龔建剛，邵麗瑋，馮志華，趙國先*，郝艷霜，張一為

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，河北保定071000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000；4.天津市飼草飼料工作站，天津河西300210）

一種枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元的制備

龔建剛1，邵麗瑋2，馮志華3，趙國先3*，郝艷霜3，張一為4

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，河北保定071000；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000；4.天津市飼草飼料工作站，天津河西300210）

為優(yōu)化枯草芽孢桿菌與刺五加多糖合生發(fā)酵的條件，本試驗采用4×2因子試驗設(shè)計，篩選適宜的溫度（30、34、37、40℃）和轉(zhuǎn)速（120 r/min和170 r/min）；采用單因素試驗設(shè)計篩選接種量（1%、2%、4%、6%、8%）、裝液量（50、100 mL）和初始pH值（5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5）；根據(jù)菌液的活菌數(shù)和芽胞產(chǎn)率確定刺五加多糖的添加量（0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.6、4.8、6.4、8、10 mg/mL）及合生元的培養(yǎng)時間（24、36、48 h）。結(jié)果表明，種子液的培養(yǎng)時間為24 h，溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，接種量為4%，250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，刺五加多糖的添加量為1.6 mg/mL，合生元培養(yǎng)時間為36 h，把培養(yǎng)好的菌液按1 L菌液∶0.5 kg麩皮的比例用干燥細麩皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元。經(jīng)檢測，其活菌數(shù)為5×109cfu/g左右。

枯草芽孢桿菌；刺五加多糖；合生元；制備

合生元又稱合生素或共生元，是“益生菌和益生元的混合制劑”（宋青龍，2007）?？莶菅挎邨U菌合生元是枯草芽孢桿菌和與其具有協(xié)同作用的益生元的組合。枯草芽孢桿菌與益生元相輔相成，共同發(fā)揮作用，為胃腸道建立了一個良好的微生態(tài)環(huán)境，促進有益菌生長增殖，抑制有害菌生長，提高機體免疫力，增強保健功能，發(fā)揮預(yù)防治療疾病的效果（潘寶海和孫東巖，2012；邊連全等，2012）?？莶菅挎邨U菌合生元既可發(fā)揮枯草芽孢桿菌的細菌生理活性，又可選擇性增加這種菌的數(shù)量使益生作用更持久，并且具有高效性與無殘留性等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)中。

本試驗旨在研究刺五加多糖-枯草芽孢桿菌體外合生發(fā)酵的條件進而制備微生物飼料添加劑，為合生元飼料添加劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗時間和地點合生元的制備，于2013—2014年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院進行制備。

1.2 材料與設(shè)備枯草芽孢桿菌（ACCC11025，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；刺五加多糖（陜西慈緣生物有限公司，純度50%）；LB培養(yǎng)基（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入1000 mL蒸餾水中加熱溶解，調(diào)pH到7.0±0.1，分裝，115℃高壓滅菌20 min，備用）。

新型恒溫振蕩器（ZHWY-2112B，上海智城分析儀器有限公司）；722型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司制造）；凈化工作臺（SWCJ系列，蘇州安泰有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司）；250 mL錐形瓶。

1.3 試驗方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌生長曲線及種子液培養(yǎng)時間的確定用接種環(huán)將保存在試管斜面上的枯草芽孢桿菌挑取1環(huán)接種到含有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在37℃、120 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h，每隔2 h或者1 h取樣1次，在600 nm分光光度計下測定其菌懸液的吸光度OD值，同時取無菌的LB培養(yǎng)液作對照，每組3個重復(fù)。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線，確定種子液的培養(yǎng)時間。

1.3.2 培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速的確定采用4×2因子試驗設(shè)計，將活化后的枯草芽孢桿菌種子液以容量比1%的接種量接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，置于不同溫度（30、34、37、40℃）和不同轉(zhuǎn)速（120 r/min、170 r/min）的恒溫振蕩器中培養(yǎng)。于2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24 h各取樣1次，測菌懸液的OD值，每組3個重復(fù)。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線，篩選適宜的溫度和轉(zhuǎn)速。

1.3.3 接種量、裝液量、初始pH值的確定采用單因素法篩選接種量、裝液量和初始pH值，具體方法如下：

在無菌操作臺中，分別按1%、2%、4%、6%和8%的接種量將活化后的枯草芽孢桿菌液接種于裝50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，每個接種量3個重復(fù)，置篩選好的溫度、轉(zhuǎn)速的恒溫搖床中培養(yǎng)24 h，600 nm下測菌液的OD值（用無菌培養(yǎng)基調(diào)零），根據(jù)OD值的大小，確定接種量。

在無菌操作臺中，按1%接菌量將活化后的種子液接種于250 mL錐形瓶，分別裝有50 mL和100 mL的LB培養(yǎng)基，兩種裝液量各3個重復(fù)，同上培養(yǎng)、測定，根據(jù)24 h的OD值大小，確定裝液量。

將培養(yǎng)基在滅菌前用1 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，各培養(yǎng)基按50 mL的裝液量分裝入3個250 mL的錐形瓶中，115℃滅菌20 min。在無菌操作臺中，按1%接菌量接種種子液，同上培養(yǎng)后根據(jù)24 h的OD值大小，確定初始pH值。

1.3.4 刺五加多糖最適添加量和合生元最適培養(yǎng)時間的確定在基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中加入不同比例的刺五加多糖，使其濃度分別為：0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.6、4.8、6.4、8、10 mg/mL。將每個濃度的培養(yǎng)基分裝入250 mL錐形瓶中，115℃滅菌20 min后，備用。按上述篩選的培養(yǎng)條件接種后放進恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h，分別在24、36、48 h采樣，用平板計數(shù)法測菌液的活菌數(shù)，顯微鏡下觀察芽孢產(chǎn)率，每組數(shù)據(jù)設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)菌液的活菌數(shù)和芽孢產(chǎn)率確定刺五加多糖的最適添加量及合生元最適培養(yǎng)時間。

1.3.5 刺五加多糖-枯草芽孢桿菌合生元產(chǎn)品的制備及活菌數(shù)的測定根據(jù)上述篩選的培養(yǎng)條件進行刺五加多糖-枯草芽孢桿菌發(fā)酵合生元的擴大培養(yǎng)。然后，將菌液用適量的麩皮吸附，45℃干燥成產(chǎn)品，用平板計數(shù)法測定產(chǎn)品的活菌數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)用Excel進行整理，作圖；用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析，差異顯著者進行Duncan’s多重比較。表中數(shù)值表示為“平均值±標準差”，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌24 h的生長曲線及種子液培養(yǎng)時間的確定從圖1可以看出，枯草芽孢桿菌生長到24 h時菌液OD值與前幾個小時相比變化很小，即枯草芽孢桿菌處于生長的穩(wěn)定期，此時菌液活菌數(shù)高，菌液濃度大，因此，24 h可以作為枯草芽孢桿菌種子液的培養(yǎng)時間。

圖1 枯草芽孢桿菌24 h的生長曲線

2.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速的篩選結(jié)果通過枯草芽孢桿菌在不同溫度、轉(zhuǎn)速條件下的24 h生長曲線（圖2）可以看出，該菌在37℃、170 r/min條件下生長良好，優(yōu)于在其他溫度、轉(zhuǎn)速組合下的生長情況，因此培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的最佳溫度、轉(zhuǎn)速組合為37℃、170 r/min。

圖2 枯草芽孢桿菌在不同溫度、轉(zhuǎn)速下的24 h生長曲線

2.3 接種量、裝液量、初始pH值的確定由表1可知，隨著接種量的提高，24 h菌液的OD值逐漸增大，接種量為4%的OD值顯著高于2%（P＜0.01），但與6%的OD值差異不顯著（P＜0.05），再從節(jié)省接種量方面考慮，確定4%為適宜的接種量。

表1 枯草芽孢桿菌在不同接種量下生長24 h的OD值

由表2可知，裝液量為50mL時菌液的OD值明顯高于100 mL時菌液的OD值，因此確定適宜的裝液量為50 mL。

表2 枯草芽孢桿菌在不同裝液量中生長24 h的OD值

由表3可知，枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基初始pH值為5.5～8.5時，隨著pH值的增大24 h菌液的OD值逐漸增大，pH值在7.0以后隨著pH值的增大，菌液的OD值反而降低。pH值為7.0時OD值極顯著高于pH值為6.5時的OD值（P＜0.01），與pH值為7.5的差異不顯著（P＜0.05），同時考慮節(jié)省酸堿用量，因此確定適宜的初始pH值為7.0。

表3 枯草芽孢桿菌在不同初始pH的培養(yǎng)基中生長24 h的OD值

2.4 刺五加多糖最適添加量和合生元最適培養(yǎng)時間的確定按1.3.4的試驗條件及步驟培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，分別在24、36、48 h采樣，平板計數(shù)法測活菌數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 枯草芽孢桿菌在不同刺五加多糖濃度和不同培養(yǎng)時間下的活菌數(shù)cfu/mL

由表4可知，低濃度刺五加多糖促進枯草芽孢桿菌生長，高濃度抑制其生長，刺五加多糖濃度為1.6 mg/mL時，生長36 h菌液中枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)最高，為3.3×109cfu/mL。

由顯微鏡下結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌在0 mg/mL的刺五加多糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h時幾乎無芽孢，在1.6 mg/mL刺五加多糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h時芽孢率在90%以上。

2.5 枯草芽孢桿菌合生元產(chǎn)品的制備及其活菌數(shù)的檢測把培養(yǎng)好的菌液按1 L菌液∶0.5 kg麩皮的比例用干燥細麩皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元。利用平板計數(shù)法對枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元活菌數(shù)進行檢測，結(jié)果為5×109cfu/g左右。

3 討論

3.1 本試驗篩選益生菌和益生元的依據(jù)合生發(fā)酵技術(shù)即通過添加特定的一種或者多種益生元為底物對益生菌進行發(fā)酵，從而顯著增強菌株活力，縮短菌株生長周期，提高菌體增殖速度；其中部分益生元被益生菌利用后轉(zhuǎn)化為寡糖等物質(zhì)，通過各自的代謝活動而有利于對方，從而更大化發(fā)揮合生元的潛力（潘寶海和孫東巖，2012）。合生元效果，首先取決于是否選了一個好菌種，再次取決于是否選對了與益生菌具有協(xié)同作用的益生元。為了確保本試驗研制的合生元產(chǎn)品的質(zhì)量效果，遵循菌種選擇原則，選擇了具有良好的益生功能，能在低pH和膽汁中存活并能植入腸黏膜，安全性好，耐高溫、高壓，易加工、貯存等優(yōu)良特性（翟玲，2009；劉文波，2000），且具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強動物免疫力、提高生產(chǎn)性能等諸多功能的枯草芽孢桿菌作為合生元的益生菌菌種。本課題組經(jīng)過前期摸索，尋找到了一種與枯草芽孢桿菌具有協(xié)同作用的中草藥提取物——刺五加多糖，最后通過合生發(fā)酵技術(shù)研制出枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元。

3.2 本試驗篩選發(fā)酵條件的依據(jù)合生元具有同時發(fā)揮益生菌與益生元的雙重作用的功能特點，一方面通過直接增加腸道有益菌數(shù)量來改善宿主腸道微生態(tài)平衡，達到宿主機體保健或疾病預(yù)防的目的；另一方面通過益生元促進有益菌增殖、增強動物對腸內(nèi)有害微生物的抑制作用及非特異性免疫功能來強化腸道固有有益菌的作用效果（王振國，2009）。本試驗為了提高枯草芽孢桿菌數(shù)量及活性，對實驗室條件下制約枯草芽孢桿菌生長的主要培養(yǎng)條件進行了篩選，通過繪制枯草芽孢桿菌24 h的生長曲線并比較24 h時菌液的OD值，確定了枯草芽孢桿菌適宜的培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min，接種量為4%，250 mL錐形瓶的裝液量為50 mL，培養(yǎng)基的初始pH值為7.0。篩選以上條件的依據(jù)如下：

首先，菌液的活菌數(shù)與菌液的OD值成一定的正相關(guān)關(guān)系。文宇婷（2012）研究表明，黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元菌液中的活菌數(shù)與其OD值（425 nm）呈良好的線性相關(guān)，標準曲線為y=465.321x-81.61，R2=0.948，用600 nm波長與425 nm波長測出的不同濃度的菌液OD值變化趨勢相同，但在600 nm波長下可以測更大濃度的菌液，因此我們通過比較600 nm下菌液的OD值來篩選枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件。

其次，溫度可以通過改變酶反應(yīng)速率來影響菌體的生長，溫度過低抑制酶促反應(yīng)速率及菌體代謝水平，溫度過高又會引起酶類失活，菌體迅速衰老，導(dǎo)致活菌數(shù)大幅度降低；搖床轉(zhuǎn)速不同對枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)也有影響，轉(zhuǎn)速可能與菌液與氧接觸頻率有關(guān)。搖床本身可以控制溫度、轉(zhuǎn)速兩個影響因素，因此本試驗設(shè)置30、34、37、40℃4個不同溫度值，120、170 r/min 2個不同轉(zhuǎn)速值，進行不同組合試驗，最后發(fā)現(xiàn)在37℃和170 r/min的組合下，枯草芽孢桿菌生長最好。

再次，接種量、裝液量和培養(yǎng)基初始pH值對枯草芽孢桿菌的生長都有一定的影響（張麗霞，2006）。接種量的多少與菌株生長周期的長短有關(guān)。接種量過低，延滯期變長，造成培養(yǎng)周期延長，耗費大量時間；接種量過高，細菌對營養(yǎng)成分的競爭力過大，造成菌體因營養(yǎng)供應(yīng)不足而提前死亡，同樣會抑制活菌數(shù)的增長，本試驗從菌液活菌數(shù)和節(jié)約種子液綜合考慮，選擇4%的接種量。裝液量的大小會影響搖瓶內(nèi)溶氧量的變化，本試驗在250 mL的錐形瓶中分別裝50 mL和100 mL的培養(yǎng)基進行比較，發(fā)現(xiàn)裝50 mL培養(yǎng)基的菌液濃度高，可能裝100 mL培養(yǎng)基的錐形瓶中的溶氧量相比裝50 mL培養(yǎng)基不能滿足枯草芽孢桿菌生長的需要。pH值通過影響菌體細胞膜電荷、膜滲透性以及營養(yǎng)物質(zhì)離子化的程度，而影響菌體對養(yǎng)分的吸收（張麗霞，2006）。由于搖瓶過程中的pH值難以控制，只能控制培養(yǎng)基的初始pH值。初始pH值的變化對于枯草芽孢桿菌生產(chǎn)發(fā)酵過程的影響非常顯著（黃秀梨和夏立秋，2000）。本試驗中枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基初始pH為5.5～8.5時，隨著pH的增大菌液OD值先增大后降低，趨勢與張媛媛等（2012）在復(fù)合益生菌芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及條件的優(yōu)化試驗中pH對復(fù)合益生菌芽孢桿菌生長影響一致。

最后，植物多糖對益生菌生長一般有低濃度促進、高濃度抑制的趨勢，為了提高刺五加多糖對枯草芽孢桿菌的促生長作用及減少浪費，試驗對刺五加多糖的添加量設(shè)置了10個不同濃度。結(jié)果表明，在0～10.0 mg/mL枯草芽孢桿菌活菌數(shù)隨著刺五加多糖的濃度的提高先增加后降低，添加量為1.6 mg/mL時，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)最高，這種活菌數(shù)隨著植物多糖添加量變化的趨勢與文宇婷（2012）和李樹鵬（2007）的報道一致。但在確定刺五加多糖的適宜添加量及合生元培養(yǎng)時間的依據(jù)上考慮到在實際生產(chǎn)中菌體形式的枯草芽孢桿菌產(chǎn)品活菌數(shù)下降的很快，因此以枯草芽孢桿菌活菌數(shù)和芽胞產(chǎn)率作為篩選合生元最佳培養(yǎng)時間的條件。結(jié)果表明，36 h時活菌數(shù)最高，芽胞產(chǎn)率達到了90%以上。

根據(jù)研究的菌種生物學(xué)特性，有針對地采用加工技術(shù)生產(chǎn)合生元制劑，防止產(chǎn)品失活、變質(zhì)并使生產(chǎn)成本最低化，是生產(chǎn)過程中應(yīng)考慮的重要問題之一（劉洪明，2009）。鑒于枯草芽孢桿菌對營養(yǎng)條件要求不高、耐受低pH值、不容易失活的特性，本試驗將發(fā)酵好的菌液以細麩皮作為載體進行吸附后在45℃烘干制成干燥的細粉狀產(chǎn)品，并聞到類似乳酸菌發(fā)酵制品典型的味道，符合對益生菌制劑產(chǎn)品的性狀檢測方面的要求（張日俊，2010）。另外，我國正式批準生產(chǎn)的微生物制劑中，對芽孢桿菌含菌量的規(guī)定為：5×108cfu/g（張日俊，2007）。本試驗枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元的活菌數(shù)大約為5×109cfu/g，并且雜菌很少，完全達到了國家對微生物制劑含菌量的要求，可以說本產(chǎn)品加工工藝簡單、科學(xué)，易于推廣。

4 小結(jié)

在本試驗條件下，研制出了一種枯草芽孢桿菌-刺五加多糖發(fā)酵合生元，其制備參數(shù)為：種子液的培養(yǎng)時間為24 h，溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，接種量為4%，250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，刺五加多糖的添加量為1.6 mg/mL，合生元培養(yǎng)時間為36 h?？莶菅挎邨U菌-刺五加多糖合生元產(chǎn)品活菌數(shù)為5×109cfu/g左右。

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This experiment aimed to study the preparation of a kind of Bacillus subtilis-Acanthopanax polysaccharide synbiotics and optimize its preparation technology.A 4×2 factorial experiment design was used to selecte the appropriate temperature（30，34，37，40℃）and speed（120 r/min and 170 r/min）；Inoculation amount（1%，2%，4%，6%，8%），fluid volume（50，100 mL）and the initial pH value（5.5，6，6.5，7，7.5，8,8.5）was optimized by single factor experiment.According tomicrobialnumberoflivingbacteriumandsporeproductionrate，theacanthopanaxpolysaccharidecontent（0，0.4，0.8，1.6，2.4，3.6，4.8，6.4，8，10 mg/mL）and synbiotics incubation time（24，48，36 h）was determined.The results showed that the incubation time of seeds of liquid was 24 h，suitable temperature and speed was 37℃and 170 r/min，inoculation amount was 4%，250 mL conical flask containing fluid amounted to 50 mL，medium initial pH value was 7.0.A-canthopanax polysaccharide content was 1.6 mg/mL，synbiotics incubation time was 36 h.After incubation，bacterial liquid was adsorpted with the fine bran according to the proportion（1 L bacteria liquid∶0.5 kg bran）bran and baked in the oven at 45℃，plate count method was used to test the product on the number of living bacterium.The number of living bacterium of Bacillus subtilis-Acanthopanax polysaccharide synbiotics product was about 5×109cfu/g.

Bacillus subtilis；Acanthopanax polysaccharide；synbiotics；preparation

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161707

S816.3

A

1004-3314（2016）17-0023-04

河北省蛋雞體系（1004022）

*通訊作者