任世英，邵 奎，李 雯，張 威，劉 飛

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安223003；2.淮陰工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

任世英1，邵 奎1，李 雯1，張 威1，劉 飛2*

（1.淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安223003；2.淮陰工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

為了分離得到飼料用耐酸性α-淀粉酶的菌株，從食堂排污口取土樣，篩選到一株耐酸（pH=4）且產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，并對(duì)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、酶學(xué)性質(zhì)及產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明：菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，胞內(nèi)形成異染粒和PHB，接觸酶、淀粉水解、卵磷脂酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，反硝化試驗(yàn)、熒光色素呈陰性。根據(jù)菌體形態(tài)、菌落特征及部分生理生化特性，將其初步鑒定為芽孢桿菌屬，即Bacillus sp.SD-1。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)菌株的最適產(chǎn)酶溫度及pH進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)溫度為43℃，pH為4.5，發(fā)酵60 h，酸性α-淀粉酶活力達(dá)到74.6 U/mL。

耐酸性；a-淀粉酶產(chǎn)生菌；芽孢桿菌屬

酸性α-淀粉酶是指可在酸性條件下水解淀粉的酶，在低pH值條件下以隨機(jī)方式切斷淀粉分子內(nèi)的α-1，4糖苷鍵，水解產(chǎn)物為低聚糖、麥芽糖和糊精等（潘濤，2010；賀勝英等，2010）。酸性α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于酸性條件下淀粉原料的加工，如高麥芽糖漿的制備、發(fā)酵飲料和青貯飼料的生產(chǎn)、工業(yè)副產(chǎn)品的加工以及廢料的處理等（謝建華等，2011；劉雅琴等，2010）。目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中常用的淀粉酶為中溫、高溫以及堿性α-淀粉酶，其最適pH值在6.0～10.0，在酸性條件下，其酶活性明顯降低，甚至失去活性（吳茜茜，2012；李勃，2009）。隨著我國(guó)淀粉質(zhì)原料深加工工業(yè)的發(fā)展，工藝條件的不斷改變，一些淀粉原料深加工工藝需要在較低的pH條件下進(jìn)行。所以，開(kāi)發(fā)新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫（魏姍姍，2014；石方方，2012）。

自從1963年日本學(xué)者Yasuji Minoda發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以產(chǎn)生耐酸性α-淀粉酶后，人們對(duì)耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行了廣泛的研究，并相繼發(fā)現(xiàn)多種微生物如枯草桿菌、白曲霉、青霉、酵母菌均可產(chǎn)生耐酸性α-淀粉酶，但存在的主要問(wèn)題是所選菌株的產(chǎn)酶活力不高以及缺乏可靠的安全性（賀勝英等，2010；洪新，2010）。

本試驗(yàn)從食堂排污口土壤中篩選出耐酸α-淀粉酶產(chǎn)生菌，并對(duì)其生長(zhǎng)特性、生理生化特性進(jìn)行研究，最后進(jìn)行菌種鑒定，為耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的研究提供新材料，為其在飼料工業(yè)中的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源菌株來(lái)自食堂排污口表層土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，可溶性淀粉2%，pH=4。

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.5%，蛋白胨1.0%，CaCl2·6H2O 0.02%，MnSO40.01%，KH2PO40.05%，MgSO40.03%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，pH=4。

1.2 方法

1.2.1 篩選方法取食堂排污口表層土樣，稱(chēng)取樣品10 g置于裝有90 mL無(wú)菌水及數(shù)顆無(wú)菌玻璃珠的三角瓶中，劇烈振蕩10 min，使樣品顆粒分散均勻，靜置5 min，取懸液1 mL置于滅菌平板，倒入約25 mL篩選培養(yǎng)基并搖晃均勻，凝固后置入37℃恒溫箱培養(yǎng)。菌體生長(zhǎng)后，挑取透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值較大的菌落進(jìn)一步分離純化。

1.2.2 酶活測(cè)定

1.2.2.1 粗酶液的制備將初篩得到的菌株接入種子培養(yǎng)基，37℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。種子培養(yǎng)液以10%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液4000 r/min離心10 min，上清液為粗酶液，取上清液測(cè)定耐酸性α-淀粉酶的活性（安弋等，2010）。

1.2.2.2 酶活測(cè)定方法1%的底物溶液：稱(chēng)取1 g可溶性淀粉，用少量pH=5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液溶解，然后加入到煮沸的該緩沖液中完全溶解，配制成1%、pH=5.0的淀粉底物溶液；0.005%的碘-碘化鉀溶液：稱(chēng)取0.25 g碘、2.5 g碘化鉀，用研缽研磨后用水溶解，定容至500 mL。

取10 mL的底物溶液放入一個(gè)試管中，50℃水浴保溫10 min后，加入粗酶液1 mL，混勻，精確保溫10 min，吸取0.5 mL混合液，加入盛有10 mL、0.1 mol/L的HCl的試管中，然后再取該混合液0.5 mL，加入盛有10 mL的碘液試管中搖勻，用分光光度計(jì)于660 nm下測(cè)定吸光值（李習(xí)等，2014）。對(duì)照管用同樣的方法測(cè)定，只是將粗酶液事先于沸水中煮10 min后再加入，以蒸餾水作為比色的參比。

酶活力定義：在上述條件下，反應(yīng)10 min使 1%淀粉溶液顯藍(lán)強(qiáng)度降低1%所需酶量為1個(gè)酶活力單位（U）（王彩瀾等，2012）。

式中：D0為空白值吸光度；D為主值吸光度；100為系數(shù)，%。

1.2.3 耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌株部分生理生化指標(biāo)鑒定參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》第八版測(cè)定。

1.2.4 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化菌株SD-1以2%接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基，分別在34、37、40、43、50℃，pH=4，180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清，測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性，以確定適宜產(chǎn)酶的發(fā)酵溫度。

1.2.4.2 pH的優(yōu)化菌株SD-1以2%接種量接于pH=3.5、4、4.5、5、5.5的發(fā)酵培養(yǎng)基，在優(yōu)化好的培養(yǎng)溫度下，180 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清，測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性，以確定適宜的產(chǎn)酶pH。

1.2.5 耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌株的酶活曲線(xiàn)菌株SD-1以2%接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基，在優(yōu)化好的培養(yǎng)溫度和pH下，180 r/min培養(yǎng)，每10 h取樣，離心取上清，測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性，繪制產(chǎn)酶曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及部分生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果將菌株SD-1稀釋涂布篩選平板，置于24℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，觀察其菌落形態(tài)。菌落呈淺黃色，正反面顏色相同，大小為5～20 mm，表面光滑濕潤(rùn)，圓形，邊緣整齊，形成明顯的透明圈，從側(cè)面看沒(méi)有丘狀突起，其部分生理生化特性見(jiàn)表1。

表1 菌株SD-1部分生理生化特性鑒定結(jié)果

2.2 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 不同培養(yǎng)溫度的影響由圖1可見(jiàn)，在培養(yǎng)溫度為43℃時(shí)，相對(duì)酶活較高，達(dá)到78%，所以確定菌株的較適培養(yǎng)溫度為43℃。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株SD-1產(chǎn)酶活性的影響

2.2.2 pH的影響菌株SD-1接種于pH 3.5、4、4.5、5、5.5發(fā)酵培養(yǎng)基，在43℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后離心取上清，測(cè)定吸光度值，計(jì)算酶活性，結(jié)果如圖2所示。在pH為4.5時(shí)，相對(duì)酶活較高，達(dá)到75%，所以確定菌株的較適pH為4.5。

圖2 不同pH值對(duì)菌株SD-1產(chǎn)酶活性的影響

2.3 耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌株SD-1的酶活曲線(xiàn)由圖3可見(jiàn)，該菌株在60 h時(shí)，發(fā)酵液中酶活力達(dá)到74.6 U/mL，相對(duì)酶活達(dá)到最高81%，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力逐漸降低。

圖3 菌株SD-1的酶活曲線(xiàn)

3 討論

芽孢桿菌屬于益生菌，被研制成各種形式的飼料級(jí)微生態(tài)制劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，其中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）應(yīng)用最廣泛，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，具有耐高溫、能形成芽孢、穩(wěn)定性強(qiáng)及產(chǎn)酶能力強(qiáng)等特點(diǎn)（劉明超，2015）。動(dòng)物攝入芽孢桿菌后，在胃腸道特定部位黏附，定植及生長(zhǎng)，在一定程度上對(duì)病原微生物起到抑制作用，促進(jìn)胃腸道微生態(tài)平衡，從而利于動(dòng)物健康生長(zhǎng)。芽孢桿菌能產(chǎn)生多種動(dòng)物自身都不能產(chǎn)生的酶類(lèi)，說(shuō)明其作為微生態(tài)制劑具有巨大的潛力。如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌均具有較強(qiáng)的分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及許多能夠分解復(fù)雜的碳水化合物的酶，這些酶能夠降解植物性有機(jī)化合物，同時(shí)可以降解蛋白質(zhì)、甘油三酯、淀粉、果膠等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高畜禽對(duì)有機(jī)物的利用率（姜芬，2016）。本試驗(yàn)篩選到的芽孢桿菌對(duì)酸有很好的耐受性，粗提a-淀粉酶的活性也較高，菌株對(duì)溫度的耐受性也較高，需進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行改造，提高酶的活性，同時(shí)分離純化酶，對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和特性進(jìn)行研究，以期能在飼料工業(yè)得到廣泛應(yīng)用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)篩出一株耐酸性a-淀粉酶產(chǎn)生菌株，即Bacillus sp.SD-1，其最適產(chǎn)酶pH為4.5，最適產(chǎn)酶培養(yǎng)溫度為43℃，該研究為今后淀粉酶的分離純化提供了重要依據(jù)，后期需對(duì)該菌所產(chǎn)a-淀粉酶的特性進(jìn)行研究，以實(shí)現(xiàn)其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用。

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In order to obtain acid resistant strains producing α-amylase for the application in feed industrial field. Clear circle was used to initially screen desired strains at pH 4.SD-1 was chosen as experimental strain owning to its higher ratio of dissolving circle diameter to colony diameter.Strain SD-1 was rod，G+.Test results of metachromatic granule staining，PHB，catalase，amylolysis，lecithinase were positive.Test results of denitrification and fluorchrome were negative. According to its cell and colony morphology，physiological and biochemical properties，strain SD-1 belongs to genus Bacillus，namely Bacillus sp.SD-1.Optimization of higher α-amylase production conditions：43℃，pH 4.5，fermentation for 60 h，the activity of α-amylase was up to 74.6 U/mL.

acid resistant；bacterium-producing α-amylase；Bacillus

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161703

S816.6

A

1004-3314（2016）17-0010-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（51308245）；江蘇省淮安市科技計(jì)劃項(xiàng)目（HAN2015026）；江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過(guò)程集成工程實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（JPELBCPL2013004和JPELBCPL2014006）

*通訊作者