張艷霞 楊學習

·綜述·

p53基因突變檢測方法的演進和趨勢

張艷霞1楊學習2★

p53基因是腫瘤蛋白P53（tumor protein p53）的編碼基因，在維持基因組穩(wěn)定、調(diào)控細胞周期和凋亡及抑制腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要的作用。p53基因突變信息在腫瘤分子篩查診斷、預(yù)防、藥物療法選擇等方面具有重要的參考價值。本文分析了p53基因與P53蛋白突變檢測的重要性、突變檢測方法的發(fā)展概況，如傳統(tǒng)的DNA測序、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymor?phism，RFLP）、單鏈構(gòu)像多態(tài)性（single?stranded conformation polymorphism，SSCP）等8類實驗室常規(guī)基因突變檢測策略及酵母中分離的等位基因功能分析技術(shù)（separation of gene function analysis in yeast，F(xiàn)A?SAY），近年來新興的技術(shù)包括生物傳感器、芯片、高分辨率溶解曲線（high resolutionmelting，HRM），及下一代測序技術(shù)，以期較為全面地展示現(xiàn)今p53及P53突變檢測的整體情況，為p53或其他基因突變研究者選擇突變檢測方法提供參考。

p53基因；突變檢測；下一代測序

1993年，P53被《科學》（science）雜志選為“年度分子”，具有“基因組衛(wèi)士”的稱號。作為一重要的轉(zhuǎn)錄因子，P53蛋白具有發(fā)現(xiàn)并暫停帶有損傷DNA的細胞分裂、修復(fù)損傷DNA或激活損傷細胞的凋亡途徑、調(diào)控細胞的正常分裂和分化、防止腫瘤發(fā)生的功能。然而，研究表明其突變幾乎在所有腫瘤中是最高的，超過50％的惡性腫瘤存在p53突變［1］。p53基因（p53 gene）的高突變率，提示其

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，p53與P53的突變檢測具有重要的臨床和科研意義。本文通過文獻概述了p53基因與P53蛋白突變檢測的重要性，并指出它在早期的腫瘤易感性評估及預(yù)防、癌癥早期診斷、耐藥機制及治療方法的優(yōu)化、預(yù)后判斷等方面起重要作用，是腫瘤精準醫(yī)療中不可忽視的參考基因之一。其次，重點對p53突變檢測相關(guān)方法的發(fā)展歷史和趨勢進行闡述，并從傳統(tǒng)方法、生物傳感器等新興熱點技術(shù)及下一代測序3個角度簡要介紹，特別是下一代測序的發(fā)展及其在p53基因突變研究中的現(xiàn)狀，幫助相關(guān)研究者了解p53與P53突變檢測方法的整體情況，快速選擇合適的檢測方法。

1 p53基因及其突變檢測的重要性

p53基因，編碼P53蛋白，自發(fā)現(xiàn)以來一直是腫瘤分子生物學領(lǐng)域最為熱門的基因之一。起初，由于癌癥病人體內(nèi)p53基因經(jīng)常發(fā)生突變導致其蛋白功能改變，P53蛋白被視為癌蛋白。隨后十多年的研究，使科學家們認識到P53實際為抑癌蛋白［2］。人類p53基因位于染色體17p13。區(qū)，全長約20 Kb，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，因編碼一種分子質(zhì)量為53 KDa的蛋白質(zhì)而得名［3］。P53蛋白單體全長393個氨基酸殘基，至少包括3個功能：N端功能域、DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DBD）及C端功能域。不同物種之間，DNA結(jié)合域的氨基酸序列是進化的保守序列，其編碼區(qū)為5～8外顯子，能與特定的DNA序列結(jié)合，既是p53基因突變多發(fā)區(qū)域，也是P53蛋白腫瘤抑制功能的關(guān)鍵區(qū)域。因而大多數(shù)p53突變的研究均集中于5～9號外顯子。p53的DBD區(qū)每個氨基酸都可能發(fā)生點突變，但研究報道，R175、G245、R248、R249、R273、R282 6個位點的突變在癌癥中高頻率出現(xiàn)，且與癌癥的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)，被稱為“熱點突變”［4?5］。

p53基因突變的類型繁多，主要包括基因片段的缺失、插入缺陷，點突變引起的錯義突變，及雜合性缺失。由點突變引起的錯義突變比例占總體的80％［4］。不同的腫瘤中p53的突變頻率、位點和形式各具特色，其突變的種類、位置和性質(zhì)主要取決于組織來源和致癌物的性質(zhì)。目前科學界對于p53基因的研究主要關(guān)注其在癌癥發(fā)生和發(fā)展方向、癌癥之間的分子聯(lián)結(jié)及癌癥臨床治療中的預(yù)測價值。30多年來，分子生物學的發(fā)展提高了p53基因檢測的技術(shù)水平，特別是高通量測序技術(shù)的興起，使p53基因突變檢測再次受到行業(yè)的關(guān)注。p53的檢測特別是核酸層面上的分析，可以在早期的腫瘤易感性評估［6］及預(yù)防［7］、癌癥早期診斷［8］、耐藥機制及治療方法的優(yōu)化［9?10］、預(yù)后判斷［11?14］等方面發(fā)揮出更加顯著的作用，也是腫瘤精準醫(yī)療中不可忽視的參考基因之一。

2 p53基因突變檢測方法發(fā)展概況

用于p53突變檢測的方法日新月異，本文按技術(shù)原理及時間先后綜合分類，從傳統(tǒng)方法，近年來新興的技術(shù)包括生物傳感器、芯片、高分辨率溶解曲線（high resolutionmelting，HRM），及高通量測序共3大角度進行闡述。

2.1 傳統(tǒng)的檢測方法

傳統(tǒng)的檢測方法按原理不同歸類，有DNA測序、基于酶的限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）連鎖分析技術(shù)及其相關(guān)改良技術(shù)、單鏈構(gòu)像多態(tài)性（single?stranded conformation polymorphism，SSCP）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatogra?phy，DHPLC）、變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradientgelelectrophoresis，DGGE）、變性梯度毛細管電泳法（degeneration gradient capillary electro?phoresis，CDGE）、連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reac?tion，LCR）、免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）等8類實驗室常規(guī)基因突變檢測策略及酵母中分離的等位基因功能分析技術(shù)（separation of gene function analysis in yeast，F(xiàn)ASAY）［15］。

前期對幾大癌癥相關(guān)p53突變位點的文獻研究發(fā)現(xiàn)，不管是對p53突變位點或單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的篩查、微衛(wèi)星多態(tài)性位點及其分型分析、雜合性丟失等核酸分析，還是對突變P53蛋白的定性和定量研究，大都使用了上述方法［16?20］。DNA測序是p53突變檢測中最受信賴的檢測方法，能直接準確地檢出序列中的突變位點及類型；但不適合大規(guī)模臨床樣本的分子診斷。DHPLC、RFLP、SSCP、DGGE不能直接檢出序列中未知突變的準確位點和類型，但能檢出其發(fā)生的區(qū)域信息，縮減對大量樣本p53基因序列分析的工作量，在p53已知突變檢測及未知突變的鑒定研究中占主導地位。免疫組織化學法可直接、快速、廉價、靈敏地檢測出p53基因的失

活，但變性P53的特異性抗體難得，受個體評價標準、存儲條件和特殊抗體等的影響容易出現(xiàn)假陰性［20］，靈敏度不如基因測序。如Takam i等［21］在研究彌漫型膠質(zhì)瘤中p53基因突變和免疫組化的關(guān)系時指出P53免疫組化是中度敏感和高度特異的p53基因突變的提示性標記。各傳統(tǒng)方法在p53和P53蛋白突變檢測中的典例、突變類別、優(yōu)缺點如表1。

表1 傳統(tǒng)p53突變檢測方法簡介表Table 1 Overview of traditional p53 mutation detectionmethods

2.2 生物傳感器、生物芯片、高分辨率溶解曲線技術(shù)

生物傳感器、生物芯片、高分辨率溶解曲線技術(shù)都是近年來的熱點技術(shù)。生物傳感器便宜、一次性、微型化、便攜化，適用于大量臨床樣本p53突變檢測［18，29］?；蛐酒萐outhern Blot等傳統(tǒng)探針技術(shù)簡單、通量高、集成化、應(yīng)用性強，相比直接測序，突變點的檢測數(shù)目更多、速度更快、準確性更高。如A ffymetrix公司的p53基因芯片，適用于腫瘤的早期診斷和易感性判斷。高分辨率溶解曲線分析技術(shù)是在實時熒光PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，閉管操作，低污染，準確率高、通量高、經(jīng)濟、簡單方便，且不受DNA突變位置或類型影響，后期數(shù)據(jù)分析處理方法簡單易懂，適用于基因分型、短片段重復(fù)序列分析、序列匹配、突變掃描、RNA編輯及甲基化掃描等研究［30-31］。然而，基因芯片靈敏度低、探針不穩(wěn)定、儀器成本高，HRM的靈敏度、精確度及系統(tǒng)的穩(wěn)定性也有待提高。

2.3 下一代測序的發(fā)展及其在p53基因突變研究中的概況

下一代測序（next?generation sequencing，NGS）又稱高通量測序（high?throughputsequencing）或大規(guī)模平行測序（massively parallel signature sequenc?ing，MPSS），是比基因芯片更高通量、更低成本的研究方法。自2005年Roche公司推出的第一臺高通量測序儀來，市場上主要有3大成熟的高通量平臺即Roche公司的GSFLX測序系統(tǒng)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀和ABI公司的SOLiD測序儀。早期，3類平臺存在通量太大、實驗周期長、成本高的問題，常應(yīng)用于重大項目的大規(guī)模測序或基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，不適應(yīng)醫(yī)療領(lǐng)域的臨床診斷、分子診斷。為滿足中小實驗室研究及醫(yī)院檢測的需求，3大公司相繼推出了低成本、低通量的測序平臺，如Life Tech的Ion Torrent（Personal Genome Machine、Proton）、Illum ina的M iseq及Roche的GS Junior［32］。Ion Torrent平臺將半導體芯片技術(shù)

與化學反應(yīng)獨特地結(jié)合起來，利用檢測DNA合成時釋放的氫離子造成電位差（pH改變）的原理進行測序，能直接將序列信息轉(zhuǎn)變成電信號，避免了原3大高通量平臺所需的復(fù)雜精密的光學拍照系統(tǒng)，還有多種測序長度及芯片的通量大小可供選擇。具有快速、準確、靈活、成本低、操作簡單等優(yōu)勢。M iseq是Illum ina的個人型測序系統(tǒng)，在單個儀器上整合了擴增、測序及數(shù)據(jù)分析的功能，并配備專門的樣本制備試劑盒，大大縮減了人工操作和儀器運行的時間；還具有強大的數(shù)據(jù)處理功能，可使用其內(nèi)置軟件進行拼接、比對等基本分析，也能借助在線BaseSpace系統(tǒng)，利用其中專業(yè)的大型數(shù)據(jù)分析軟件，很大程度地解決了中小型客戶在數(shù)據(jù)分析和存儲等方面的困難。GS Junior也是精巧型測序儀，具有長讀長的獨特優(yōu)勢，適應(yīng)醫(yī)院及中小實驗室對特定基因進行長片端測序。此外，更多的中等通量的測序平臺正被研發(fā)出來。

下一代測序能檢出腫瘤基因組內(nèi)基因的點突變、堿基替換、拷貝數(shù)改變和插入與缺失等，研究者們紛紛將其用于腫瘤全基因組、轉(zhuǎn)錄組、全外顯子組等研究。但前期對國內(nèi)外p53突變位點與癌癥相關(guān)性的文獻研究過程中發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)單獨使用下一代測序檢測p53的案例相對稀少，但個別案例使用全外顯子捕獲測序法篩查了肝癌［33］和肺癌［34］突變位點，并以Sanger法或質(zhì)譜法進行檢驗，指出下一代測序技術(shù)在體細胞突變位點鑒定或篩查中具有可行性。不同的是國外已經(jīng)有大量p53突變相關(guān)研究使用了通量測序，并與一代測序、FASAY、核酸質(zhì)譜［35］及免疫組化等傳統(tǒng)技術(shù)做了對比實驗。由于腫瘤細胞異質(zhì)性等原因，不同的案例對于下一代測序在p53突變檢測中的效果說法不一。

總體而言，基于個體的異質(zhì)性，單獨檢測p53基因突變的參考價值是有限的，在腫瘤或其他疾病與基因的相關(guān)性研究中，多數(shù)情況下同時檢測其他相關(guān)的參考基因和位點所得的綜合信息更有意義。雖然下一代測序的特異性和靈敏度還有待提高，但其在突變比例高的已知樣本檢出率較高，較其它方法通量高、快速、經(jīng)濟，有望成為精準醫(yī)療時代中檢測p53等基因突變的得力手段。

3 總結(jié)和展望

p53突變類別多、位點多，已有的檢測方法各有優(yōu)缺，至今尚未出現(xiàn)一種能獨立取代所有p53突變研究的方法。p53突變檢測方法朝高靈敏度、高精確度、實時、快速、經(jīng)濟、自動化、突變類型集成化的趨勢發(fā)展。因此，實際中應(yīng)結(jié)合具體研究目的、p53的突變類型和客觀條件，合理、綜合其中一種或多種方法以快速準確地檢出p53突變。下一代測序具有高效、所需DNA量少、可同步分析多個基因、多種突變類別的獨特優(yōu)勢，且隨著組織微切割、靶向捕獲和腫瘤細胞捕獲技術(shù)、等溫擴增PCR等精準技術(shù)的出現(xiàn)，其費用高、周期長、錯誤率高、讀長短等問題的逐步得到解決，已經(jīng)成為精準醫(yī)療時代中最引人矚目、最得力的分子診斷技術(shù)。

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Evolution and trendsof the detectionmethods for p53 genemutation

ZHANG Yanxia1，YANG Xuexi2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.Schoolof Labora?tory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

p53 gene is the tumor protein P53?coding?gene.Tumor protein P53 plays important roles in keeping genom ic stability,regulating and controlling cell cycle and cell apoptosis aswell as suppressing an?giogenesis of tumors.p53 genemutation information can provide great reference value formolecular screening or diagnosis,prognosis of tumors and optimal choices in drugs or treatments,etc.By analyzing or introducing p53 gene and protein P53 and the importance of theirmutation detection,development status of methods for their mutation detection,such as 8 categories of traditional and conventional laboratory methods including DNA sequencing,restriction fragment length polymorphism(RFLP）,single?stranded conformation polymor?phism(SSCP）and separation of gene function analysis in yeast(FASAY），and emerging technologies includ?ing bio?sensor chip,high resolution melting(HRM)and the next generation sequencing technology.This re?view may help readers quickly learn the overall situation ofmutation detection of p53 and P53 and provide in?vestigatorsw ith useful reference on the p53 and other genemutation detectionmethods.

p53 gene；Mutation detection；Nextgeneration sequencing

南方醫(yī)科大學課外科研學術(shù)活動（2009kw109）

1.廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術(shù)學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊學習，E?mail：yxxzb@sohu.com