田朝暉，張 彪

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京海淀100083）

添加劑

板藍根、黃芪和青蒿提取物抗PRRSV作用比較

田朝暉1*，張 彪2

（1.呼倫貝爾職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京海淀100083）

本試驗對板藍根、黃芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的作用機制進行研究。采用光學(xué)顯微鏡觀察各細胞株形態(tài)上的變化，同時根據(jù)試驗收集到的不同中草藥提取物在不同濃度下（1、2、4、6 μg/mL）的細胞保護率，采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。分析結(jié)果表明：不同濃度的中草藥提取物抑制PRRSV所導(dǎo)致的細胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好。同時，不同的中草藥提取物對PRRSV的抑制效果也存在顯著差異，板藍根提取物具有一定的減少病毒造成細胞病變的作用，而青蒿素提取物保護細胞的能力效果最佳，有效降低PRRS病毒復(fù)制與抑制病毒導(dǎo)致細胞變性效果，阻斷病毒的復(fù)制以降低感染的機會。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；板藍根；黃芪；青蒿素；提取物；抑制

豬生殖與呼吸綜合征（PRRS）為一種豬群的新興疾?。ê返?，2016），其致病源PRRSV屬于具封套的單股正鏈RNA病毒，病毒大小50～65nm，基因體大小約15.1 kb，屬于動脈病毒科，在臨床病癥上除了同時期的豬只會有呼吸道疾病發(fā)生外，對于懷孕母豬，更會有流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒木乃伊化。感染后幸存的豬只也常常會引起二次感染，造成養(yǎng)豬業(yè)重大的損失。我國于2006年6月開始暴發(fā)高致病性豬生殖與呼吸綜合征，豬的發(fā)病率達100%，死亡率為25%～50%（徐麗華等，2015）。我國的高致病性豬生殖與呼吸綜合癥臨床征狀包括高燒40～42℃、呼吸促迫、呼吸困難以及紅斑性皮疹等。目前PRRSV已有商品化疫苗的上市，但是疫苗的保護力度不夠，所以PRRSV至今還在全球肆虐（王君瑋，2014）。

目前有少數(shù)商品化的減毒疫苗，此外也有數(shù)種不同的試驗性DNA疫苗或是以桿狀病毒、腺病毒、偽狂犬病病毒、腸炎弧菌作為載體所發(fā)展的PRRSV單位疫苗（肖珊珊，2013），但由于PRRSV本身在宿主所誘發(fā)的免疫反應(yīng)極為復(fù)雜，加上其本身又具有規(guī)避宿主免疫系統(tǒng)捕捉的機制，導(dǎo)致發(fā)展有效對抗該病的疫苗仍具有一定難度（劉依，2012）。國內(nèi)有部分學(xué)者從我國傳統(tǒng)的中草藥入手，研究對抗PRRSV的抗體，這些抗病毒藥物大部分為平時常見的清熱解毒類中草藥，研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物中包含的板藍根、黃芪等對PRRSV具有一定的抗病毒作用（楊帆等，2014，王麗萍等，2013，秦華珍等，2012）。為此，本試驗展開進一步研究，針對板藍根、黃芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗PRRSV的作用機制，并對抗PRRSV效果對比分析。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒PRSSV相關(guān)的病毒細胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)專業(yè)醫(yī)學(xué)實驗室保留。

1.2 板藍根、黃紙、青蒿素等中草藥活性成分的提取

1.2.1 板藍根多糖的提取將干燥板藍根用閉式提取器處理，所得提取液先用武火加熱，沸騰后文火加熱0.5～1 h，紗布過濾；藥渣加10～20倍水煎煮兩次，合并紗布過濾以及兩次水煎煮的藥液，離心、過濾、濾液濃縮至19 mL；緩緩向上述液體中加入90%乙醇至乙醇濃度為55%～65%，冷藏8～9 h，2000～4000 r/min離心15～25 min后倒去上清液，沉淀用去離子水溶解至原體積，用乙醇沉淀2次，乙醇濃度分別為65%～75%、75%～85%，沉淀用去離子水溶解至原體積，加入1/4～1/6體積8%～12%的三氯乙酸溶液充分混勻后靜置3～5 min，2000～4000 r/min離心15～25 min后去沉淀得上清液，將既得上清液抽濾，烘干，即可得板藍根多糖。

1.2.2 黃芪多糖的提取選擇晾干的黃芪，粉碎后過40～80目篩，得黃芪粉，在黃芪粉中加水?dāng)嚢杈鶆?，黃芪粉與水的重量比例為1∶5～1∶10，在水中浸泡8～16 h，加入纖維素酶，纖維素酶的添加量為0.5%～0.9%、酶解溫度45℃、pH值5，將上述原料置于超聲波提取設(shè)備中提取，聲波的功率為400～600 W，頻率為800 Hz，酶解0.1～0.5 h；再加入堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，堿性蛋白酶的加入量為0.2%～0.6%，菠蘿蛋白酶的加入量為0.2%～0.5%，酶解溫度50℃、pH值為6.8～7.5，將上述原料置于微波提取設(shè)備中提取，微波的功率為400～600 W，頻率為80 Hz，酶解0.1～0.5 h，酶解后在100～105℃下滅酶5～10 min，得酶解液。將上述的酶解液置于真空濃縮器中濃縮，減壓低溫濃縮酶解液至原體積的1/3，得黃芪粗多糖濃縮液。在黃芪粗多糖的濃縮液中加入活性炭，活性炭占黃芪粗多糖濃縮液重量的2%～6%，攪拌0.2～0.5 h，過濾濾出活性炭，繼續(xù)離心10～20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 r/min，將上清液與沉淀分別收集，取上清液過濾去渣，過濾后得到的濾液在60～70℃下濃縮，濃縮至其濃度為60%～70%，濃縮液按1∶4的比例加入95%乙醇，沉淀靜置10～20 h，離心10～20 min，離心轉(zhuǎn)速為4500 r/min，收集沉淀并用乙醇反復(fù)清洗2～3次，冷凍干燥至含量為4%～6%后，再在-1～4℃下進行粉碎，得可溶性多糖。上述加酶量均為酶占超散粉碎后黃芪重量百分比。

1.2.3 青蒿素液配制將青蒿原料粉碎，過10～80目篩，按照固液比1∶5～1∶70（m/V）加入咪唑類離子液體鹵化物鹽和水的混合液，在超聲功率1～100 W/cm2，超聲頻率20～80 kHz，溫度20～60℃條件下，提取5～60 min，經(jīng)液-固分離得到含青蒿素的提取液；將上一步得到的提取液按青蒿素提取液∶有機萃取劑比例為1∶1～20∶1（V/V）萃取1～5次，分離有機相得青蒿素萃取相，萃取相-離子液體循環(huán)使用；將得到的有機萃取相蒸發(fā)回收有機萃取劑后得青蒿素粗品；得到的青蒿素粗品再溶解，用柱層析重結(jié)晶進一步精制得高純度青蒿素；得到的離子液體萃取液循環(huán)使用2～8次后，加入大孔吸附樹脂攪拌吸附0.5～10 h，過濾或離心分離樹脂，得到再生的離子液體提取液。

1.3 中藥成分體外抗PRRSV效果的測定將PRRSV培養(yǎng)于96孔盤中（5×103cell/well)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼附于培養(yǎng)盤上，60%滿細胞剛好形成單層化，移除培養(yǎng)液，即可進行病毒效價測定。首先將待測PRRS病毒株以培養(yǎng)液10倍連續(xù)稀釋，使病毒稀釋為10-1～10-8濃度（100 L/well），每個稀釋倍數(shù)進行6次重復(fù)，培養(yǎng)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，3 d后以倒立顯微鏡觀察細胞病變效應(yīng)（CPE）現(xiàn)象，即細胞在感染病毒后產(chǎn)生剝落、變圓、萎縮等現(xiàn)象。以Reed-Muench法計算細胞所產(chǎn)生的CPE，由此可算出病毒的TCID50（能讓50%培養(yǎng)細胞產(chǎn)生CPE的病毒量）。下列公式為病毒評價的計算（王學(xué)兵等，2014）：

帶入不同稀釋倍數(shù)的病毒的數(shù)據(jù)，可得PRRSV的TCID50=10-4.336/0.1 mL。

1.4 細胞形態(tài)變化觀察板藍根、黃芪、青蒿素萃取物對于非洲綠猴腎臟細胞株（Marc-145）與豬肺泡巨噬細胞（PAM）形態(tài)變化觀察。以血球計數(shù)盤計數(shù)后將2×l06細胞培養(yǎng)于6 cm有蓋培養(yǎng)皿使細胞貼附，加入板藍根、黃芪、青蒿素萃取物，調(diào)整濃度分別為含1、2、4、6 μg/mL，分別處理各細胞株，培養(yǎng)時間為1 h，病毒評價為M.O.I=2的豬生殖與呼吸綜合癥病毒進行感染24 h，再以光學(xué)顯微鏡觀察各細胞株形態(tài)上的變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理及藥效評價根據(jù)試驗收集到的不同中草藥提取物濃度下的細胞保護率，采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，比較板藍根、黃芪、青蒿等中藥提取物的細胞保護率，從而對各中藥提取物的抗病毒效果進行評價。

2 結(jié)果

2.1 中草藥提取物處理并感染PRRSV對細胞形態(tài)的影響將Marc-145細胞以2×106的細胞數(shù)量培養(yǎng)在12孔細胞培養(yǎng)盤，當(dāng)細胞長到七分滿時分別加入1、2、4、6 μg/mL的板藍根、黃紙、青蒿素提取物，于37℃含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中作用1 h，再以病毒M.O.I=2攻毒細胞3 d，再經(jīng)由顯微鏡觀察細胞變化，主要表現(xiàn)為細胞折光性增加、變圓、黏連、破碎、脫落等狀態(tài)。

從細胞病變的結(jié)果中可以看到，不同濃度的中草藥提取物抑制PRRS病毒所導(dǎo)致的細胞變性效果有顯著差異，濃度越高，抑制效果越好，同時，不同的中草藥提取物對PRRS病毒的抑制效果也存在顯著差異，板藍根提取物具有一定的減少病毒造成細胞病變的現(xiàn)象，而青蒿素提取物保護細胞的能力效果最佳，有效降低PRRS病毒復(fù)制與抑制病毒導(dǎo)致細胞變性效果，阻斷病毒的復(fù)制以降低感染的機會。

2.2 中草藥提取物抗PRRSV的藥效結(jié)果對比由表1可見，三種中草藥提取物對PRRSV均有抑制作用，提取物的濃度越高，抑制作用越明顯，不同的中草藥提取物對PRRSV的抑制作用有明顯差距，其中青蒿素提取物對PRRSV的抑制作用最強，而板藍根的抑制作用一般，提取物濃度越低，不同中草藥之間的抑制作用差距越明顯。

表1 不同濃度中草藥提取物的體外抗PRRSV作用%

3 討論

許多中草藥具有提高自身免疫力的功效，因此，安全、高效、低毒的中草藥提取物日益被人們所關(guān)注?？茖W(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)多糖以及糖復(fù)合物在生物體中不但作為能源及構(gòu)成生物體的材料存在，而且它還存在于一切細胞膜結(jié)構(gòu)中，參與各類細胞的生命運動，具有多樣化的生物功能，如抗病毒、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗內(nèi)毒素、抗癌等作用（王學(xué)兵等，2012）。

板藍根為十字花植物菘藍的干燥根，是板藍根的主要來源。臨床常用中草藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，性寒，有清熱解毒，涼血利咽功能。用于溫毒發(fā)斑、舌絳紫暗、痄腮、爛喉丹痧、大頭瘟疫、丹毒、癰腫等癥。近年來研究證明板藍根多糖是板藍根提取物中含量較多、生物活性較強的一類物質(zhì)。板藍根多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能，對特異性免疫和非特異性免疫、體液免疫或細胞免疫具有一定的促進作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)板藍根提取物對抑制PRRSV有特殊的功效，板藍根多糖在濃度達到6 μg/mL以上時，對PRRSV的抑制作用可以達到70%以上，抑制效果明顯（張紅英等，2013）。

黃芪具有補氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌的功效。用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，癰疽難潰，久潰不斂，血虛萎黃，內(nèi)熱消渴?！侗窘?jīng)》記載：“主癰疽，久敗瘡，排膿止痛。補虛，小兒百病?！薄度杖A子本草》記載：“助氣壯筋骨，長肉補血黃芪多糖可顯著增強非特異性免疫功能和體液免疫功能，顯著增強動物巨噬細胞的吞噬功能，促進血清溶血素形成，提高空斑形成細胞的溶血功能和明顯的碳離廓清作用和明顯增加脾重量，黃芪多糖是一種干擾素誘導(dǎo)劑，其抗病毒原理：刺激巨噬細胞和T細胞的功能，使E環(huán)形成細胞數(shù)增加，誘生細胞因子，促進白細胞介素誘生，而使動物機體產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，從而達到抗病毒的目的。在本試驗中，黃芪多糖對PRRSV有明顯的抑制作用，在黃芪多糖的濃度達到6 μg/mL以上時，抑制率達到了75%以上，對PRRSV的抑制作用顯著，并且黃芪多糖在各個濃度下對PRRSV的抑制作用都優(yōu)于板藍根提取物。

青蒿（Artemisia annua L.）又稱黃花蒿，為菊科一年生草本植物，廣泛分布于我國各地。青蒿入藥最早見于馬王堆三號漢墓出土（公元前168年左右）的帛書《五十二病方》，后在《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等書中均有記載，青蒿含有多種揮發(fā)性和非揮發(fā)性藥用成分，其中揮發(fā)性成分主要為揮發(fā)油，非揮發(fā)性成分主要有青蒿素、青蒿甲素、乙素、丙素及青蒿酸、香豆素、黃酮、豆菌醇等（李青等，2008）。在本試驗中，青蒿素抑制PRRSV的作用最顯著，在各個濃度下都較顯著，當(dāng)青蒿素提取物的濃度達到6 μg/mL以上時，抑制率達到了85%以上，效果非常顯著，本研究進一步擴展了青蒿素的用途。

4 結(jié)論

本試驗對板藍根、黃芪的提取物以及青蒿素的萃取液抗PRRSV的作用機制進行研究，通過相關(guān)試驗比較抗PRRSV的效果，從試驗結(jié)果可以看出，三種中草藥提取物對PRRSV均有抑制作用，提取物的濃度越高，抑制作用越明顯，不同的中草藥提取物對PRRSV的抑制作用有明顯差異，其中青蒿素提取物對PRRSV的抑制作用最強，而板藍根的抑制作用一般，提取物濃度越低，不同中草藥之間的抑制作用差異越明顯。試驗的研究結(jié)果對治療和預(yù)防PRRSV有一定的參考價值。

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In this test，the action of radix，astragalus and artemisinin extract against porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）and their mechanism were studied.An optical microscope was used to observe morphological changes in each cell line，and according to test cytoprotective rate collected from different concentrations（1，2，4，6 μg/mL）of herbal extracts，SPSS18.0 statistical software was used for data polarity analysis.The results showed that：the different concentrations of herbal extracts inhibiting cell degeneration by PRRS virus caused a significant difference，the higher the concentration，the inhibitory effect was better.At the same time，the effect of different herbal extracts on PRRS virus inhibitory was significantly different，radix extract had a certain reduction in viral causing cytopathic phenomenon，and artemisinin extract had the best cells protection，reduced the PRRS virus replication and inhibition effect of the virus that caused the degeneration of cells,block viral replication in order to reduce the chance of infection.

PRRSV；radix；astragalus；artemisinin；extracts；inhibition

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161705

S852.65

A

1004-3314（2016）17-0016-04

*通訊作者