鄒俊 楊琳艷 羅俊明 梁志坤 楊旭 張麗紅★

·論著·

廣東地區(qū)200例正常人耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫的建立

鄒俊1楊琳艷2羅俊明2梁志坤2楊旭3張麗紅1★

目的通過對200例廣東地區(qū)正常人進行耳聾基因突變篩查，獲得耳聾相關(guān)基因突變檢測的數(shù)據(jù)庫，初步篩出良性等位基因突變位點，以在對廣東地區(qū)人群進行耳聾基因突變檢測或篩查時，降低數(shù)據(jù)分析的時間和增加對結(jié)果的風(fēng)險預(yù)測能力。方法提取在廣東地區(qū)收集到的200例正常男女樣本（男女比例為1∶1）的外周全血DNA，運用Ampliseq擴增技術(shù)以及Life Technologies耳聾基因檢測引物池構(gòu)建基因文庫后進行下一代測序，確保每一個樣本的測序結(jié)果獲得足夠的數(shù)據(jù)量，然后分析耳聾基因突變位點。結(jié)果建立了使用Life Technologies耳聾基因檢測引物池構(gòu)建基因文庫的實驗體系；經(jīng)過數(shù)據(jù)比對，篩選出200例樣本中突變率高達80％～100％的良性等位基因突變點。結(jié)論通過對測序結(jié)果的分析處理，篩除了針對廣東地區(qū)人群突變率高但是不致病的良性耳聾基因突變位點，為今后廣東地區(qū)人群的耳聾基因突變篩查提供參考。

耳聾；下一代測序；良性等位基因

耳聾是一種臨床上最常見的、嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量的疾病，還會給社會帶來巨大的壓力。其發(fā)病原因多種多樣，環(huán)境影響、單基因突變、多基因復(fù)合突變以及環(huán)境和遺傳因素共同作用等都可能引起耳聾。在所有的耳聾患者中，約有一半屬于遺傳性耳聾。遺傳性耳聾可分為綜合征型耳聾（syndrom ic hearing loss，SHL）和非綜合征型耳聾（nonsyndrom ic hearing loss，NSHL）。目前為止，已有報道的耳聾有數(shù)百種，絕大多數(shù)的遺傳性耳聾屬于NSHL，只有約30％的遺傳性耳聾病例屬于SHL［1］。NSHL的遺傳模式涉及常染色體隱性、染色體顯性、X連鎖及線粒體遺傳等，其中線粒體遺傳約占1％［2］。其中常染色體隱性遺傳，約占77％；常染色體顯性遺傳，約占22％［3］。據(jù)遺傳學(xué)家估計，與耳聾相關(guān)的基因約有200多個，隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展以及人們對遺傳性耳聾的研究不斷深入［4］，目前近百個耳聾相關(guān)基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中50多個非綜合征型遺傳性耳聾的基因被明確定位克隆。要減少遺傳性耳聾的發(fā)生，早期的預(yù)防與干預(yù)很重要，而對遺傳性耳聾進行預(yù)防與干預(yù)，重在對相關(guān)基因突變的檢測和篩查［5］。

Ion Torrent是基于半導(dǎo)體芯片發(fā)展起來的新一代革命性測序技術(shù)［6］，芯片的可測樣本量在提高的同時，相對應(yīng)而產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量亦是極為龐大的，在分析耳聾相關(guān)基因的測序結(jié)果時，實驗數(shù)據(jù)量的簡化顯得越來越重要。通過篩選后，如果建立起針對某一地區(qū)的耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫，能快速排除掉人群中普遍存在的相關(guān)基因的良性突變位點或者多態(tài)位點，就可以為進一步的分析并確定致病性等位基因突變帶來很大的方便。本研究對來自廣東地區(qū)的200例正常人全血DNA樣本進行耳聾基因突變檢測，得到測序結(jié)果后，對數(shù)據(jù)進行分析整理后將高突變率的良性等位基因突變位點初步篩除，為今后廣東地區(qū)人群的耳聾基因篩查提供參考，減少樣本DNA測序及數(shù)據(jù)分析的工作量。

Ion Torrent半導(dǎo)體測序技術(shù)相關(guān)的技術(shù)平臺包含文庫構(gòu)建、乳液PCR和測序?；驹硎窃诙嘀豍CR捕獲得到的DNA片段兩端加上通用的測序接頭，構(gòu)建好可以用于測序的測序文庫。利用乳液PCR技術(shù)對測序文庫進行擴增，形成測序模板，通過對陽性模板進行富集以達到測序要求。利用半導(dǎo)體測序系統(tǒng)對構(gòu)建好的測序模板進行測序，最終獲得每個DNA片段的堿基序列。通過生物信息學(xué)分析把這些序列定位到人類基因組參考圖譜上，分析樣本DNA序列覆蓋到耳聾相關(guān)基因的位置區(qū)域，統(tǒng)計確定位置的堿基序列信息，是否發(fā)生突變，發(fā)生突變的頻率為多少，即可判斷疾病類型，并且判斷為雜合突變或是純合突變，進而實現(xiàn)對耳聾相關(guān)基因型別的確定［7］。與第一代Sanger測序技術(shù)相比，該技術(shù)在很短的時間內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)對上百億個堿基對進行測序的愿望，一次就可以測定幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列，這滿足了極短時間內(nèi)對基因組進行高分辨率檢測的要求［8］。

1 材料和方法

1.1 研究對象和樣本

收集來自廣東地區(qū)正常男女外周全血樣本200例，其中，男性樣本100例（來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院），女性樣本100例（其中11例來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，89例來自廣東地區(qū)其他醫(yī)院），男女比例為1∶1。耳聾患者外周全血樣本50例（來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院）。使用QIAamp DNeasy Blood＆amp;Tissue Kit全血DNA提取試劑盒（具體操作按試劑盒說明書）對每個樣本取200μL進行基因組提取，后用Qubit?3.0熒光計和Nano?100微量分光光度計檢測所提取到的DNA濃度和純度。滿足濃度20～50 ng/μL，純度OD260/280=1.7～2.0。實驗檢測前DNA樣本在-80℃儲存。

1.2 文庫的制備

使用200例樣本中提取的全血基因組DNA進行基因組文庫構(gòu)建，每個樣本取30 ng全血基因組進行實驗，使用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0和耳聾基因突變檢測引物池HearingLoss100v1（IAD2530702）（下稱panel，panel所覆蓋的基因如表1所示）（Life Technologies，美國）制備基因組文庫，利用AMPure XPbeads對文庫進行片段選擇和純化：0.5倍AMPure XP beads去除文庫中的大片段DNA；1.2倍磁珠可以捕獲理論大小的DNA文庫片段。

基因組文庫構(gòu)建完成后，用Qubit?3.0檢測文庫濃度，Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent Technologies，美國）和安捷倫2100生物分析儀測定文庫片段大小。

表1 耳聾panel覆蓋的基因Table 1 Genes in deafness panel

1.3 模板制備和測序

將每個樣本的基因組文庫稀釋至100 pmol/L，將稀釋后的文庫每40個等量混合后，用Ion PI?Ion Sphere?Particles（ISPs）通過One Touch?2.0儀器進行乳液PCR，儀器運行結(jié)束后，再用Ion One?Touch?ES富集ISPs珠子。將富集后的ISPs珠子轉(zhuǎn)到Ion PI?Chip v3測序芯片上，使用Ion PITMHi?Q?Sequencing 200 Kit（Life Technologies，美國）試劑在Ion Proton測序儀上進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

測序完成后，待儀器內(nèi)部緩存轉(zhuǎn)載至服務(wù)器上后，則可通過電腦連接服務(wù)器選擇相應(yīng)插件進行數(shù)據(jù)處理和分析，則通過此步處理后可將測序得到的樣本的基因組序列定位到人類基因組參考圖譜上，分析樣本DNA序列覆蓋到耳聾相關(guān)基因的位置區(qū)域，統(tǒng)計確定位置的堿基序列信息，判斷是否發(fā)生突變。

2 結(jié)果

2.1 耳聾突變基因檢測文庫的構(gòu)建體系

在試劑盒Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0提供的使用說明書的基礎(chǔ)上，我們對文庫構(gòu)建的體系進行了優(yōu)化，每個樣本文庫構(gòu)建起始DNA量分別為19 ng、20 ng、21 ng，最后確定每個樣本文庫構(gòu)建的起始DNA量至少為20 ng（低于20 ng時構(gòu)建的文庫濃度低于0.2 ng/μL，而文庫濃度若低于0.2 ng/μL，將得不到測序結(jié)果）。因耳聾基因突變檢測panel有2個引物池，且每個樣本用2個引物池分別建庫，即每個耳聾基因突變檢測引物池進行目的片段擴增（PCR）時，加入的樣本DNA量至少為10 ng。所得文庫終濃度均可達到0.5 ng/μL以上。優(yōu)化體系及結(jié)果如表2、表3所示。

表2 DNA起始量的優(yōu)化Table 2 Optimization of initialdosage of DNA

2.2 檢測結(jié)果

使用耳聾基因突變檢測panel構(gòu)建基因文庫后經(jīng)測序所得數(shù)據(jù)顯示，該panel所覆蓋的63個耳聾相關(guān)基因（見表1）全部檢出，覆蓋度達100％。

200例正常樣本中，對耳聾相關(guān)基因進行突變檢測，其中50％以上的基因位點共35個，而本研究中80％～100％的樣本都存在突變位點共有25個（見表4）。

表3 文庫濃度對比Table 3 Comparison of library concentration

表4 突變頻率在80％～100％范圍內(nèi)的基因位點的突變信息Table 4 Mutation information of gene sitewhichmutation frequency in the range of 80％～100％

2.3 數(shù)據(jù)庫建立有效性驗證結(jié)果

為了驗證我們建立起來的耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫的有效性，對50例耳聾患者進行耳聾基因突變檢測，按照試劑盒Ion AmpliSeqTMLibrary Kit2.0的說明書構(gòu)建基因組文庫，并且進行模板制備和上機測序，分析上機數(shù)據(jù)，選取其中1例耳聾患者樣本在良性突變位點篩除前數(shù)據(jù)分析的結(jié)果與良性突變位點篩除后分析數(shù)據(jù)的結(jié)果進行對比如表5、表6。經(jīng)過對比可以看出建立數(shù)據(jù)庫后，處理數(shù)據(jù)時可以直接將良性的突變位點篩除掉，而只顯示我們需要的致病的突變位點信息，從而驗證了耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫的有效性，這樣也大大減少了工作量，并且節(jié)省了數(shù)據(jù)分析的時間。

3 討論

與耳聾相關(guān)的基因較多，而且遺傳異質(zhì)性較強，但大多數(shù)耳聾是由少數(shù)幾個基因突變導(dǎo)致的［11］，這為臨床開展耳聾基因診斷及產(chǎn)前診斷提供了檢測目標(biāo)基因。目前結(jié)合產(chǎn)前診斷，耳聾基因突變檢測的目標(biāo)人群主要有：聾人人群、新生兒以及部分聽力正常的人群。新生兒聽力篩查中有相當(dāng)一部分?jǐn)y帶GJB2、SLC26A4基因突變或線粒體DNA突變的兒童表現(xiàn)為聽力正常，但隨著年齡增長，聽力逐漸下降，表現(xiàn)為遲發(fā)性耳聾的癥狀［12］。因此，對他們進行基因突變檢測，能夠有效做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早干預(yù)，對提高兒童聽力健康水平具有重要的意義［13］。

表5 耳聾患者檢測結(jié)果（前）Table 5 Detection resultsof deafness patient（before）

表6 耳聾患者檢測結(jié)果（后）Table 6 Detection resultsof deafness patient（after）

隨著基因診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，具有低成本、高通量、高自動化程度等特征的第下一代測序技術(shù)應(yīng)運而生，該技術(shù)在很短的時間內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)對上百億個堿基對進行測序的愿望，一次就可以測定幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列，這滿足了極短時間內(nèi)對基因組進行高分辨率檢測的要求［12?14］。針對耳聾相關(guān)基因的篩查和檢測，目前使用最多的方法是基因測序技術(shù)，特別是近年來發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于耳聾基因突變的篩查診斷中。在進行高通量的基因測序過程中，對結(jié)果中產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)進行高效、準(zhǔn)確的處理成為一個不容忽視的問題，但由于基因突變具有普遍性、隨機性、不定向性等特點［14］，在測序過程中不可避免會有大量的非目標(biāo)突變位點被檢測出來，如果能在繁雜的檢測結(jié)果中快速的分辨出致病的和新發(fā)的基因突變位點信息，則會

為數(shù)據(jù)分析帶來極大的方便。因此，高效的篩除良性突變位點或人群中多態(tài)位點的信息是很有必要的。

就耳聾基因突變檢測和篩查的現(xiàn)狀來看，一方面，根據(jù)報道目前還沒有成型的耳聾相關(guān)基因突變的數(shù)據(jù)庫，而且通過高通量測序法對正常人群或者聽力缺陷人群進行基因檢測，結(jié)果會發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分耳聾相關(guān)的基因突變位點是人群普遍攜帶的多態(tài)位點，如果不將其過濾掉，每次分析數(shù)據(jù)都需要重復(fù)篩除工作，造成不必要的工作負(fù)擔(dān)。另一方面，在耳聾基因的檢測方面，目前的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)實驗室的工作重點是針對少量常見的耳聾基因突變位點進行檢測，在處理檢測結(jié)果時，不可避免要將一個大的數(shù)據(jù)背景排除，其工作量是很大的。同時由于外在環(huán)境以及人類個體之間的差異等原因，一些并非常見但又致病的基因突變位點確實是存在的，而且新發(fā)的突變位點在不斷地出現(xiàn)，因此針對一些不明原因的致聾，我們在篩查常見致病位點的同時，很有必要進行新發(fā)位點的查找和驗證。而這一工作要開展起來，首先也需要將人群中常見的、耳聾基因相關(guān)的非致病的多態(tài)位點篩除，以降低數(shù)據(jù)處理的難度。否則每次在處理數(shù)據(jù)時就如大海撈針一樣，需要在排除眾多的多態(tài)位點后再一一查找、驗證新發(fā)致病位點。因此，我們建立起來的針對廣東地區(qū)的200例正常人耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，可以有效地將驗證為良性的25個多態(tài)位點篩除，這樣就解決了前人在進行耳聾基因突變檢測是面對的大的數(shù)據(jù)背景難以排除的難題。并且對數(shù)據(jù)庫的有效性進行了驗證，選取50例耳聾樣本進行構(gòu)建基因組文庫、模板制備和上機測序，與未使用數(shù)據(jù)庫分析的正常樣本的檢測結(jié)果進行對比，結(jié)果顯示我們建立起來的耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫在后續(xù)耳聾基因突變位點篩查時可以直接有效地屏蔽掉相應(yīng)的良性多態(tài)位點，這樣大大減少了要處理的數(shù)據(jù)量，降低了數(shù)據(jù)分析的時間、增加了對結(jié)果的風(fēng)險預(yù)測能力，為今后廣東地區(qū)人群的耳聾基因突變篩查提供參考。

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Establishment of a gene mutation database in deafness from 200 health individuals in Guangdong area

ZOU Jun1,YANG Linyan2,LUO Junming2,LIANG Zhikun2,YANG Xu3,ZHANG Lihong1★
(1.Pediatric Surgery of JiangxiProvincial Children's Hospital,Nanchang,JiangxiChina,330006;2.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;3.School of Basic Medical Science, Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Objective To get deafness related genemutation detection database and prelim inarily remove the positive allele mutations,200 cases of normal people in the Guangdong area were screened,in order to reduce the time of data analysis and increase the ability to predict the risk when detecting themutation of deafness gene in the population of the Guangdong area.Methods Peripheral blood DNA was extracted from 200 normal samples collected in the Guangdong area(male to female ratio of 1:1).Gene library was constructed by using Ampliseq amplification technology and primer pool of deafness genetic testing(Life Technologies),and then next generation sequencing was done.Results The experimental system of gene library was established using Life Technologies primer pools of deafness gene detection.Through data comparison,mutation rate between 80％and 100％of 200 sampleswas selected.Conclusion By analysing the sequencing results,deafness genemutationswhich were benign and had highmutation rate of population in Guangdong but not pathogenic were removed.That greatly reduced the time of data analysis,increased the ability to predict the results of the risk,which would provide reference for deafness genemutation screening of Guangdong population in the future.

Deafness;Nextgeneration sequencing;Benign allele

廣州市科技計劃項目（201508020259）

1.江西省兒童醫(yī)院兒外科，江西，南昌330006 2.廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：張麗紅，E?mail：742702096@qq.com