吳龍 王穗海 梁志坤★

·綜述·

人類癌癥特異敏感標(biāo)志物：循環(huán)腫瘤DNA

吳龍1王穗海2梁志坤1★

循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的DNA，它可作為多種癌癥的生物學(xué)標(biāo)志物。ctDNA的檢測具有操作簡便快速、無創(chuàng)、特異性和高敏感性等特征，以下一代測序（next?generation sequencing，NGS）技術(shù)為基礎(chǔ)的ctDNA分析方法可通過突變狀態(tài)反映腫瘤基因組信息，在腫瘤的研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用發(fā)揮重要的作用，可決策一個(gè)全新的癌癥治療方案。ctDNA作為新興的“液體活檢”靶標(biāo)，其具有廣闊的應(yīng)用前景和推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施。本文概括了ctDNA在多種癌癥（乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌）中的高頻率突變基因、ctDNA的最新檢測技術(shù)和ctDNA在臨床診斷、療效監(jiān)控及預(yù)后判斷中的良好效果，以推動(dòng)NGS技術(shù)為基礎(chǔ)的ctDNA檢測方法在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

ctDNA；下一代測序；腫瘤；液體活檢

組織活檢作為癌癥診斷、分期和治療決策的主體，其角色已從簡單的組織學(xué)檢查演變?yōu)閺?fù)雜的遺傳分析。盡管它很有效用，但僅僅代表一個(gè)位置單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的狀態(tài)，往往不足以描述整個(gè)惡性腫瘤的情況及其演變過程，因?yàn)楦浇M織可能包含更多的遺傳信息會(huì)影響到分期和治療。而且侵入性和活檢固有的選擇偏好性也限制了其作為實(shí)時(shí)監(jiān)控工具的有用性。為了克服這一缺點(diǎn)，人們開始尋找各種腫瘤生物標(biāo)志物，如蛋白質(zhì)標(biāo)記物，循環(huán)腫瘤細(xì)胞和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tu?

mor DNA，ctDNA）等。近幾年，研究表明腫瘤患者ctDNA所攜帶的腫瘤突變信息與腫瘤組織具有良好的一致性［1?3］，因此腫瘤循環(huán)DNA引起了人們的極大關(guān)注。Newman等［4］發(fā)明的高敏感度ctDNA定量檢測技術(shù)：腫瘤個(gè)性化深度測序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP?Seq），使得ctDNA的檢測有了突出的進(jìn)步，從而使檢測血液樣品中低濃度ctDNA成為可能，進(jìn)而能夠跟蹤腫瘤的發(fā)展?fàn)顟B(tài)。本文就ctDNA在多種腫瘤診療中應(yīng)用的情況及在腫瘤的診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷等方面的潛在作用進(jìn)行介紹，以推動(dòng)下一代測序（nextgeneration sequencing，NGS）技術(shù)為基礎(chǔ)的ctDNA檢測方法在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

1 ctDNA的特性

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）指的是由腫瘤細(xì)胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)中的DNA。而細(xì)胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA），或者叫血漿游離DNA，是指血漿中游離存在的DNA，它們有的來自于正常細(xì)胞，有的來自于異常細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞），還有部分來自于人體外部（如病毒DNA）。正常cfDNA與ctDNA的區(qū)別在于是否存在突變。體細(xì)胞突變，只在癌細(xì)胞或癌前細(xì)胞的基因組中，通常是單堿基對(duì)取代，卻不會(huì)存在于同一個(gè)體的正常細(xì)胞的DNA中，這樣才能保證ctDNA作為特異性的生物標(biāo)記物。

2 腫瘤患者中的ctDNA

在20世紀(jì)40年代后期第一次在人體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)游離的DNA，隨后在20世紀(jì)70年代分離出了腫瘤特異性遺傳物質(zhì)。然而，ctDNA檢測的發(fā)展相當(dāng)緩慢，甚至落后于產(chǎn)前診斷。ctDNA面臨的挑戰(zhàn)包括充滿變異，且血液中的ctDNA濃度較低，特別是在早期腫瘤，這阻礙了它的快速發(fā)展和更好地融入臨床實(shí)踐。幸運(yùn)的是，靶向選擇和擴(kuò)增方法技術(shù)以及測序方法的進(jìn)步促進(jìn)了這些微量ctDNA的檢測。一種被稱為磁珠乳液擴(kuò)增（beads emulsion amplification and magnetics，BEAM ing）的方法［5］，它能夠靶向選擇以增強(qiáng)靶區(qū)域的捕獲效率，使捕獲的靈敏度高達(dá)0.01％［6］。這樣精準(zhǔn)的檢測能力使研究人員能夠探索ctDNA的臨床適用性，對(duì)癌癥進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

2.1 乳腺癌患者中ctDNA

轉(zhuǎn)移性乳腺癌需要對(duì)腫瘤的負(fù)荷進(jìn)行監(jiān)控，以確定對(duì)治療的反應(yīng)，并且選擇適宜的生物標(biāo)志物。Dawson等［3］通過對(duì)PIK3CA和TP53的點(diǎn)突變進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)30位女性中有29位（97％）的體細(xì)胞基因組發(fā)生突變，成功地檢測到ctDNA，其表達(dá)水平波動(dòng)較大，并且波動(dòng)與腫瘤負(fù)荷呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性。與此同時(shí)，ctDNA比癌抗原15?3（CA15?3）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測具有更高的靈敏度。Heidary對(duì)轉(zhuǎn)移乳腺癌相關(guān)基因（PCDH20，OR4X1，ALK，DNPEP，SH3TC2，DDR2，MLL3，PIK3CA）的檢測，同樣發(fā)現(xiàn)ctDNA水平表現(xiàn)出較大范圍的波動(dòng)［7］?，F(xiàn)在，40％乳腺癌患者存在PIK3CA（I類磷脂酰肌醇?3?激酶（PI3K）催化亞基）的體細(xì)胞突變，而PIK3CA則是調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必須。通過對(duì)COSM IC數(shù)據(jù)庫的檢索同樣可以發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者中的PIK3CA和TP53這2個(gè)基因是高頻率突變基因［8］。毫無疑問，在乳腺癌診斷中，ctDNA將有望成為替代癌抗原15?3（CA15?3）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞成為新的腫瘤生物標(biāo)志物，而對(duì)PIK3CA和TP53進(jìn)行檢測則可以很好反應(yīng)乳腺癌狀態(tài)。

2.2 肺癌患者中ctDNA

Maheswaran等［9］在肺癌細(xì)胞中檢測到EGFR和KRAS基因的突變，揭開了肺癌靶向治療的可能路徑。Yung等［10］使用數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）患者的血漿ctDNA中檢測到表皮生長因子受體（epidermal grow th factor receptor，EGFR）突變，其外顯子19缺失和L858R突變頻率分別為17％和26％，與腫瘤樣本的測序結(jié)果相比較，腫瘤樣本中EGFR突變的敏感性和特異性分別為92％和100％，同時(shí)，突變序列的數(shù)量和臨床應(yīng)答呈相關(guān)關(guān)系。Punnoose等［11］也觀察到在血漿中ctDNA中EGFR突變的狀態(tài)與相應(yīng)的腫瘤組織大小是一致的，這意味著可以使用ctDNA實(shí)時(shí)評(píng)估突變狀態(tài)。Wang等［12］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者血漿ctDNA中，KRAS突變和相應(yīng)腫瘤組織也呈相關(guān)關(guān)系，在血漿和腫瘤中KRAS突變的一致性為76.7％。美國大約10％非小細(xì)胞肺癌患者、東亞35％的非小細(xì)胞肺癌患者和EGFR有關(guān)［13?14］。非小細(xì)胞肺癌患者中，EGFR、KRAS和ALK幾乎是單獨(dú)起作用的，只要一個(gè)突變

代替另一個(gè)突變都會(huì)影響靶向治療反應(yīng)。因此，對(duì)ctDNA的突變量進(jìn)行監(jiān)測可以很好評(píng)估腫瘤狀態(tài)，反應(yīng)腫瘤是否發(fā)生及發(fā)生后的變化情況。

2.3 結(jié)直腸癌患者中ctDNA

長期對(duì)結(jié)直腸癌遺傳改變的觀察發(fā)現(xiàn)，在大腸癌患者血清或血漿中都可以檢測到癌基因KRAS、抑癌基因TP53和APC的基因突變［15］。大腸癌患者細(xì)胞游離循環(huán)DNA中第一個(gè)鑒別的遺傳改變是癌基因KRAS的突變。大多數(shù)出版的文章都致力于此標(biāo)記的研究，主要有以下幾個(gè)原因：有原癌基因KRAS突變在大腸癌發(fā)病率較高（約50％）［16-17］；結(jié)直腸癌發(fā)生的過程中，甚至是在腺瘤階段，原癌基因KRAS突變是最早的遺傳改變［18］；大約80％的大腸癌患者癌基因表現(xiàn)出KRAS突變的范圍很小，通常在密碼子12，偶爾在密碼子13，少數(shù)在第61位密碼子［19-20］。通過等位基因特異性引物定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，對(duì)KRAS第2外顯子7個(gè)點(diǎn)突變（G12V，G12A，G12D，G12S，G12C，G12R和G13D）和BRAF第15外顯子點(diǎn)突變（V600E）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在KRAS的7個(gè)第二外顯子突變和BRAF V600E突變的檢出率分別為92％和100％［21］。對(duì)COSM IC數(shù)據(jù)庫檢索可以發(fā)現(xiàn)，這7個(gè)最頻繁的KRAS突變占KRAS總突變的90％，BRAF V600E突變占所有BRAF突變的98％。ctDNA中KRAS基因發(fā)生突變位點(diǎn)的一致性，更有利于其作為腫瘤的生物標(biāo)志物。

3 ctDNA檢測技術(shù)

ctDNA在血液循環(huán)中濃度很低且以碎片化呈現(xiàn)，這是ctDNA檢測的主要挑戰(zhàn)。目前，檢測和分析ctDNA的方法很多，這在楊超等［22］的文章中有較為詳細(xì)的介紹。之前大多數(shù)方法的靈敏度都偏低，隨著ctDNA的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，最近出現(xiàn)幾種高靈敏度的檢測方法。標(biāo)記擴(kuò)增深度測序（tagged?amplicon deep sequencing，TAM?Seq）、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（digital PCR）、BEAM ing、焦磷酸活化的聚合反應(yīng)（pyrophosphorolysis?activated polymerization，PAP）和CAPP?Seq等的出現(xiàn)極大提高了檢測ctDNA的敏感性。使用數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)晚期胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等的ctDNA檢出率可達(dá)75％以上［23］。使用CAPP?Seq方法對(duì)非小細(xì)胞肺癌設(shè)計(jì)可檢測多類型外顯子改變，大于95％腫瘤中可以檢測到突變［4］。對(duì)于ctDNA在Ⅱ?Ⅳ期的NSCLC患者，敏感性達(dá)到100％，Ⅰ期NSCLC患者的敏感性達(dá)到50％，該方法檢測EGFR和KRAS中頻率高于0.1％的突變時(shí)，檢出率為100％，特異性為99％。由此可見，CAPP?Seq可用于局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的非侵入性腫瘤基因分型。ctDNA的水平與腫瘤體積顯著相關(guān)，Ⅱ、Ⅲ期患者在放射治療過程中腫瘤會(huì)出現(xiàn)炎癥或纖維化，導(dǎo)致影像學(xué)檢查無法正確判斷腫瘤是否存在，而對(duì)ctDNA的檢測結(jié)果可以判斷腫瘤的狀態(tài)。因此，ctDNA水平與臨床預(yù)后之間的相關(guān)性似乎優(yōu)于影像學(xué)檢查，并提供了快速的反應(yīng)評(píng)估。我們設(shè)想，對(duì)ctD?NA的檢測可以常規(guī)應(yīng)用于臨床檢測和監(jiān)測多樣惡性腫瘤，從而便于個(gè)體化的癌癥療法。

4 ctDNA的臨床應(yīng)用

隨著二代基因測序技術(shù)的發(fā)展，ctDNA檢測技術(shù)可以快速和高效地檢測到腫瘤中的基因突變，逐漸成為“液體活檢”的主要手段，其臨床運(yùn)用包括以下3個(gè)方面。

4.1 癌癥早期診斷與癌癥分期

近年來，在影像學(xué)檢查結(jié)果不明確的情況下，循環(huán)生物標(biāo)志物在評(píng)估疾病嚴(yán)重程度方面起到重要作用，如CA19?9、CA?125、甲胎蛋白（alphafeto?protein，AFP）和前列腺特異性抗原（prostatic spe?cific antigen，PSA）。然而很多的惡性腫瘤并不具有可靠的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，即使在有生物標(biāo)志物的疾病中，也有可能因?yàn)槿狈μ禺愋远鵁o法使用。此外，多數(shù)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在血液循環(huán)中持續(xù)時(shí)間較長，可達(dá)數(shù)周，要準(zhǔn)確評(píng)估則需要等到數(shù)周或數(shù)月后。而ctDNA的半衰期短（約2 h），可動(dòng)態(tài)評(píng)估癌癥情況。另外，ctDNA的檢測準(zhǔn)確性高，且ctDNA水平與腫瘤的大小之間相關(guān)程度高，根據(jù)ctDNA的突變量的進(jìn)行監(jiān)測可以很好評(píng)估腫瘤狀態(tài)，進(jìn)行早期診斷和腫瘤分期。

4.2 腫瘤的療效評(píng)估

ctDNA可作為安全可靠的療效評(píng)估指標(biāo)。腫瘤患者在臨床治療過程中通常會(huì)產(chǎn)生藥物抗性，使得原本有效的藥物失去治療作用，其主要原因可能是基因組成或蛋白調(diào)控通路發(fā)生改變。例如，原發(fā)性結(jié)直腸癌患者血漿中的NRAS和KRAS DNA片段原本不存在16號(hào)密碼子突變，使用EG?FR阻滯劑治療后，兩者突變頻率顯著升高，患者

可檢出率約46％［23］。研究發(fā)現(xiàn)，大約一半肺癌患者對(duì)厄洛替尼和吉非替尼不敏感，主要原因是血漿中EGFR的DNA中發(fā)生T790M突變［24］。在結(jié)直腸癌中對(duì)阻斷EGFR的單克隆抗體西妥昔單抗和帕尼單抗的二次抵抗則與KRAS突變或MET基因擴(kuò)增有關(guān)［25?26］。因此，檢測ctDNA進(jìn)行基因分析可動(dòng)態(tài)監(jiān)測藥物的靶向位點(diǎn)是否發(fā)生改變，篩選出最佳治療方案，快速有效地在臨床耐藥前采取替代藥物達(dá)到精準(zhǔn)施藥的效果，避免無效治療并減少藥物產(chǎn)生的副作用。

4.3 復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷

腫瘤切除后，沒有檢測到ctDNA與沒有腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)。此外，各種類型的晚期癌癥都能檢測到ctDNA的存在。2007年，BEAM ing擴(kuò)增法的開發(fā)者美國約翰霍普金斯大學(xué)Vogelstein和Kinzler對(duì)18名腸癌患者的ctDNA進(jìn)行了跟蹤。研究顯示，術(shù)后仍能檢測到ctDNA的患者，基本上都出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，而術(shù)后未檢測到ctDNA的患者，腸癌無復(fù)發(fā)［27］。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，ctDNA能展現(xiàn)患者對(duì)手術(shù)的應(yīng)答情況。研究者在其他癌癥中得到了類似結(jié)果，包括卵巢癌、乳腺癌以及來自其他器官的腫瘤，比如胰臟、膀胱、皮膚、胃、食道、肝臟和頭頸。

與循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)相比，ctDNA在腫瘤特異性突變的預(yù)后判斷方面顯示出明顯的優(yōu)越性［28］。在晚期非小細(xì)胞肺癌患者的研究結(jié)果表明，在基因突變檢測方面ctDNA顯示出較高的靈敏度，同時(shí)在與之相匹配腫瘤的突變狀態(tài)檢測方面，ctDNA也顯示出較高的一致性［29］。ctDNA適用于手術(shù)后的6～8周進(jìn)行檢測，以獲得最佳的決策方案［30］。因此，對(duì)血漿ctDNA進(jìn)行檢測可以作為癌癥患者的預(yù)后生物標(biāo)志物，用來分析患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

5 小結(jié)

與傳統(tǒng)的組織活檢或固相活檢相比較，液態(tài)活檢呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。而在液體活檢中，ctDNA、比其他的腫瘤標(biāo)記物具有準(zhǔn)確性高、半衰期短等優(yōu)勢。雖然ctDNA與其他標(biāo)志物相比優(yōu)勢明顯，但是ctDNA的研究仍處于前期階段，也具有一定的局限性。其一，ctDNA的樣本收集、處理等環(huán)節(jié)沒有標(biāo)準(zhǔn)化流程，各實(shí)驗(yàn)室之間存在差異；其二，使用ctDNA進(jìn)行腫瘤分期、臨床轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)預(yù)測時(shí)，暫時(shí)尚無標(biāo)準(zhǔn)的ctDNA標(biāo)志物及含量的閾值，或矯正曲線；其三，使用NGS進(jìn)行ctDNA檢測成本較高，進(jìn)一步改進(jìn)檢測方法以降低成本顯得尤為重要。

綜上所述，ctDNA檢測技術(shù)是一種操作簡便快速、無創(chuàng)、高敏感性和特異性的“液相活檢”技術(shù)，使用該技術(shù)對(duì)ctDNA進(jìn)行檢測能夠突破腫瘤異質(zhì)性的限制，可反映腫瘤基因組信息，且有利于掌握血液循環(huán)中的特異性突變，進(jìn)行腫瘤的診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷等。因而ctDNA將會(huì)越來越多的用于腫瘤的預(yù)防以及個(gè)體化治療的開展，從而推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施。

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ctDNA:a specific and sensitive biomarker for human cancers

WU Long1,WANG Suihai2,LIANG Zhikun1★
(1.Guangzhou darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Circulating tumor DNA(ctDNA)is a kind of circulating DNA fragments carrying tumor specific sequence alterations and are found in blood.It can be used as a variety of cancer biomarkers.ctDNA can be detected simply,rapidly,non?invasively,w ith high specificity and sensitivity.The analysis method based on next?generation sequencing(NGS)technologies detecting ctDNA can reflect tumor genom ic informa?tion bymutation status,and plays an important role in research and clinical application of cancer treatment,and treatment decision?making.As a new"liquid biopsy"target,ctDNA has broad application prospects and w ill fa?cilitate the implementation of precise care.This article outlines high frequencymutations in the gene of ctDNA in cancers(breast cancer,lung cancer and colorectal cancer),the latest detection technologies of ctDNA,the good effect of tumor diagnosis,prognosis and efficacy monitoring by detecting ctDNA.It can promote the ap?plication of NGS technologiesby detecting ctDNA in clinicalmedicine.

ctDNA;Next?generation sequencing;Tumor;Liquid biopsy

廣東省科技計(jì)劃應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)（2015B020233009）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：梁志坤，E?mail:zhikun_liang@126.com