結(jié)直腸癌患者，可受益于西妥昔和帕尼單抗等EGFR抗體藥物［4］。美國(guó)癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Can?cer Network，NCCN）提出腫瘤患者必須先檢測(cè)KRAS基因突變，再選擇EGFR靶向藥物。KRAS基因突變檢測(cè)已被NCCN列為《結(jié)腸癌臨床治療指南》與《直腸癌臨床治療指南》臨床用藥必檢項(xiàng)目。

目前，應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)KRAS基因突變的方法有多種。本研究應(yīng)用Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)［5］，對(duì)108例結(jié)直腸癌病理樣本進(jìn)行KRAS基因的突變檢測(cè)，并與一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。旨在探討下一代測(cè)序檢測(cè)方法在臨床檢測(cè)結(jié)直腸癌KRAS基因突變的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

隨機(jī)選取2015年1月至2015年12月寧波市第二醫(yī)院結(jié)直腸癌患者的石蠟包埋組織樣本108例，其中男性64例，女性44例，年齡在32～90歲，平均年齡64歲。本研究經(jīng)此醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

本研究主要使用的試劑見(jiàn)表1。

表1 試劑信息表Table 1 The information of reagents

表2 儀器信息表Table 2 The information of instruments

1.2.2 主要儀器

本研究主要使用的儀器見(jiàn)表2。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 DNA提取

采用環(huán)保脫蠟劑對(duì)石蠟包埋組織樣本進(jìn)行脫蠟處理，按照QIAamp DNA FFPE Tissue KIT（50）說(shuō)明書(shū)提取樣本的DNA，用Qubit?3.0熒光定量?jī)x定量。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建和定量

采用Ion AmpliSeq LibraryTMKit 2.0進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。關(guān)鍵步驟包括：目的片段的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，消除部分引物序列，加P1接頭和特異性接頭以及文庫(kù)的純化。

采用Qubit?3.0熒光定量?jī)x進(jìn)行文庫(kù)定量。根

據(jù)下列公式將文庫(kù)稀釋到200 pmol/L，稀釋后采用熒光定量PCR儀定量，等質(zhì)量混合后進(jìn)行模板制備。一次測(cè)序反應(yīng)，最多可以混合96個(gè)不同特異性接頭的樣本（包括陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品）。

1.3.3 模板制備與富集

按照Ion PITMHi?QTMOT2 Reagents200 kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，適量的上樣體積與ISP磁珠。關(guān)鍵步驟：通過(guò)反應(yīng)過(guò)濾器形成油包水型，PCR擴(kuò)增反應(yīng)，離心回收制備好的模板顆粒，Ion One TouchTMES的磁珠技術(shù)分離得到陽(yáng)性模板。

1.3.4 上機(jī)測(cè)序

采用Ion PITMHi?QTMSequencing 200 Kit，加入質(zhì)控模板，退火，Loading測(cè)序芯片，加測(cè)序酶。108例樣本分2張芯片進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3.5 結(jié)果分析

利用測(cè)序儀配套服務(wù)器和軟件進(jìn)行序列比對(duì)和分析。

運(yùn)行VariantCaller和Coverage Analysis插件，得到樣本的分析結(jié)果。點(diǎn)擊“篩選”，在“Allele Call”選項(xiàng)中，篩選保留“Homozygous”和“Heterozygous”；在“Allele Source”選項(xiàng)中，篩選保留“Hotspot”；在“Frequency”選項(xiàng)中，篩選保留“≥5”的數(shù)值；在“Cov?erage”選項(xiàng)中，篩選保留“≥2500”的數(shù)值。

1.4 一代測(cè)序?qū)φ諏?shí)驗(yàn)

將上述提取的108例DNA樣本同時(shí)應(yīng)用ABI 3500 DX基因分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測(cè)，運(yùn)行SeqScanner程序，導(dǎo)入測(cè)序結(jié)果。按Find快捷鍵，查找序列“AGTTGGAGCT”。此序列往后的第1～6個(gè)堿基，分別為KRAS第12、13密碼子。12號(hào)密碼子野生型為GGT，13號(hào)密碼子野生型為GGC；否則為KRAS外顯子2突變，詳細(xì)見(jiàn)表3。

表3 突變信息表Table 3 The information ofmutations

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，以Kappa≥0.75為一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)108例結(jié)直腸癌石蠟包埋組織樣本測(cè)序結(jié)果分析，下一代測(cè)序結(jié)果檢出65例為KRAS基因野生型并與一代測(cè)序結(jié)果完全一致，有43例為KRAS基因突變型，其中37例KRAS基因突變型與一代測(cè)序結(jié)果完全一致，具體信息見(jiàn)表4。

下一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果中有6例KRAS基因突變型與一代測(cè)序結(jié)果不一致，見(jiàn)表5和圖1。

樣本NBE059、NBE071下一代測(cè)序結(jié)果顯示6.7％、9.4％的突變頻率；對(duì)應(yīng)的一代測(cè)序峰圖突變堿基熒光信號(hào)弱（靈敏度＜20％），不足以判定其為陽(yáng)性。樣本NBE020、NBE074和NBE077下一代測(cè)序結(jié)果顯示5.3％、7.4％、5.0％的突變頻率；對(duì)應(yīng)的一代測(cè)序峰圖突變堿基峰與背景峰大體一致，判定其為野生型。樣本NBE069下一代測(cè)序結(jié)果有7.4％的Gly12Cys突變，對(duì)應(yīng)的一代測(cè)序峰圖是野生型。

2.2 2種檢測(cè)方法相關(guān)性分析

以金標(biāo)準(zhǔn)一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，驗(yàn)證下一代測(cè)序檢測(cè)方法的可行性。通過(guò)相應(yīng)公式計(jì)算得到本實(shí)驗(yàn)靈敏度為100％，特異性為91.5％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86％，陰性預(yù)測(cè)值為100％，總符合率為94％。以及采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)算Kappa為0.881。2種測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)具體見(jiàn)表6。

表4 下一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Table 4 The results of nextgeneration sequencing

3 討論

作為金標(biāo)準(zhǔn)的一代測(cè)序法采用Sanger測(cè)序原理，4種熒光染料標(biāo)記的ddNTP，經(jīng)過(guò)單引物PCR反應(yīng)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目的片段的所有堿基序列的檢測(cè)。以準(zhǔn)確、可靠、檢測(cè)范圍廣等為特點(diǎn)，同時(shí)具有耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，操作復(fù)雜、易污染、靈敏度低等局限性［6］。主要針對(duì)已知突變基因的位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，所以要明確知道該基因位點(diǎn)的具體信息，對(duì)于沒(méi)有明確的基因位點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)測(cè)序反應(yīng)。一代測(cè)序的目的在于尋找與疾病相關(guān)的特定基因突變，若沒(méi)有明確突變基因或篩查數(shù)量眾多的基因則難以完成［7］。本研究采用下一代測(cè)序技術(shù)，經(jīng)過(guò)Ion Proton半導(dǎo)體測(cè)序儀能夠檢測(cè)出目的片段的堿基序列。該系統(tǒng)采用天然核苷酸和聚合酶、無(wú)需激發(fā)光源、熒光標(biāo)記、焦磷酸酶化學(xué)級(jí)聯(lián)以及照相系統(tǒng)直接實(shí)時(shí)檢測(cè)測(cè)序時(shí)產(chǎn)生的氫離子濃度，有效提高堿基判讀準(zhǔn)確性［8］。測(cè)序反應(yīng)開(kāi)始5m in內(nèi)即開(kāi)始得到測(cè)序數(shù)據(jù)，單次運(yùn)行耗時(shí)2 h，測(cè)序芯片反應(yīng)微孔大于1.6億，產(chǎn)出數(shù)據(jù)量可達(dá)10G。相比一代測(cè)序具有檢測(cè)快速，通量高，能同時(shí)檢測(cè)出多種不同的突變型別等優(yōu)勢(shì)［9］。

表5 下一代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果Table 5 The resultsof nextgeneration sequencing

表6 測(cè)序結(jié)果比較Table 6 The comparision of sequencing results

本研究對(duì)108例結(jié)直腸癌臨床樣本KRAS基因檢測(cè)結(jié)果顯示，一代測(cè)序結(jié)果有37例陽(yáng)性（突變率34.3％），下一代測(cè)序結(jié)果有43例陽(yáng)性（突變率39.8％），2種方法符合率為94％。與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)告相符合。37例一代測(cè)序陽(yáng)性樣本在下一代測(cè)序結(jié)果中顯示較高的突變頻率，此外下一代測(cè)序還

檢測(cè)出6例突變頻率比較低的樣本（突變頻率＞5％，結(jié)果可信）。對(duì)應(yīng)的6例一代測(cè)序峰圖由于突變堿基熒光信號(hào)弱（靈敏度＜20％）或者突變堿基峰與背景峰大體一致，判定其為野生型。一代測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性受測(cè)序儀器和設(shè)定條件的影響，背景峰的高低也會(huì)影響判定結(jié)果。腫瘤異質(zhì)性較明顯時(shí)，一代測(cè)序的峰圖易受干擾，不能準(zhǔn)確判斷突變類型，因此其靈敏度低［10］。下一代測(cè)序靈敏度高達(dá)100％，特異性為91.5％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值86％，陰性預(yù)測(cè)值100％以及Kappa值＞0.75，驗(yàn)證下一代測(cè)序結(jié)果與一代測(cè)序有很好的一致性。但2種檢測(cè)方法均未檢測(cè)到第61密碼子上的突變，可能是由于樣本量少、癌組織處理以及這些突變較少見(jiàn)。因此需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究加以驗(yàn)證。

目前下一代測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)科研中，鑒定腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變，發(fā)現(xiàn)新的突變基因和位點(diǎn)，并應(yīng)用于新的藥物靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的研發(fā)。在國(guó)外，下一代測(cè)序技術(shù)在臨床診斷領(lǐng)域得到一定的發(fā)展。根據(jù)相關(guān)腫瘤基因組的信息預(yù)測(cè)藥物的療效，制訂個(gè)體化診療方案，并為新藥的臨床試驗(yàn)篩選合適的患者［11］。本研究的下一代測(cè)序系統(tǒng)具有高通量特點(diǎn)，一張芯片可以同時(shí)檢測(cè)1～96例樣本；并能檢測(cè)出一代測(cè)序無(wú)法檢測(cè)的低頻率突變位點(diǎn)，更好的滿足結(jié)直腸癌臨床分子診斷上的需求［12］。

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Based on the next generation sequencing platform for detection colorectal KRAS gene

LILijuan1，LUOWanshan1,ZHANG Jiabin1,WANGQing1,WU Yingsong2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.School of Laboratory Medicine Biotechnology，Southern MedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Objective Based on next generation sequencing technology,to detect and analyze of KRAS genemutations in colorectal cancer,and to assess the feasibility of its application in clinicalmolecular diagnosis.Methods KRAS genemutation was detected in paraffin embedded tissue samples from 108 cases of colorectal cancer by Ion Proton sem iconductor sequencer.The resultswere compared w ith the results from Sanger sequencing which is the gold standard.Results The results of the next generation sequencing were consistent w ith the results of gold standard,w ith the accuracy rate of 94％and sensitivity up to 100％. Conclusion Through the detection and analysis of 108 cases of clinical samples,this next generation sequencingmethod isvalid fordetection of KRAS genemutation in colorectalcancer.

Nextgeneration sequencing;Colorectal cancer;KRAS

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用型專項(xiàng)資金（2015B020233009）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail:wg@smu.edu.cn